BK-多瘤病毒非编码控制区域驱动转录活性通过流细胞测定的测量

Summary

在本手稿中,提出了使用 HEK293T 细胞转染的基于 FACS 的 BK-多瘤病毒转录活性的测量方案,该细胞与表达 tdTomato 和 eGFP 的双向报告质粒转染。该方法进一步允许定量确定新化合物对病毒转录的影响。

Abstract

多瘤病毒,如BK-多马病毒(BKPyV),可引起免疫功能低下患者的严重疾病。然而,由于目前没有高效抗病毒药物,需要用测量潜在抗病毒药物影响的方法。在这里,一个双荧光报告器,允许分析BKPyV非编码控制区域(NCCR)驱动的早期和后期促进者活动,以量化潜在的抗病毒药物对病毒基因表达的影响,通过tdTomato和eGFP表达。此外,通过克隆BKPyV-NCCR增压,该议定书中从免疫功能低下的肾移植患者的血液衍生DNA中得到的,可以确定NCCR-重组对病毒基因表达的影响。在克隆患者衍生的氨基细胞后,HEK293T细胞与报告质粒转染,并用潜在的抗病毒剂进行治疗。随后,对细胞进行FACS分析,以测量转染后72小时的平均荧光强度。为了测试具有潜在细胞循环抑制作用的药物的分析,只使用转染的荧光细胞。由于这种测定是在大T抗原表达细胞中进行的,因此可以相互独立地分析早期和晚期表达的影响。

Introduction

聚瘤病毒代表一个独立的小双链DNA(dsDNA)病毒家族,以西米安病毒40(SV40)为原型物种。原发性感染主要发生在儿童期,通常无疾病症状,通常引起免疫宿主的潜在感染。BK-多瘤病毒(BKPyV)主要在肾小管细胞中持续存在,不会引起肾病,但是,在肾移植后免疫能力受损的情况下,病毒可以重新激活,并造成严重的损害和受损的移植物功能达到高病毒血症 (1 x 10⁴ BKPyV DNA 拷贝/mL)^{1,2 。}在大约10%的肾脏移植接受者中,BK-多瘤病毒(BKPyV)的重新激活导致多瘤病毒相关肾病(PyVAN),高达80%与肾异体移植失败的高风险相关3,4.由于没有经过批准的抗病毒药物,目前的治疗是基于减少免疫抑制。有趣的是,mTOR抑制剂似乎具有抗病毒作用;因此,将免疫抑制疗法切换到基于mTOR的免疫抑制可能是防止BKPyV病毒血症5、6、7进展的替代方法。然而,基于mTOR的抗病毒机制目前仍不完全了解。因此,需要测量潜在抗病毒药物在临床相关浓度中的影响的方法。

Protocol

本议定书遵循杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会(14-6028-BO)批准的人类研究准则。

1. 采集血液或尿液样本,分离多瘤病毒DNA

1. 在EDTA管中采集至少3 mL的血液,或在采集管中收集尿液。
2. 将样品在2,500 x g下离心15分钟。如果需要,将等离子移液器放入新管中,将等离子样品储存在 4°C 下数天,或在 -20°C 冷冻,以延长存储时间。
3. 将40μL蛋白酶K制备到1.5 mL微离心管中,并通过移液加入400μL的血浆。
4. 通过加入400 μL的解液缓冲液,涡旋15秒,并在56°C孵育10分钟,使样品解毒。
5. 按照制造商说明中所述,使用 DNA 血液提取试剂盒分离 DNA。简单地说,添加酒精,并将酸胶加载到含有DNA结合硅基膜的旋转柱上。洗几次柱子,产生纯DNA。
6. 在30-50μL的TE缓冲液中释放产生的DNA。

2. 扩大非编码控制区域(NCCR)

1. 在物理分隔的房间中执行以下步骤。使用隔离室制备试剂并将混合物分配到 PCR 管中。
2. 使用引体对 A (表 1) 在总体积为 50 μL 时为预 PCR 准备主混合物,并使用步骤 1.6 中先前分离的 DNA。表2....

