本文提供了一种利用转染了双向报告质粒（表达tdTomato和eGFP）的HEK293T细胞，通过流式细胞术（FACS）检测BK多瘤病毒转录活性的实验方案。该方法还可用于定量评估新化合物对病毒转录的影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
多瘤病毒（如BK多瘤病毒，BKPyV）可在免疫功能低下患者中引起严重病理反应。然而，由于目前尚无高效抗病毒药物，因此亟需建立评估潜在抗病毒药物作用的方法。本文构建了一种双荧光报告系统，可通过tdTomato和eGFP的表达来定量分析由BKPyV非编码调控区（NCCR）驱动的早期和晚期启动子活性，从而评估潜在抗病毒药物对病毒基因表达的影响。此外，通过克隆BKPyV-NCCR扩增子（本方案中以免疫功能低下肾移植患者血液来源DNA为例获取），可进一步确定NCCR重排对病毒基因表达的影响。在完成患者来源扩增子的克隆后，将报告质粒转染至HEK293T细胞，并用潜在抗病毒药物处理。随后，在转染后72小时对细胞进行流式细胞术（FACS）分析，检测平均荧光强度。为同时检测可能具有细胞周期抑制作用的药物，仅分析已转染并呈现荧光的细胞。由于该检测在表达大T抗原的细胞中进行，因此可独立评估早期和晚期基因表达的影响。
引言
多瘤病毒科是一类独立的小型双链DNA（dsDNA）病毒，其中以猴病毒40（SV40）为原型种。初次感染主要发生在儿童时期，通常无临床症状，并在免疫功能正常的宿主中引起潜伏性感染。BK多瘤病毒（BKPyV）主要在肾小管细胞中持续存在，一般不会导致肾脏病理改变；然而，在肾移植后若出现免疫功能受损，病毒可能被重新激活，当病毒血症达到较高水平（1 × 104 BKPyV DNA拷贝/mL）时，可造成严重损害并影响移植物功能1,2。大约10%的肾移植受者会出现BK多瘤病毒（BKPyV）的再激活，进而导致多瘤病毒相关性肾病（PyVAN），该病症曾与高达80%的肾移植失败风险相关3,4。由于目前尚无获批的抗病毒药物，当前治疗主要依赖于降低免疫抑制强度。有趣的是，mTOR抑制剂似乎具有抗病毒作用；因此，将免疫抑制治疗方案转换为基于mTOR抑制剂的方案，可能是一种防止BKPyV病毒血症进展的替代策略5,6,7。然而，mTOR介导的抗病毒机制目前仍未完全阐明。因此，亟需建立能够评估潜在抗病毒药物在临床相关浓度下作....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案遵循由杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会批准的人类研究指南（编号：14-6028-BO）。
1. 血液或尿液样本的采集及多瘤病毒DNA的分离
- 使用EDTA管采集至少3 mL血液，或使用采集管收集尿液。
- 在2,500 x g条件下离心样品15分钟。如有需要，用移液器将血浆转移至新管中，血浆样品可在4 °C保存数天，或在-20 °C冷冻以长期保存。
- 在1.5 mL微量离心管中加入40 µL蛋白酶K，并用移液器加入400 µL血浆。
- 加入400 µL裂解缓冲液裂解样品，涡旋振荡15秒，然后在56 °C孵育10分钟。
- 按照制造商说明书，使用DNA血液提取试剂盒提取DNA。简而言之，加入酒精后将裂解物加载到含有基于二氧化硅的DNA结合膜的离心柱上。多次洗涤柱子以获得纯化的DNA。
- 用30–50 µL TE缓冲液洗脱所得DNA。
2. 非编码调控区（NCCR）的扩增
- 在物理隔离的不同房间内进行以下操作。使用独立的房间配制试剂，并将混合液分装至PCR管中。
- 使用引物对A（表1）配制预PCR的总反应体系为50 µL的主混合液（Master Mix），并使用步骤1.6中先前分离得到的DNA。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在本代表性实验中，通过流式细胞术检测了由BK多瘤病毒非编码调控区（NCCR）驱动的转录活性。此外，还测试了一种mTOR抑制剂对病毒早期基因表达的抑制作用，该抑制剂可能用于BKPyV再激活后患者的治疗。为此，采用了先前发表的双荧光报告基因检测方法5。实验设计的整体工作流程如Figure 1所示。首先，根据机构伦理委员会批准的人体研究指南，采集免疫功能低下肾移植患者的血液样本。血液采集至含EDTA的试管中，并通过离心分离各相。随后，取400 µL血浆用于分离多瘤病毒DNA。使用嵌套PCR方法扩增非编码调控区（NCCR），引物包括外侧引物对BKV-CR-1fw和BKV-CR-1rv，以及内侧引物对BKV-CR-2fw-AgeI（Primer AgeI）和BKV-CR-2rv-SpeI（Primer SpeI）17，其中内侧引物含有AgeI和SpeI限制性酶切位点，具体方案如F.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种常用方法，可用于分析由BK多瘤病毒非编码控制区（NCCR）驱动的早期和晚期启动子活性。该方法可同时检测NCCR活性，且无需裂解转染细胞。此外，可分析相对大量的细胞，且无需共转染额外的标记物以对荧光值进行归一化处理。
该方法的关键在于，克隆的NCCR序列必须与扩增子测序鉴定出的序列完全相同，即对应于患者血浆中存在的主要变异体。为了获得准确的结果并最大限度地减少PCR易错性，强烈建议使用具有校读活性的DNA聚合酶。或者，也可通过商业基因合成服务订购相应序列。可订购包含侧翼AgeI和SpeI限制性酶切位点的指定NCCR序列，以便直接克隆。在此情况下，将质粒与骨架质粒同时进行酶切，并用合成构建体中的相应NCCR片段替换间隔插入片段。DNA也可从尿液样本中分离获得。然而，由于BKPyV亦可由免疫功能正常的个体分泌至尿液中，未必反映病毒的活跃复制，因此其临床相关性有限。理想情况下，DNA还可从既往经组织学检测发现PVAN的肾活检样本中提取（参见Korth等，201919）。
