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方法文章

通过流式细胞术测量BK多瘤病毒非编码调控区驱动的转录活性

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DOI：

10.3791/59755

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2019年7月13日

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1Department of Nephrology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 2Institute for Virology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 3Center for Translational Medicine, Medical Department I, Marien Hospital Herne, University Hospital of the Ruhr-University of Bochum, 4Department of Infectious Diseases, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen Hufelandstr

本文内容

摘要

本文提供了一种利用转染了双向报告质粒（表达tdTomato和eGFP）的HEK293T细胞，通过流式细胞术（FACS）检测BK多瘤病毒转录活性的实验方案。该方法还可用于定量评估新化合物对病毒转录的影响。

摘要

多瘤病毒（如BK多瘤病毒，BKPyV）可在免疫功能低下患者中引起严重病理反应。然而，由于目前尚无高效抗病毒药物，因此亟需建立评估潜在抗病毒药物作用的方法。本文构建了一种双荧光报告系统，可通过tdTomato和eGFP的表达来定量分析由BKPyV非编码调控区（NCCR）驱动的早期和晚期启动子活性，从而评估潜在抗病毒药物对病毒基因表达的影响。此外，通过克隆BKPyV-NCCR扩增子（本方案中以免疫功能低下肾移植患者血液来源DNA为例获取），可进一步确定NCCR重排对病毒基因表达的影响。在完成患者来源扩增子的克隆后，将报告质粒转染至HEK293T细胞，并用潜在抗病毒药物处理。随后，在转染后72小时对细胞进行流式细胞术（FACS）分析，检测平均荧光强度。为同时检测可能具有细胞周期抑制作用的药物，仅分析已转染并呈现荧光的细胞。由于该检测在表达大T抗原的细胞中进行，因此可独立评估早期和晚期基因表达的影响。

引言

多瘤病毒科是一类独立的小型双链DNA（dsDNA）病毒，其中以猴病毒40（SV40）为原型种。初次感染主要发生在儿童时期，通常无临床症状，并在免疫功能正常的宿主中引起潜伏性感染。BK多瘤病毒（BKPyV）主要在肾小管细胞中持续存在，一般不会导致肾脏病理改变；然而，在肾移植后若出现免疫功能受损，病毒可能被重新激活，当病毒血症达到较高水平（1 × 104 BKPyV DNA拷贝/mL）时，可造成严重损害并影响移植物功能1,2。大约10%的肾移植受者会出现BK多瘤病毒（BKPyV）的再激活，进而导致多瘤病毒相关性肾病（PyVAN），该病症曾与高达80%的肾移植失败风险相关3,4。由于目前尚无获批的抗病毒药物，当前治疗主要依赖于降低免疫抑制强度。有趣的是，mTOR抑制剂似乎具有抗病毒作用；因此，将免疫抑制治疗方案转换为基于mTOR抑制剂的方案，可能是一种防止BKPyV病毒血症进展的替代策略5,6,7。然而，mTOR介导的抗病毒机制目前仍未完全阐明。因此，亟需建立能够评估潜在抗病毒药物在临床相关浓度下作用效果的方法。

BKPyV 的环状基因组大小约为 5 kb，包含一个非编码控制区（NCCR），该区域既作为复制起点，又作为双向启动子驱动早期和晚期 mRNA 转录本的表达。由于在致病性 BKPyV8 中可观察到自发发生的 NCCR 重排、缺失和重复，且在患有 PVAN 的患者中显著积累5,9，因此比较典型（wt）与重排（rr）NCCR 的活性有助于表征病毒的复制适应性。

如图1所示，本实验方案描述了一种常用方法，通过定量报告质粒表达的两种荧光蛋白tdTomato和eGFP的荧光强度，来检测BK多瘤病毒（BKPyV）非编码控制区（NCCR）的转录活性5,9,10,11。该实验在SV40大T抗原（lTAg）存在下进行，可分别分析潜在抗病毒药物对NCCR早期和晚期活性的影响5。本检测方法还可进一步分析NCCR序列重排对其活性的影响，并与野生型NCCR（wt-NCCR）进行比较5,9。报告质粒在每种荧光蛋白的开放阅读框下游均含有SV40晚期多聚腺苷酸化信号，以确保tdTomato和eGFP两种转录本均能进行高效且可比的加工处理。与基于qRT-PCR的方法5,12相比，这种基于流式细胞术（FACS）的方法成本较低，且适用于高通量筛选，无需对感染的细胞培养物进行复杂的提取流程，也无需使用昂贵的抗体进行免疫荧光染色。此外，由于可通过流式细胞术定量分析特定数量的荧光标记细胞，因此也可对细胞周期抑制剂的作用进行定量评估。