Results

在具有代表性的实验中,通过流式细胞测定测量了BK-多瘤病毒非编码控制区驱动的转录活性。此外,一种mTOR抑制剂,可用于BKPyV重新激活后治疗患者,被测试为抑制病毒早期基因表达。为此,使用双荧光-报告器测定,如之前公布的5。实验设置的总体工作流程方案在F igure 1中进行了说明。首先,根据机构伦理委员会批准的人类研究指南,从免疫功能低下的肾脏移植患者身上采集血液样本。血液在含EDTA的管中采集,相位通过离心分离。随后,400 μL血浆用于分离多瘤病毒DNA。使用图2A所示的嵌套PCR协议放大了非编码控制区域(NCCR),使用外引基对BKV-CR-1fw和BKV-CR-1rv,以及内部引基对BKV-CR-2fw-AgeI(引基AAgeI)和BKV-CR-2rv-SpeI(引子SpeI)17,后者窝藏的AgeI和SpeI的限制网站。放大子验证是通过胶质.......

Discussion

本文提出了一种常用的方法,用于分析BKPyV非编码控制区域(NCCR)驱动的早期和后期启动器活动。NCCR活性可以同时测量,不需要转染细胞的溶解。此外,可以分析相对大量的细胞,并且不需要共同转染额外的标记,以使荧光值正常化。

此方法的一个关键部分是,克隆的 NCCR 应包含与阿普利森测序所识别的完全相同的序列,该序列对应于患者血浆中存在的大多数变体。为了获得准确的结果并尽量减少容易发生PCR的错误,强烈建议使用具有校对活性的聚合酶。或者,序列可以由商业基因合成服务订购。可订购指定的 NCCR 序列,包括用于直接克隆的侧翼 AgeI 和 SpeI 限制位点。在这种情况下,从合成结构中消化与骨干质粒平行的质粒,用相应的NCCR片段替换垫片。DNA可以从尿液样本中分离出来。然而,由于BKPyV也由免疫能力个体分泌到尿液中,不一定反映活性复制,临床相关性有限。理想情况下,DNA也可以从肾脏活检中分离出来,在活检中,以前的PVAN可以组织学检测(与Korth等人比较,2019^年19)。

通.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp 分子量标准	NEB	N3231	任何范围不超过 1 kb 的分子量标准都可以替代
2 对数分子量标准	NEB	N0550	任何范围高达 10 kb 的分子量标准可以替代
脂-琼脂，神户	I Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
氨苄青霉素钠盐 Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	可以被任何制造商
BD FACSCanto&trade 替代;II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C相机模块	徕卡		任何相机均可使用
DMEM	Gibco	41966-029	由任何制造商替代
DMIL LED 显微镜	徕卡		任何荧光显微镜可用
DNA 血液小量试剂盒	Qiagen	51104	可替换为任何制造商
大肠杆菌 DH5alpha 感受态细胞	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	FBS 均可使用
FlowJo v10.5.3	FlowJo， LLC		任何流式细胞术软件 FBS 可用
凝胶上样染料，紫色 （6X）	NEB	B7024	任何 6x 负载染料都可以替代
HEK293T细胞	ATCC	11268	这些细胞组成型表达猿猴病毒 40 （SV40） 大 T 抗原，克隆 17 因其高转染性而被特别选择。
HERAcell® 240i CO2 培养箱	Thermo Scientific		可由任何制造商替代
HotStar PCR 试剂盒	Qiagen	203203
Intas 凝胶记录系统	Intas		任何用于含有琼脂糖凝胶的染色 DNA 的可视化系统
熔点琼脂糖	Biozym	850081	可由任何制造商替代
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	可被任何制造商的
pBKV （34-2）	ATCC	45025	质粒替代，该质粒含有 BKPyV 菌株 Dunlop 的全长基因组;用作阳性对照;DNA 测序附件：KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR 循环仪 MJ 迷你型 48 孔个人循环仪	Bio-Rad	停产产品	热循环仪均可使用
PCR 核苷酸混合物，10 mM	Promega	#C1145	可替换为任何制造商
PCR1 和 PCR2 引物	代谢	离子 不适用	脱盐。稀释至 （10 µM） 含 PCR 级水
PenStrep （100x）	Gibco	15140-122	可替换为任何制造商的
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	一种基于荧光的染料，用于测量 dsDNA 浓度
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA 连接酶	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
胰蛋白酶 0.05% - EDTA	Gibco	25300-054	可由任何制造商替代
ZymoPURE II 质粒试剂盒	Zymo	D4201	由任何制造商替代