通.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
Johannes Korth 收到了来自 Astellas 和 Novartis 的演讲费和差旅费资助。Marek Widera 收到了来自 Novartis 的咨询费。Oliver Witzke 收到了来自 Amgen、Alexion、Astellas、Basilea、Biotest、Bristol-Myers-Squibb、Correvio、Chiesi、Gilead、Hexal、Janssen、Dr. F. Köhler Chemie、MSD、Novartis、Roche、Pfizer、Sanofi 和 TEVA 的临床研究资助、演讲费、酬金及差旅费。
致谢
作者感谢Barbara Bleekmann提供的出色技术协助。本研究得到了杜伊斯堡-埃森大学医学院IFORES项目以及鲁尔大学联盟和鲁尔梅尔卡托研究中⼼（MERCUR）RIMUR项目的资助。作者感谢Jürgen-Manchot-Stiftung为Helene Sertznig提供的博士奖学金及持续支持。患者样本的收集和使用已获得杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会的批准（编号：14-6028-BO）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 bp DNA标准品 | NEB | N3231 | 可使用任何范围达1 kb的DNA标准品替代 |
| 2-log DNA标准品 | NEB | N0550 | 可使用任何范围达10 kb的DNA标准品替代 |
| 琼脂粉，Kobe I型 | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF限制性内切酶 | NEB | R3552 | |
| 氨苄青霉素钠盐 Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| 注射用水 | Bbraun | 2351744 | 可由任意厂家产品替代 |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C相机模块 | Leica | 可使用任意相机 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 41966-029 | 可由任意厂家产品替代 |
| DMIL LED荧光显微镜 | Leica | 可使用任意荧光显微镜 | |
| DNA血液小型提取试剂盒 | Qiagen | 51104 | 可由任意厂家产品替代 |
| E.coli DH5alpha感受态细胞 | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior胎牛血清 | MerckMillipore | 50615 | 可使用任意胎牛血清 |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | 可使用任意流式细胞术分析软件 | |
| 上样缓冲液，紫色（6X） | NEB | B7024 | 可使用任意6x上样缓冲液替代 |
| HEK293T细胞 | ATCC | 11268 | 这些细胞持续表达猴病毒40（SV40）大T抗原，克隆17因其高转染效率而被特别选中。 |
| HERAcell® 240i CO2培养箱 | Thermo Scientific | 可由任意厂家产品替代 | |
| HotStar PCR试剂盒 | Qiagen | 203203 | |
| Intas凝胶成像系统 | Intas | 可使用任意用于染色DNA琼脂糖凝胶的可视化系统 | |
| 低熔点琼脂糖 | Biozym | 850081 | 可由任意厂家产品替代 |
| Opti-MEM培养基 | Invitrogen | 31985070 | 可由任意厂家产品替代 |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | 携带BK多瘤病毒（BKPyV）Dunlop株全长基因组的质粒；用作阳性对照；DNA序列登录号：KP412983 |
| PBS缓冲液 | Gibco | 14190-136 | |
| PCR仪 MJ Mini 48孔个人循环仪 | Bio-Rad | 已停产产品 | 可使用任意热循环仪 |
| PCR核苷酸混合液，10 mM | Promega | #C1145 | 可由任意厂家产品替代 |
| PCR1和PCR2引物 | metabion | 不适用 | 脱盐处理。用PCR级水稀释至10 µM |
| 青霉素-链霉素溶液（100x） | Gibco | 15140-122 | 可由任意厂家产品替代 |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | 一种基于荧光的染料，用于测定双链DNA浓度 |
| SpeI-HF限制性内切酶 | NEB | R3133 | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1转染试剂 | Mirus | MIR2300 | |
| 胰蛋白酶0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | 可由任意厂家产品替代 |
| ZymoPURE II质粒提取试剂盒 | Zymo | D4201 | 可由任意厂家产品替代 |
参考文献
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