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方案

本方案遵循由杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会批准的人类研究指南（编号：14-6028-BO）。

1. 血液或尿液样本的采集及多瘤病毒DNA的分离

  1.  使用EDTA管采集至少3 mL血液，或使用采集管收集尿液。
  2. 在2,500 x g条件下离心样品15分钟。如有需要，用移液器将血浆转移至新管中，血浆样品可在4 °C保存数天，或在-20 °C冷冻以长期保存。
  3. 在1.5 mL微量离心管中加入40 µL蛋白酶K，并用移液器加入400 µL血浆。
  4. 加入400 µL裂解缓冲液裂解样品，涡旋振荡15秒，然后在56 °C孵育10分钟。
  5. 按照制造商说明书，使用DNA血液提取试剂盒提取DNA。简而言之，加入酒精后将裂解物加载到含有基于二氧化硅的DNA结合膜的离心柱上。多次洗涤柱子以获得纯化的DNA。
  6. 用30–50 µL TE缓冲液洗脱所得DNA。

2. 非编码调控区（NCCR）的扩增

  1. 在物理隔离的不同房间内进行以下操作。使用独立的房间配制试剂，并将混合液分装至PCR管中。
  2. 使用引物对A（表1）配制预PCR的总反应体系为50 µL的主混合液（Master Mix），并使用步骤1.6中先前分离得到的DNA。配制预PCR和巢式PCR主混合液的加样方案见表2。
  3. 将45 µL主混合液分装至各PCR管中。
  4. 向每根PCR管中加入5 µL已分离的DNA。
    注意：应使用与主混合液配制不同的房间，以避免污染。
  5. 按照表3所示的反应条件运行PCR程序，变性、退火和延伸循环共35次。
  6. 巢式扩增使用含有AgeI和SpeI限制性酶切位点的引物对B（表1）。
  7. 使用5 µL预PCR产物，按照步骤2.2至2.5所述的反应条件进行巢式PCR扩增。
  8. 取10 µL PCR产物与2 µL 6x上样缓冲液混合，取10 µL混合液上样至1.5%琼脂糖凝胶，以60 mA电流电泳30分钟。
  9. 使用适当的紫外成像系统观察凝胶结果。
    注意：扩增产物的大小预计在300–500 bp之间，具体取决于是否发生重排（如缺失、插入或重复）（图2C）。
  10. 根据试剂盒说明书，使用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。用30 µL洗脱缓冲液洗脱纯化的PCR产物。
  11. 使用引物对B将纯化后的扩增产物送测Sanger测序。

3. 将NCCR克隆至双荧光报告载体

  1. 按照表4所述方法，用AgeI和SpeI在37 °C下消化纯化的扩增子（步骤2.10），反应2小时。
  2. 重复步骤2.10，并纯化已消化的扩增子。
  3. 同时，将质粒骨架（1.5 µg）用AgeI和SpeI在37 °C下消化2小时，具体操作如表5所述。此步骤仅需进行一次，后续反应可将消化产物于-20 °C保存。
  4. 在0.8%低熔点琼脂糖凝胶上分析已消化的质粒骨架。
    注意：电泳时电流不得超过40 mA。预期的间隔区插入片段最初来源于质粒pEX-K4 2-LTR CD313，长度为128 bp（图2C）。
  5. 使用长波紫外光（320 nm）观察DNA片段，并用洁净的手术刀切下骨架条带。将低熔点凝胶片段转移至新的1.5 mL微量离心管中。避免长时间紫外照射，以防DNA损伤。
    注意：由于使用的是低熔点琼脂糖，因此在连接前无需纯化DNA。
  6. 将含有低熔点琼脂糖片段的骨架在65 °C加热10分钟，期间每2分钟轻轻涡旋混匀一次，以完全融化凝胶。融化的凝胶可直接用于连接反应。
  7. 按照表6所示方案，使用T4 DNA连接酶在16 °C过夜连接骨架与已消化的扩增子。
  8. 采用热激法将连接产物转化至E. coli中，涂布于LB-amp平板，于37 °C过夜培养。
  9. 次日，挑选三个阳性克隆，制备过夜E. coli培养物（5 mL LB-Amp），于37 °C培养。
  10. 按照文献中描述的标准方法提取质粒DNA14，用AgeI和SpeI进行消化以鉴定阳性克隆，并在1%琼脂糖凝胶上观察切割后的片段。间隔区条带（128 bp）将被较大的NCCR序列（300–500 bp，见上文）取代。
  11. 使用引物EGFP-N或引物对B（表1）将质粒送测Sanger测序。
  12. 由于可能自发产生突变，需将测序结果与扩增子的测序结果进行比对。仅选用与扩增子序列完全一致的克隆。
  13. 使用分子工作台软件（例如免费软件GENtle 1.9.4或其他序列编辑程序）对获得的序列进行比对和编辑（图3）。
  14. 启动GENtle 1.9.4，点击导入按钮（绿色向下箭头）导入DNA序列。
  15. 接着点击工具，从菜单中选择比对（可使用快捷键Ctrl+G），并选择需要比对的DNA序列。
  16. 通过点击添加加入序列，或点击移除删除序列。比对时应包含一个典型的NCCR共识序列，如JN19243815，不要使用常用Dunlop株系中的NCCR序列16，因其含有与典型BKPyV株系不同的重排和重复结构。
    注意：NCCR序列中已包含翻译起始密码子（图3）。
  17. 点击工具栏中的算法选择比对方法，选择clustal W。设置比对参数为匹配得分2；空位延伸罚分-1；空位开启罚分-2，然后点击确定开始比对。

