BK-多瘤病毒非编码控制区域驱动转录活性通过流细胞测定的测量

Summary

在本手稿中,提出了使用 HEK293T 细胞转染的基于 FACS 的 BK-多瘤病毒转录活性的测量方案,该细胞与表达 tdTomato 和 eGFP 的双向报告质粒转染。该方法进一步允许定量确定新化合物对病毒转录的影响。

Abstract

多瘤病毒,如BK-多马病毒(BKPyV),可引起免疫功能低下患者的严重疾病。然而,由于目前没有高效抗病毒药物,需要用测量潜在抗病毒药物影响的方法。在这里,一个双荧光报告器,允许分析BKPyV非编码控制区域(NCCR)驱动的早期和后期促进者活动,以量化潜在的抗病毒药物对病毒基因表达的影响,通过tdTomato和eGFP表达。此外,通过克隆BKPyV-NCCR增压,该议定书中从免疫功能低下的肾移植患者的血液衍生DNA中得到的,可以确定NCCR-重组对病毒基因表达的影响。在克隆患者衍生的氨基细胞后,HEK293T细胞与报告质粒转染,并用潜在的抗病毒剂进行治疗。随后,对细胞进行FACS分析,以测量转染后72小时的平均荧光强度。为了测试具有潜在细胞循环抑制作用的药物的分析,只使用转染的荧光细胞。由于这种测定是在大T抗原表达细胞中进行的,因此可以相互独立地分析早期和晚期表达的影响。

Introduction

聚瘤病毒代表一个独立的小双链DNA(dsDNA)病毒家族,以西米安病毒40(SV40)为原型物种。原发性感染主要发生在儿童期,通常无疾病症状,通常引起免疫宿主的潜在感染。BK-多瘤病毒(BKPyV)主要在肾小管细胞中持续存在,不会引起肾病,但是,在肾移植后免疫能力受损的情况下,病毒可以重新激活,并造成严重的损害和受损的移植物功能达到高病毒血症 (1 x 10⁴ BKPyV DNA 拷贝/mL)^{1,2 。}在大约10%的肾脏移植接受者中,BK-多瘤病毒(BKPyV)的重新激活导致多瘤病毒相关肾病(PyVAN),高达80%与肾异体移植失败的高风险相关3,4.由于没有经过批准的抗病毒药物,目前的治疗是基于减少免疫抑制。有趣的是,mTOR抑制剂似乎具有抗病毒作用;因此,将免疫抑制疗法切换到基于mTOR的免疫抑制可能是防止BKPyV病毒血症5、6、7进展的替代方法。然而,基于mTOR的抗病毒机制目前仍不完全了解。因此,需要测量潜在抗病毒药物在临床相关浓度中的影响的方法。

BKPyV的循环基因组包括大约5 kb,包含一个非编码控制区域(NCCR),作为复制的起源,并同时作为一个双向启动子,推动早期和晚期相mRNA转录的表达。由于自发发生的NCCR-重排、删除和复制在致病性BKPyV⁸中发现,并且明显累积在PVAN 5,⁹患者中,原型(wt)和重新排列 (rr) NCCR 活动有助于描述病毒复制性适应性。

如图1所概述,该协议描述了一种常用的方法,通过量化从报告质粒5表达的两种荧光团和eGFP的荧光来测量BKPyV NCCR转录^{活性。 9,10,11}.该程序在SV40大T抗原(lTAg)的存在下进行,它允许分析潜在的抗病毒药物对NCCR活性的早期和晚期的影响5。该测定进一步分析了重组对NCCR活动的影响,并与wt-NCCRs5、9进行了比较。记者将SV40晚聚光信号下行到每个荧光光片开放读取帧的下游,以确保分别对tdTomato和eGFP的两种转录本进行可比和高效的处理。与基于qRT-PCR的方法5,12相比,这种基于FACS的方法代表了低成本和高吞吐量兼容的替代方法,因为没有复杂的提取协议,感染细胞培养,没有昂贵的需要用于免疫荧光染色的抗体。此外,由于通过流式细胞测定分析定义的荧光细胞量,因此也可以定量分析细胞周期抑制剂。

Protocol

本议定书遵循杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会(14-6028-BO)批准的人类研究准则。

1. 采集血液或尿液样本,分离多瘤病毒DNA

1. 在EDTA管中采集至少3 mL的血液,或在采集管中收集尿液。
2. 将样品在2,500 x g下离心15分钟。如果需要,将等离子移液器放入新管中,将等离子样品储存在 4°C 下数天,或在 -20°C 冷冻,以延长存储时间。
3. 将40μL蛋白酶K制备到1.5 mL微离心管中,并通过移液加入400μL的血浆。
4. 通过加入400 μL的解液缓冲液,涡旋15秒,并在56°C孵育10分钟,使样品解毒。
5. 按照制造商说明中所述,使用 DNA 血液提取试剂盒分离 DNA。简单地说,添加酒精,并将酸胶加载到含有DNA结合硅基膜的旋转柱上。洗几次柱子,产生纯DNA。
6. 在30-50μL的TE缓冲液中释放产生的DNA。

