本文介绍了一种成年小鼠末节指骨截肢的实验方案，用于研究哺乳动物芽基形成及膜内成骨过程，通过荧光免疫组织化学和连续活体显微计算机断层扫描进行分析。
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摘要
摘要
本文介绍了一种成年小鼠末节指骨远端（P3）截肢的实验方案，这是一种操作简便且可重复的哺乳动物表观再生模型，涉及通过荧光免疫组织化学和连续活体显微计算机断层扫描（μCT）分析芽基形成及膜内成骨过程。哺乳动物的再生能力仅限于末节指骨远端区域（P3）的截肢；在更近端水平截肢的趾则无法再生，而是发生纤维化愈合并形成瘢痕。再生反应由增殖性芽基的形成介导，随后通过膜内成骨实现骨组织再生，以恢复被截除的骨骼长度。P3截肢是一种用于研究哺乳动物表观再生的临床前模型，也是设计治疗策略以成功再生替代纤维化愈合的强大工具。本方案采用荧光免疫组织化学方法：1）鉴定早期和晚期芽基细胞群体；2）在再生背景下研究再血管化过程；3）无需复杂骨稳定装置即可研究膜内成骨。我们还展示了连续活体μCT的应用，可生成高分辨率图像以观察截肢后的形态学变化，并在同一趾上量化再生过程中体积和长度的变化。我们认为该方案在研究哺乳动物的表观再生及组织再生反应方面具有重要应用价值。
引言
包括人类和小鼠在内的哺乳动物，在末节指骨（P3）远端截肢后，具有再生指尖的能力1,2,3。在小鼠中，再生反应依赖于截肢水平；随着截肢位置向近端延伸，再生能力逐渐减弱，直至在横切P3指甲基质及更近端的截肢处完全丧失再生能力4,5,6,7,8。P3的再生由芽基的形成介导，芽基定义为一群增殖细胞，通过形态发生过程再生被截除的结构9。通过形成芽基来再生因截肢而丢失的结构，这一过程称为表形态再生（epimorphic regeneration），它将多组织水平的P3再生反应与传统损伤后的组织修复区分开来6,10。P3再生是一种可重复且操作简便的模型，可用于研究包括伤口愈合11,12、骨组织溶解11,12、再血管化13、周围神经再生14以及通过膜内成骨实现芽基向骨组织转化15在内的复杂再生过程。
既往利用免疫组织化学的研究表明，芽基具有异质性、无血管、缺氧且高度增殖的特征11,13,15,16。在远端P3截肢后，早期芽基最初与P3骨膜和骨内膜相关联，并表现出靠近骨表面的显著增殖活性以及新生成骨现象15。在骨组织降解和伤口闭合之后，来源于骨膜和骨内膜的相关细胞相互融合，形成异质性的芽基，随后通过膜内成骨方式分化出包括骨组织在内的多种芽基组分15。
骨损伤后的修复通常通过软骨内成骨（endochondral ossification）实现，即首先形成软骨痂作为后续成骨的模板17,18。长骨的膜内成骨（intramembranous ossification），即不经过软骨中间阶段的成骨过程，通常需要借助复杂的牵张装置或手术固定来诱导19,20。指端再生反应是一种临床前模型，相较于传统的膜内成骨模型具有以下优势：1）损伤后无需外部或内部固定即可诱导膜内成骨；2）每只动物可提供4个指端用于实验，从而在减少动物使用数量的同时最大化样本量；3）可快速、便捷地进行连续的活体微型计算机断层扫描（μCT）分析。
在本研究中，我们展示了标准化的P3截肢平面，以获得可重复且稳健的再生反应。此外，我们介绍了一种优化的荧光免疫组织化学方案，利用石蜡切片来可视化再生过程中的芽基形成、血管再生成以及通过膜内成骨实现的芽基向骨组织转化。我们还展示了连续活体μCT技术的应用，用于检测同一趾部在再生过程中骨形态、体积和长度的变化。本方案的目标是研究哺乳动物在截肢后芽基的形成过程，并演示两种用于研究膜内成骨再生的技术：荧光免疫组织化学和连续活体μCT。
