成年小鼠指端截肢与再生：研究哺乳动物芽基形成和膜内成骨的简易模型

摘要

本文介绍了一种成年小鼠末节指骨截肢的实验方案，用于研究哺乳动物芽基形成及膜内成骨过程，通过荧光免疫组织化学和连续活体显微计算机断层扫描进行分析。

摘要

本文介绍了一种成年小鼠末节指骨远端（P3）截肢的实验方案，这是一种操作简便且可重复的哺乳动物表观再生模型，涉及通过荧光免疫组织化学和连续活体显微计算机断层扫描（μCT）分析芽基形成及膜内成骨过程。哺乳动物的再生能力仅限于末节指骨远端区域（P3）的截肢；在更近端水平截肢的趾则无法再生，而是发生纤维化愈合并形成瘢痕。再生反应由增殖性芽基的形成介导，随后通过膜内成骨实现骨组织再生，以恢复被截除的骨骼长度。P3截肢是一种用于研究哺乳动物表观再生的临床前模型，也是设计治疗策略以成功再生替代纤维化愈合的强大工具。本方案采用荧光免疫组织化学方法：1）鉴定早期和晚期芽基细胞群体；2）在再生背景下研究再血管化过程；3）无需复杂骨稳定装置即可研究膜内成骨。我们还展示了连续活体μCT的应用，可生成高分辨率图像以观察截肢后的形态学变化，并在同一趾上量化再生过程中体积和长度的变化。我们认为该方案在研究哺乳动物的表观再生及组织再生反应方面具有重要应用价值。

引言

包括人类和小鼠在内的哺乳动物，在末节指骨（P3）远端截肢后，具有再生指尖的能力^1,2,3。在小鼠中，再生反应依赖于截肢水平；随着截肢位置向近端延伸，再生能力逐渐减弱，直至在横切P3指甲基质及更近端的截肢处完全丧失再生能力^4,5,6,7,8。P3的再生由芽基的形成介导，芽基定义为一群增殖细胞，通过形态发生过程再生被截除的结构⁹。通过形成芽基来再生因截肢而丢失的结构，这一过程称为表形态再生（epimorphic regeneration），它将多组织水平的P3再生反应与传统损伤后的组织修复区分开来^6,10。P3再生是一种可重复且操作简便的模型，可用于研究包括伤口愈合^11,

方案

所有动物使用和操作技术均符合德克萨斯农工大学机构动物照护与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M University）的标准操作规程。&M 大学

1. 成年小鼠后肢远端P3截肢

1. 使用氧气中的异氟烷气体麻醉8至12周龄的CD-1小鼠（材料表）；最初在麻醉舱中以3%浓度诱导麻醉，随后通过鼻罩持续给予2%异氟烷以维持手术期间的麻醉状态。在麻醉期间，于眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。
   注意：本实验室建立的成年P3截肢研究模型使用8至12周龄的小鼠，且再生反应在所有测试品系中均保持一致。
2. 在10倍解剖显微镜下，用外科碘伏和70%乙醇对后肢脚趾进行消毒。使用显微剪刀修剪手术区域周围的毛发。在手术部位局部涂抹1 µL表面利多卡因以进行局部麻醉。
3. 使用无菌#10手术刀对每只后肢的第2和第4脚趾末节指骨（P3）远端尖端进行截肢（图1A）。截肢操作必须在无菌条件下进行，包括手术器械的灭菌。在解剖显微镜下，轻轻展开后肢足垫以暴露脚趾内侧表面。持刀角度应与脂肪垫平行，以完成如图1B所示的截肢操作。 在截肢部位涂抹1 µL表面利多卡因....

结果

对成年小鼠在截肢后第6/7天（图2A-D）、第9天（图2E-H）和第10天（图2I-L）的P3趾进行免疫染色，使用Runx2、OSX和PCNA抗体以观察膜内成骨再生过程，并使用CXCR4和vWF抗体以观察芽基形成。同时展示了在截肢前及再生过程中不同时间点扫描得到的代表性趾部μCT三维重建图像（图3A、B），以及用于确定长度测量的解剖标志点（图3B）。

讨论

本方案描述了一种标准化的成年小鼠远端P3指骨截肢操作流程，通过荧光免疫组织化学染色来可视化并研究芽基形成及膜内成骨过程，并结合连续的活体µCT扫描，以识别截肢后骨形态、体积和长度的变化。P3截肢是一种独特、操作简便且可重复性高的模型，可用于分析能够触发芽基形成的促再生性伤口微环境。此外，P3指骨模型相较于传统骨损伤模型，在研究膜内成骨方面具有多种优势。

为确保本实验方案的成功，必须完成足趾组织的完全脱钙。如果足趾未完全脱钙，在切片过程中组织将碎裂或撕裂。此外，加热修复免疫组织化学染色可能存在问题，组织可能会轻微脱离或完全从载玻片上脱落。为缓解此问题，应将样品置于添加了组织学黏附剂的水浴中贴附于防脱载玻片上，并在使用前将干燥的载玻片于65 °C下烘烤。最后，小鼠足趾相对较小，因此，为准确观察形态学结构并定量分析骨体积和长度的变化，µCT扫描必须具备足够的分辨率以在适当的扫描参数下运行。

该方法的一个局限性在于，并非所有一抗都适用于组织固定和石蜡包埋处理。在此情况下，可采用标准的冷冻组织切片技术，以确保一抗与其抗原结合能力的完整性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白封闭液，无血清	DAKO	X0909	即用型
小鼠抗PCNA抗体	Abcam	ab29	1:2000 稀释
大鼠抗CXCR4抗体	R&D Systems	MAB21651	1:500 稀释
兔抗人vWF XIII抗体	DAKO	A0082	1:800 稀释
兔抗osterix（SP7）抗体	Abcam	ab22552	1:400 稀释
兔抗Runx2抗体	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 稀释
Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）	Invitrogen	A21235	1:500 稀释
Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（H+L）	Invitrogen	A11008	1:500 稀释
Alexa Fluor 568标记的山羊抗大鼠IgG（H+L）	Invitrogen	A11077	1:500 稀释
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	即用型
Surgipath 脱钙剂 1	Leica Biosystems	3800400	即用型
Z-Fix，水性缓冲锌福尔马林固定液	Anatech LTD	174	即用型
CD-1雌性小鼠	Envigo	ICR(CD-1)	8–12周龄
vivaCT 40	SCANCO Medical