2. 扩大非编码控制区域(NCCR)

1. 在物理分隔的房间中执行以下步骤。使用隔离室制备试剂并将混合物分配到 PCR 管中。
2. 使用引体对 A (表 1) 在总体积为 50 μL 时为预 PCR 准备主混合物,并使用步骤 1.6 中先前分离的 DNA。表2中打印了用于制备预和嵌套PCR主混合物的移液方案。
3. 将 45 μL 的主混合物分配到 PCR 管中。
4. 将5μL的分离DNA加入PCR管中。
   注:使用主混合准备室以外的房间,以避免污染。
5. 使用表 3所示的反应条件运行 PCR。在 35 个周期内重复变性、退火和延长。
6. 对于嵌套放大,使用引基对 B 为 AgeI 和 SpeI 提供限制位点(表 1)。
7. 使用预PCR的5μL,使用步骤2.2至2.5中所述的反应条件运行嵌套PCR。
8. 将 PCR 产物的 10 μL 与 2 μL 的 6x 凝胶加载染料混合。在1.5%的甘蔗凝胶上加载10μL的混合物,并在60 mA下运行凝胶30分钟。
9. 使用适当的紫外线记录系统可视化凝胶。
   注: 放大素的大小预计在 300-500 bp 之间,具体取决于是否发生重新排列(删除、插入或重复)(图 2C)。
10. 根据制造商的说明,使用 PCR 净化套件净化 PCR 放大器。在30 μL的洗脱缓冲液中洗脱PCR增脂剂。
11. 使用引物对 B 发送桑格测序的放大器。

3. 将NCCR克隆成双荧光报告器

1. 如表4所述,在37°C下用AgeI和SpeI消化纯化的安理拉放大器(步骤2.10)。
2. 重复步骤2.10并净化消化的放大器。
3. 同时,如表5所述,在37°C下,用AgeI和SpeI消化质粒主干(1.5μg)2小时。此步骤只需执行一次。对于后续反应,将消化冻结在-20°C。
4. 分析0.8%低熔胶胶上消化的质粒主干。
   注:请勿在电流高于 40 mA 时运行凝胶。垫段区域的预期插入物最初来自质粒 pEX-K4 2-LTR CD3¹³为 128 bp(图 2C)。
5. 使用长波紫外线(320 nm)可视化 DNA 片段,并使用干净的手术刀切断骨干带。将低熔凝胶片段转移到新的1.5 mL微离心管中。避免长时间的紫外线照射,以防止DNA损伤。
   注:由于使用低熔胶胶,因此没有必要在结扎前纯化DNA。
6. 在 65°C 下加热含有低熔胶的以解决胶片 10 分钟,以熔化凝胶片,并通过温和的涡旋每 2 分钟混合一次。熔化的凝胶可直接用于结扎。
7. 使用表6所示的方案,在16°C的夜间使用T4DNA联成酶对骨干和消化的放大素进行激光处理。
8. 使用热休克法对大肠杆菌进行转化,在LB-amp板上盘细菌,并在37°C下在夜间培养。
9. 第二天,选择三个阳性克隆,并准备一夜之间大肠杆菌培养物(5毫升LB-Amp)和37°C培养物。
10. 使用其他14处描述的标准协议分离质粒-DNA,执行AgeI和SpeI消化,以检查阳性克隆,并可视化1%胶合物上切出片段。垫段(128 bp)将被更大的NCCR序列(300-500 bp,见上文)所取代。
11. 使用引物EGFP-N或引物对B(表1)发送桑格测序的质粒。
12. 由于突变可能自发发生,因此将测序结果与与放大子获得的测序结果进行比较。仅使用包含与放大子相同的序列的克隆。
13. 使用分子工作台软件(例如,免费软件 GENtle 1.9.4 或其他序列编辑程序)来对齐和编辑获取的序列(图 3)。
14. 启动 GENtle 1.9.4,然后通过单击"导入"按钮(绿色向下箭头)导入 DNA 序列。
15. 下一步单击"工具"并从菜单中选择"对齐"(使用 Ctrl+G 作为快捷方式),然后选择进行对齐的 DNA 序列。
16. 单击"添加"或单击"删除"来删除序列,从而将序列添加到路线中。包括典型的NCCR共识序列,如JN192438^15,不要使用NCCR序列从常用的邓禄普应变16,因为它有重新排列和复制其他比原型BKPyV株。
    注: NCCR 已经包含平移启动通子 (图 3)。
17. 通过单击工具栏中的算法来选择对齐方法,然后选择 clustal W. 将对齐参数设置为匹配 2;间隙延伸惩罚 -1;间隙惩罚 -2,然后单击"确定"以运行对齐方式。