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方案
所有动物使用和操作技术均符合德克萨斯农工大学机构动物照护与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M University）的标准操作规程。&M 大学
1. 成年小鼠后肢远端P3截肢
- 使用氧气中的异氟烷气体麻醉8至12周龄的CD-1小鼠（材料表）；最初在麻醉舱中以3%浓度诱导麻醉，随后通过鼻罩持续给予2%异氟烷以维持手术期间的麻醉状态。在麻醉期间，于眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。
注意：本实验室建立的成年P3截肢研究模型使用8至12周龄的小鼠，且再生反应在所有测试品系中均保持一致。 - 在10倍解剖显微镜下，用外科碘伏和70%乙醇对后肢脚趾进行消毒。使用显微剪刀修剪手术区域周围的毛发。在手术部位局部涂抹1 µL表面利多卡因以进行局部麻醉。
- 使用无菌#10手术刀对每只后肢的第2和第4脚趾末节指骨（P3）远端尖端进行截肢（图1A）。截肢操作必须在无菌条件下进行，包括手术器械的灭菌。在解剖显微镜下，轻轻展开后肢足垫以暴露脚趾内侧表面。持刀角度应与脂肪垫平行，以完成如图1B所示的截肢操作。 在截肢部位涂抹1 µL表面利多卡因。
注意：截肢需横断指甲器官、真皮层、P3骨、血管和神经，但不应穿透骨髓腔或脚趾脂肪垫。若出现出血，应使用无菌棉签直接压迫止血。 - 标准的P3远端截肢平面可去除约15%–20%的P3骨体积21。可通过显微CT扫描（见下文）确认截肢长度是否正确。
- 将小鼠放回清洁笼具中，并让伤口在无敷料覆盖的情况下自然愈合。术后连续观察3天，确保小鼠恢复正常的活动状态。
2. 手指采集与组织制备
- 使用密闭室内的二氧化碳（CO2）对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
- 使用手术刀在相邻骨段中间位置切断脚趾，即在第二腹侧脂肪垫凹陷处附近切断中节指骨（P2骨）。将脚趾转移至含有10 mL新鲜缓冲锌福尔马林固定液（18%甲醛溶液）的20 mL闪烁瓶中（参见材料表）。固定液体积应至少为组织体积的20倍。
注意：为全面研究再生反应，需在截肢后的不同时间点采集脚趾样本。通常，为研究早期芽基形成、骨溶解和伤口闭合，采集时间点为截肢后4–8天（DPA）；为研究早期成骨性芽基，采集时间点为截肢后9天和10天（DPA）；为观察持续的骨再生和矿化过程，采集时间点为截肢后14天、21天和28天（DPA）。同时采集未截肢的脚趾作为对照。 - 在室温下，将脚趾置于固定液中固定24–48小时，并在摇床上轻柔振荡。
- 去除固定液，用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下洗涤脚趾2次，每次5分钟。
- 向闪烁瓶中加入10 mL新鲜的脱钙液I（参见材料表，即10%甲酸溶液），在室温下于摇床上轻柔振荡处理2小时。2小时后更换为新鲜脱钙液I，在室温下继续在摇床上轻柔振荡过夜脱钙。
- 去除脱钙液I，用5 mL 1× PBS在室温下洗涤脚趾2次，每次5分钟。
- 将脚趾依次通过梯度乙醇进行处理。若样本总数少于40个脚趾，可在20 mL闪烁瓶中手动操作，每种液体使用10 mL。
- 首先在新鲜的70%乙醇中浸洗2次，每次1小时，室温下在摇床上轻柔振荡；随后在新鲜的95%乙醇中浸洗2次，每次1小时，同样在室温下轻柔振荡。
- 最后用新鲜的100%乙醇洗涤2次以完成脱水，每次1小时，室温下在摇床上轻柔振荡。第二次100%乙醇洗涤可过夜放置。