4. 用报告质粒瞬时转染 HEK293T 细胞并用潜在抗病毒药物处理

  1. 为后续转染实验准备足量的质粒DNA，需制备150 mL过夜培养物。使用质粒提取试剂盒分离质粒DNA。也可选用其他质粒纯化试剂盒。
  2. 转染前24小时，将1 × 105个HEK293T细胞接种于含10%胎牛血清（FCS）、青霉素和链霉素（1×）的DMEM培养基中，每孔加入12孔板，于37 °C、5% CO2条件下培养过夜，以确保转染期间细胞处于活跃增殖状态。
    注意：转染时细胞融合度应约为80%。
  3. 在无菌离心管中加入250 µL低血清培养基，加入每种报告质粒DNA各1 µg，并用移液器轻轻混匀。
  4. 向DNA混合物中加入3 µL转染试剂，用移液器轻轻混匀，室温孵育15分钟。使用前将转染试剂预温至22 °C环境温度，并轻轻涡旋混匀。
  5. 将混合物逐滴加入各孔中，并轻轻晃动培养板使液体均匀分布。
  6. 4小时后，吸除上清液，更换为含有待测药物及溶剂对照的新鲜培养基，于37 °C继续培养至检测时间点。本示例中使用mTOR抑制剂INK128（100 ng/mL）和雷帕霉素（rapamycin，100 ng/mL）。

5. 荧光显微镜与流式细胞术

  1. 在荧光显微镜下观察细胞的红色和绿色荧光（图4）。
    注意：红色荧光和绿色荧光分别对应BKPyV的早期和晚期基因表达。
  2. 转染后72小时，吸除上清液，并用1 mL冷PBS洗涤细胞两次。
  3. 轻柔加入500 µL胰蛋白酶，轻微转动培养板以避免细胞过早脱落。此步骤对于防止细胞成对（doublets）至关重要。
  4. 加入后，立即使用同一移液枪头直接吸除胰蛋白酶。
  5. 将细胞在37 °C下孵育至少5分钟。
  6. 用含3% FCS的1 mL PBS重悬胰蛋白酶消化后的细胞，并将悬液转移至预先标记的FACS管中。
  7. 在进行FACS分析前加入DAPI（1 µg/mL）。
  8. 使用流式细胞仪分析细胞。每个样本至少检测10,000个活细胞（即DAPI染色阴性细胞）。