4. HEK293T细胞随报告质粒的瞬态转染及潜在抗病毒剂治疗

1. 为后续转染实验准备足够量的质粒DNA,可制备150 mL过夜培养。使用质粒分离试剂盒分离质粒DNA。或者,也可以使用其他质粒纯化试剂盒。
2. 种子 1 x 10⁵ HEK293T 细胞在 DMEM 中含有 10% FCS、青霉素和链霉素 (1x) 每孔 12 孔板 24 h 转染前 24 小时,并在 37°C 和 5% CO₂孵育过夜,以保持转染过程中的活性增殖。
   注:细胞在转染时应约80%的结对。
3. 将250 μL减少的血清介质放入无菌管中,加入1μg每个报告员质粒DNA,并通过移液轻轻混合。
4. 将3μL的转染试剂加入DNA混合物中,通过移液轻轻混合,孵育15分钟。 在使用前将转染试剂预热至22°C的环境温度,然后轻轻涡旋。
5. 将混合物滴到井中,轻轻分配到井中。
6. 4小时后,用含有测试剂和溶剂控制的新鲜介质替换上清液。在37°C孵育,直到分析。在此示例中,使用 mTOR 抑制剂 INK128 (100 纳克/mL) 和雷帕霉素 (100 纳克/mL)。

5. 荧光显微镜和流式细胞仪

1. 在荧光显微镜下检查细胞有无红色和绿色荧光(图4)。
   注:红色和绿色荧光分别对应于早期和晚期的BKPyV基因表达。
2. 转染后72小时后,吸出上清液,用1mL的冷PBS洗涤细胞两次。
3. 轻轻加入500 μL的胰蛋白酶,并稍微转动板,以避免细胞过早脱落。此步骤对于避免单元格双精度值非常重要。
4. 加后,使用相同的移液器尖端直接取出胰蛋白酶。
5. 在37°C下孵育细胞至少5分钟。
6. 用含有3%FCS的1mL的PBS重新悬浮胰蛋白酶化细胞,并在预先标记的FACS管中转移悬浮液。
7. 在 FACS 分析之前添加 DAPI (1 μg/mL)。
8. 使用流式细胞计分析细胞。对于每个样本,测量至少 10,000 个活细胞,这些活细胞对 DAPI 染色呈阴性。

6. 数据分析

1. 将数据导入流式细胞测定分析软件,并通过单击和拖动将样本添加到工作区。
2. 双击导入的文件并创建图形图。单击 x 轴和 y 轴,选择 FSC-A 与 SSC-A。通过单击工具栏上的多边形并构建单元格总体(图 5) 来打开主单元格总体。根据需要命名所选单元格群(例如"单个单元格")。"单个单元格"将显示为新工作区。
3. 继续对DAPI阴性(即"活细胞")进行"单细胞"的注控。要识别活细胞,可以比较有和没有DAPI染色的细胞群。在这两个图中选择 FSC-A 与太平洋蓝-A。
4. 单击矩形并选择 DAPI 负单元格总体,命名所选单元格群"活细胞",并创建一个新的点图,显示 FITC (eGFP) 与 PE (tdTomato)(tdTomato)(如前所述)。
5. 通过从工具栏中选择 Quad,在"活单元格"中添加象限。通过将象限的中心拖动到每个总体的边缘来对总体进行门控。象限表示 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM_, 3) eGFP_tdTOM-, 4) eGFP_tdTOM_。
   注:由于 FITC 和 PE 之间的发射光谱覆盖,初始补偿对于区分红色和绿色信号以及实现准确结果至关重要。
6. 通过右键单击象限并选择"添加统计信息"确定平均荧光强度 (MMIs)。选择"均值",然后单击"确定"。平均 MFI 现在显示在"统计"一节中的人口下方。象限 2 和 4 对应于早期表达式,而象限 3 和 4 表示延迟表达式。
7. 以相同的方式添加其他复制以增强统计能力。
8. 对于数据解释图,早期和后期的 MFI 值进入条形图:
9. 要比较从不同捐赠者或病毒株获得的 NCCR 活动,请添加典型对照或 Dunlop 菌株¹⁶并将其相对 MFI 设置为 100%,并计算相对 MFI 值。对每次复制重复上述步骤,并确定均值和标准偏差。
10. 要评估潜在化合物对转录活性的影响,将溶剂控制设置为100%,并绘制处理细胞的MFI。