- 在同一闪烁瓶中，将100%乙醇替换为10 mL新鲜二甲苯，并将瓶子置于化学通风橱中，室温下放置1.5小时。重复一次，使用新鲜二甲苯在化学通风橱中再处理1.5小时，共完成两次洗涤。
- 将二甲苯替换为熔化的液体石蜡（68 °C），将闪烁瓶置于68 °C恒温箱中浸润2小时，重复两次。经过总共4小时的石蜡浸润后，进行脚趾包埋，用于石蜡切片。
注意：组织学用脚趾处理也可使用自动组织处理仪，遵循上述相同步骤进行。 - 使用切片机将脚趾切成4–5 µm厚度的切片。将切下的样本置于载玻片上，使用38–41 °C水浴并添加组织学粘附剂溶液，以确保样本牢固附着于载玻片。将载玻片置于37 °C玻片加热台上干燥。
3. 成年小鼠指（趾）免疫组织化学染色以研究芽基形成与膜内成骨
- 将切片载玻片在 65 °C 下加热 45 分钟，随后在 37 °C 下加热不少于 15 分钟，以确保样本牢固附着于载玻片上。
- 使用二甲苯清洗两次，每次 5 分钟，再经梯度乙醇溶液水化，并浸入水中完成脱蜡和复水。将载玻片放入容量为 50–100 mL 的染色缸中，并始终浸没于 1× Tris 缓冲盐水配制的吐温 20 溶液（TBST）中。
注意：在整个染色过程中，切勿让样本干燥。在任何 TBST 步骤中，载玻片可孵育长达 2 小时。 - 准备一个保湿孵育盒。一个底部铺有湿润滤纸、深度约 1 英寸的带盖塑料载玻片盒即可满足要求。
- 为 Runx2、Osterix（OSX）和增殖细胞核抗原（PCNA）准备热修复溶液。针对早期成骨祖细胞标志物 Runx2 的抗原修复，配制 pH 8 的 1× Tris-EDTA 溶液；针对成骨细胞标志物 OSX，配制 pH 6 的 1× 枸橼酸缓冲液。PCNA 免疫染色可在上述任一溶液中进行。
- 为芽基标志物 CXCR422 和内皮细胞标志物冯·维勒布兰德因子 8（vWF）准备蛋白酶 K 抗原修复溶液：每张载玻片在微量离心管中加入 100 μL 蛋白酶 K 溶液，并加热至 37 °C（约 5 分钟）。
注意：Runx2、OSX 和 PCNA 的抗原修复采用加热修复法，而 CXCR4 和 vWF 的抗原修复则通过蛋白酶 K 处理完成。 - 对于需要加热修复的抗体，将载玻片浸入染色缸中的相应抗原修复液中，加热至 95 °C 并维持 25 分钟，注意避免沸腾。随后将染色缸从热源移开，在室温下冷却 35 分钟。
- 进行蛋白酶 K 抗原修复时，将载玻片平放于保湿孵育盒中，在每张载玻片上加 100 μL 预热的蛋白酶 K 溶液，并用一小条封口膜覆盖，防止干燥。在 37 °C 下孵育 12 分钟。
- 抗原修复后，在染色缸中用 1× TBST 溶液清洗载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
- 从染色缸中取出载玻片，放入保湿孵育盒中。在载玻片上滴加 6–7 滴封闭液（材料表），并用新鲜的封口膜覆盖，防止干燥。室温孵育 1 小时。
- 用抗体稀释液（材料表）稀释一抗，每种一抗溶液涡旋振荡 3 秒。来自不同宿主物种的一抗可混合使用。
注意：本研究中展示的免疫组织化学染色包括：Runx2（兔抗 Runx2 抗体，1:250 稀释，终浓度为 4 μg/mL）与 PCNA（单克隆鼠抗 PCNA 抗体，1:2,000 稀释，终浓度为 0.5 μg/mL）联合染色，以及 OSX（兔抗 OSX 抗体，1:400 稀释，终浓度为 0.125 μg/mL）与 PCNA 联合染色，结果见 图 2。本研究所用的鼠抗 PCNA 抗体具有高度特异性，无需额外封闭步骤。CXCR4（大鼠抗 CXCR4 抗体，1:500 稀释，终浓度为 2 μg/mL）和 vWF（兔抗人 vWF VIII 抗体，1:800 稀释，终浓度为 41.25 μg/mL）的免疫组织化学染色结果也见 图 2。所有一抗均经本实验室在本方案条件下优化和验证，具体信息列于 材料表 中。 - 小心移除封口膜，将载玻片轻轻在滤纸上沥干，去除多余封闭液。在每张载玻片上加 100–200 μL 一抗溶液，重新覆盖封口膜，放回保湿孵育盒中。在 4 °C 下于密闭保湿盒中孵育过夜。
注意：在沥干封闭液时，切勿让载玻片干燥。此步骤应迅速完成。 - 小心移除封口膜，轻轻沥去一抗溶液。将载玻片放入盛有新鲜 1× TBST 的染色缸中，用新鲜 1× TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 用抗体稀释液（材料表）稀释二抗，涡旋振荡 3 秒。来自不同物种、偶联不同荧光染料的二抗可混合使用。
注意：荧光二抗对光敏感。在 图 2 中，使用了以下二抗：Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG（H+L）用于 Runx2、OSX 和 vWF；Alexa Fluor 568 标记的山羊抗大鼠 IgG（H+L）用于 CXCR4；Alexa Fluor 647 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）用于 PCNA；均按 1:500 稀释，终浓度为 4 μg/mL。 - 在每张载玻片上加 200 μL 二抗溶液，覆盖新鲜封口膜，放回保湿孵育盒中。在室温下于密闭保湿盒中避光孵育 45 分钟。
- 小心移除封口膜，轻轻沥去二抗溶液。将载玻片放入盛有新鲜 1× TBST 的染色缸中，避光洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 配制核染液：将 20 μL DAPI（储备液为 5 mg/mL 的 H2O 溶液）加入 200 mL 的 1× PBS 中，剧烈震荡以确保均匀。将载玻片浸入 DAPI-PBS 溶液中 5 分钟，避光操作。
- 用 dH2O 洗涤载玻片 3 分钟。倒去水分，让载玻片自然风干，或轻轻吸去水分，注意在抽吸过程中不要扰动样本。避光操作。
- 使用 100 μL 抗荧光淬灭封片剂（材料表）小心地加盖盖玻片，封片过程中避免产生气泡。将载玻片平放，置于避光容器中，室温下静置过夜使封片剂完全干燥。封片剂干燥后，将载玻片平放于 4 °C 的避光容器中保存，直至观察使用。
注意：若封片后出现不可接受的气泡，可将已封片的载玻片轻轻浸入 1× PBS 中，取下盖玻片，再次用水冲洗并重新干燥后，可重新封片。
4. 显微镜观察与图像分析
注意：本实验使用配备3种荧光滤光片（用于观察Alexa Fluor 488、568和647 nm信号）以及DAPI（419 nm）的荧光去卷积显微镜及配套软件进行成像与分析。
- 以 10 倍放大倍数对切片成像，以捕获整个芽基区域。
注意： 增殖性成骨细胞一抗检测使用发射光谱无重叠的二抗（Alexa Fluor 488 和 647），以尽量减少共标记细胞的错误识别。可使用 568 nm 滤光片对自发荧光信号进行背景扣除，以确保 488 或 647 信号的准确性。芽基一抗检测使用 Alexa Fluor 488 或 568 标记的二抗。若使用 488 偶联抗体，可用 568 滤光片进行自发荧光背景扣除；若使用 568 偶联抗体，则可用 488 滤光片进行背景扣除。自发荧光信号通常与指甲板及指端红细胞相关，在 488、568 和 647 滤光片下均可观察到。
5. 体内顺序显微计算机断层扫描（μCT）
- 使用vivaCT 40对同一动物在截肢前1天（未截肢）、截肢后1天（1 DPA）以及直至截肢后28天（28 DPA）完全再生期间的各个时间点进行扫描，以再生指端材料表）在本实验中进行，并在下文展示 图3A.