Results

在具有代表性的实验中,通过流式细胞测定测量了BK-多瘤病毒非编码控制区驱动的转录活性。此外,一种mTOR抑制剂,可用于BKPyV重新激活后治疗患者,被测试为抑制病毒早期基因表达。为此,使用双荧光-报告器测定,如之前公布的5。实验设置的总体工作流程方案在F igure 1中进行了说明。首先,根据机构伦理委员会批准的人类研究指南,从免疫功能低下的肾脏移植患者身上采集血液样本。血液在含EDTA的管中采集,相位通过离心分离。随后,400 μL血浆用于分离多瘤病毒DNA。使用图2A所示的嵌套PCR协议放大了非编码控制区域(NCCR),使用外引基对BKV-CR-1fw和BKV-CR-1rv,以及内部引基对BKV-CR-2fw-AgeI(引基AAgeI)和BKV-CR-2rv-SpeI(引子SpeI)17,后者窝藏的AgeI和SpeI的限制网站。放大子验证是通过胶质...

Discussion

本文提出了一种常用的方法,用于分析BKPyV非编码控制区域(NCCR)驱动的早期和后期启动器活动。NCCR活性可以同时测量,不需要转染细胞的溶解。此外,可以分析相对大量的细胞,并且不需要共同转染额外的标记,以使荧光值正常化。

此方法的一个关键部分是,克隆的 NCCR 应包含与阿普利森测序所识别的完全相同的序列,该序列对应于患者血浆中存在的大多数变体。为了获得准确的结果并尽量减少容易发生PCR的错误,强烈建议使用具有校对活性的聚合酶。或者,序列可以由商业基因合成服务订购。可订购指定的 NCCR 序列,包括用于直接克隆的侧翼 AgeI 和 SpeI 限制位点。在这种情况下,从合成结构中消化与骨干质粒平行的质粒,用相应的NCCR片段替换垫片。DNA可以从尿液样本中分离出来。然而,由于BKPyV也由免疫能力个体分泌到尿液中,不一定反映活性复制,临床相关性有限。理想情况下,DNA也可以从肾脏活检中分离出来,在活检中,以前的PVAN可以组织学检测(与Korth等人比较,2019^年19)。

通...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp 分子量标准	NEB	N3231	任何范围不超过 1 kb 的分子量标准都可以替代
2 对数分子量标准	NEB	N0550	任何范围高达 10 kb 的分子量标准可以替代
脂-琼脂，神户	I Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
氨苄青霉素钠盐 Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	可以被任何制造商
BD FACSCanto&trade 替代;II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C相机模块	徕卡		任何相机均可使用
DMEM	Gibco	41966-029	由任何制造商替代
DMIL LED 显微镜	徕卡		任何荧光显微镜可用
DNA 血液小量试剂盒	Qiagen	51104	可替换为任何制造商
大肠杆菌 DH5alpha 感受态细胞	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	FBS 均可使用
FlowJo v10.5.3	FlowJo， LLC		任何流式细胞术软件 FBS 可用
凝胶上样染料，紫色 （6X）	NEB	B7024	任何 6x 负载染料都可以替代
HEK293T细胞	ATCC	11268	这些细胞组成型表达猿猴病毒 40 （SV40） 大 T 抗原，克隆 17 因其高转染性而被特别选择。
HERAcell® 240i CO2 培养箱	Thermo Scientific		可由任何制造商替代
HotStar PCR 试剂盒	Qiagen	203203
Intas 凝胶记录系统	Intas		任何用于含有琼脂糖凝胶的染色 DNA 的可视化系统
熔点琼脂糖	Biozym	850081	可由任何制造商替代
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	可被任何制造商的
pBKV （34-2）	ATCC	45025	质粒替代，该质粒含有 BKPyV 菌株 Dunlop 的全长基因组;用作阳性对照;DNA 测序附件：KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR 循环仪 MJ 迷你型 48 孔个人循环仪	Bio-Rad	停产产品	热循环仪均可使用
PCR 核苷酸混合物，10 mM	Promega	#C1145	可替换为任何制造商
PCR1 和 PCR2 引物	代谢	离子 不适用	脱盐。稀释至 （10 µM） 含 PCR 级水
PenStrep （100x）	Gibco	15140-122	可替换为任何制造商的
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	一种基于荧光的染料，用于测量 dsDNA 浓度
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA 连接酶	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
胰蛋白酶 0.05% - EDTA	Gibco	25300-054	可由任何制造商替代
ZymoPURE II 质粒试剂盒	Zymo	D4201	由任何制造商替代