- 在μCT上安装管路，以实现氧气流入和流出μCT动物舱，并确保出气端的氧气经过活性炭过滤器，以吸附异氟烷。
注意： 确保μCT动物舱密闭严实；这样在扫描过程中无需使用动物鼻罩即可向小鼠输送异氟烷。 - 准备μCT扫描参数。使用连续旋转模式，以每180°采集1000个投影，扫描体素大小为10.5 μm，扫描电压为55 kVp，电流为145 μA，积分时间为200 msec，每次扫描最多可获得213层切片。本实验中进行的扫描持续时间约为9分钟。降低电流可通过相应增加积分时间进行补偿，但会导致扫描时间延长。
- 使用异氟烷麻醉成年小鼠；首先在麻醉诱导舱中以3%异氟烷进行诱导麻醉，随后在扫描全程中通过µCT动物舱持续供给1.5%异氟烷维持麻醉。将小鼠轻柔地放置于µCT动物舱内，使其后肢脚趾并拢、平展、腹侧朝上，左爪位于左侧，右爪位于右侧，置于扫描平台上，然后用外科胶带轻轻固定脚趾位置。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。
- 将小鼠放回清洁的笼子，并监测至其完全清醒。此后每隔一周至每周对同一只小鼠进行连续扫描，以观察整个骨再生反应过程。
- 扫描完成后，需等待数小时以完成μCT图像的重建。使用μCT设备配套的软件将文件转换为一系列dicom文件；每个dicom文件对应扫描中的一个切片，因此，若扫描了213个切片，则将生成213个dicom文件并上传至公司服务器。
- 使用浏览器中的批量文件下载工具，将DICOM序列下载到单个文件夹中。
- 下载 BoneJ 插件23 并将文件拖入 ImageJ 插件文件夹中。在 ImageJ 中，通过将包含 DICOM 文件的文件夹拖放到 ImageJ 菜单栏，以图像栈形式打开该 DICOM 文件序列。系统将打开一个显示所有灰度值的 16 位图像栈。为仅显示骨组织，需进行图像阈值分割（我图像 > 调节 > 阈值).
注意： 查看ImageJ文件时，ImageJ的输出图像将呈现数字的倒置影像；即，当数字在扫描平台上腹侧朝上放置，左爪位于平台左侧、右爪位于右侧时，在ImageJ图像堆栈中显示的图像将为背侧朝上，右爪位于图像左侧，左爪位于图像右侧。 - 打开阈值对话框后，将对应于上限阈值的底部滑块移至最右侧，然后调节对应于下限阈值的顶部滑块，直至仅有骨组织呈红色高亮显示。当下限阈值的最大信号强度为32,767时，其数值范围大约为10,000–13,000。点击 应用，然后在新对话框中单击 黑色背景点击 好的.
- 将生成一幅显示黑白值的8位图像，其中白色对应骨骼。通过在P3骨骼周围绘制矩形框选中该骨骼，并复制图像栈。生成三维图像（插件 > 3D 查看器）。要裁剪图像中任何不必要的骨骼部分，请单击手绘选择工具，圈选要删除的骨骼区域。右键单击，然后选择 填充选区 删除骨骼。
注意： 上述步骤适用于 ImageJ 1.52h 和 Java 8，若使用不同版本的 ImageJ，操作可能略有差异。对于阈值设定，我们建议确定一个最优值，并在后续分析中始终使用该值。 - 使用 BoneJ 体积分数插件从三维重建中量化骨体积（插件 > BoneJ > 体积分数）。结果窗口将出现，骨体积（BV）将以 mm 为单位显示3.
- 使用 ImageJ 多点工具从三维重建图像中量化骨长度。
注意： 骨长度在P3再生过程中是动态变化的；在7至10天再生阶段（DPA），骨长度因破骨细胞介导的骨降解而减少11，随后在14至28天术后（DPA）进入远端骨骼再生阶段（图3B）。长度测量从P2/P3关节中心基部至远端骨尖端矿化最远点，但不包括已完全脱离的降解骨组织。图3BBoneJ 可实现对骨结构的完整三维评估；因此，骨扫描的角度不会影响长度测量的能力。 - 单击以捕获三维渲染图像 查看，拍摄快照，将图像保存为 tif 或 jpeg 文件。
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结果
对成年小鼠在截肢后第6/7天（图2A-D）、第9天（图2E-H）和第10天（图2I-L）的P3趾进行免疫染色，使用Runx2、OSX和PCNA抗体以观察膜内成骨再生过程，并使用CXCR4和vWF抗体以观察芽基形成。同时展示了在截肢前及再生过程中不同时间点扫描得到的代表性趾部μCT三维重建图像（图3A、B），以及用于确定长度测量的解剖标志点（图3B）。
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讨论
本方案描述了一种标准化的成年小鼠远端P3指骨截肢操作流程，通过荧光免疫组织化学染色来可视化并研究芽基形成及膜内成骨过程，并结合连续的活体µCT扫描，以识别截肢后骨形态、体积和长度的变化。P3截肢是一种独特、操作简便且可重复性高的模型，可用于分析能够触发芽基形成的促再生性伤口微环境。此外，P3指骨模型相较于传统骨损伤模型，在研究膜内成骨方面具有多种优势。
为确保本实验方案的成功，必须完成足趾组织的完全脱钙。如果足趾未完全脱钙，在切片过程中组织将碎裂或撕裂。此外，加热修复免疫组织化学染色可能存在问题，组织可能会轻微脱离或完全从载玻片上脱落。为缓解此问题，应将样品置于添加了组织学黏附剂的水浴中贴附于防脱载玻片上，并在使用前将干燥的载玻片于65 °C下烘烤。最后，小鼠足趾相对较小，因此，为准确观察形态学结构并定量分析骨体积和长度的变化，µCT扫描必须具备足够的分辨率以在适当的扫描参数下运行。
该方法的一个局限性在于，并非所有一抗都适用于组织固定和石蜡包埋处理。在此情况下，可采用标准的冷冻组织切片技术，以确保一抗与其抗原结合能力的完整性...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Muneoka实验室和德克萨斯基因组医学研究所（TIGM）的成员。本工作由德克萨斯A&M 大学
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白封闭液，无血清 | DAKO | X0909 | 即用型 |
| 小鼠抗PCNA抗体 | Abcam | ab29 | 1:2000 稀释 |
| 大鼠抗CXCR4抗体 | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 稀释 |
| 兔抗人vWF XIII抗体 | DAKO | A0082 | 1:800 稀释 |
| 兔抗osterix（SP7）抗体 | Abcam | ab22552 | 1:400 稀释 |
| 兔抗Runx2抗体 | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 稀释 |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | Invitrogen | A21235 | 1:500 稀释 |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | A11008 | 1:500 稀释 |
| Alexa Fluor 568标记的山羊抗大鼠IgG（H+L） | Invitrogen | A11077 | 1:500 稀释 |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | 即用型 |
| Surgipath 脱钙剂 1 | Leica Biosystems | 3800400 | 即用型 |
| Z-Fix，水性缓冲锌福尔马林固定液 | Anatech LTD | 174 | 即用型 |
| CD-1雌性小鼠 | Envigo | ICR(CD-1) | 8–12周龄 |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
参考文献
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