6. 数据分析

  1. 将数据导入流式细胞仪分析软件，并通过单击并拖动方式将样本添加至工作区。
  2. 双击已导入的文件以创建图形。通过点击横轴和纵轴选择FSC-A与SSC-A的散点图。在工具栏中点击多边形工具，圈选主要细胞群（图5）。根据需要命名所选细胞群（例如 "single cells"）。该"single cells"将作为一个新的工作区出现。
  3. 继续对"single cells"进行门控，筛选DAPI阴性细胞（即 "living cells"）。为识别活细胞，需比较经DAPI染色与未染色的细胞群。在两个图中均选择FSC-A与pacific-blue-A的关系图。
  4. 点击矩形门工具，选择DAPI阴性细胞群，将其命名为"living cells"，并创建一个新的点图，显示FITC（eGFP）与PE（tdTomato）的关系，方法如前所述。
  5. 在"living cells"中通过工具栏选择Quad添加象限。通过拖动象限中心至各细胞群边缘来调整门控位置。四个象限分别代表：1）eGFP-tdTOM-，2）eGFP-tdTOM+，3）eGFP+tdTOM-，4）eGFP+tdTOM+。
    注意：由于FITC与PE发射光谱存在重叠，初始补偿至关重要，以区分红色与绿色信号，获得准确结果。
  6. 通过右键点击象限并选择添加统计值来确定平均荧光强度（MFIs）。选择均值并点击确定。平均MFI值将显示在细胞群下方的"statistics"区域。象限2和4对应早期表达，而象限3和4代表晚期表达。
  7. 以相同方式添加额外重复样本，以增强统计效力。
  8. 在数据分析时，将早期和晚期的MFI值绘制成柱状图：
  9. 为比较来自不同供体或病毒株的NCCR活性，可加入一个典型对照或Dunlop株16，将其相对MFI设为100%，并据此计算其他样本的相对MFI值。对每个重复样本重复此步骤，并计算均值与标准差。
  10. 为评估潜在化合物对转录活性的影响，将溶剂对照设为100%，并绘制处理组细胞的MFI值。

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结果

在本代表性实验中，通过流式细胞术检测了由BK多瘤病毒非编码调控区（NCCR）驱动的转录活性。此外，还测试了一种mTOR抑制剂对病毒早期基因表达的抑制作用，该抑制剂可能用于BKPyV再激活后患者的治疗。为此，采用了先前发表的双荧光报告基因检测方法5。实验设计的整体工作流程如Figure 1所示。首先，根据机构伦理委员会批准的人体研究指南，采集免疫功能低下肾移植患者的血液样本。血液采集至含EDTA的试管中，并通过离心分离各相。随后，取400 µL血浆用于分离多瘤病毒DNA。使用嵌套PCR方法扩增非编码调控区（NCCR），引物包括外侧引物对BKV-CR-1fw和BKV-CR-1rv，以及内侧引物对BKV-CR-2fw-AgeI（Primer AgeI）和BKV-CR-2rv-SpeI（Primer SpeI）17，其中内侧引物含有AgeI和SpeI限制性酶切位点，具体方案如F...

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讨论

本文介绍了一种常用方法，可用于分析由BK多瘤病毒非编码控制区（NCCR）驱动的早期和晚期启动子活性。该方法可同时检测NCCR活性，且无需裂解转染细胞。此外，可分析相对大量的细胞，且无需共转染额外的标记物以对荧光值进行归一化处理。

该方法的关键在于，克隆的NCCR序列必须与扩增子测序鉴定出的序列完全相同，即对应于患者血浆中存在的主要变异体。为了获得准确的结果并最大限度地减少PCR易错性，强烈建议使用具有校读活性的DNA聚合酶。或者，也可通过商业基因合成服务订购相应序列。可订购包含侧翼AgeI和SpeI限制性酶切位点的指定NCCR序列，以便直接克隆。在此情况下，将质粒与骨架质粒同时进行酶切，并用合成构建体中的相应NCCR片段替换间隔插入片段。DNA也可从尿液样本中分离获得。然而，由于BKPyV亦可由免疫功能正常的个体分泌至尿液中，未必反映病毒的活跃复制，因此其临床相关性有限。理想情况下，DNA还可从既往经组织学检测发现PVAN的肾活检样本中提取（参见Korth等，201919）。

通...

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披露

Johannes Korth 收到了来自 Astellas 和 Novartis 的演讲费和差旅费资助。Marek Widera 收到了来自 Novartis 的咨询费。Oliver Witzke 收到了来自 Amgen、Alexion、Astellas、Basilea、Biotest、Bristol-Myers-Squibb、Correvio、Chiesi、Gilead、Hexal、Janssen、Dr. F. Köhler Chemie、MSD、Novartis、Roche、Pfizer、Sanofi 和 TEVA 的临床研究资助、演讲费、酬金及差旅费。

致谢

作者感谢Barbara Bleekmann提供的出色技术协助。本研究得到了杜伊斯堡-埃森大学医学院IFORES项目以及鲁尔大学联盟和鲁尔梅尔卡托研究中⼼（MERCUR）RIMUR项目的资助。作者感谢Jürgen-Manchot-Stiftung为Helene Sertznig提供的博士奖学金及持续支持。患者样本的收集和使用已获得杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会的批准（编号：14-6028-BO）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 bp DNA标准品NEBN3231可使用任何范围达1 kb的DNA标准品替代
2-log DNA标准品NEBN0550可使用任何范围达10 kb的DNA标准品替代
琼脂粉，Kobe I型Carl Roth5210.3
AgeI-HF限制性内切酶NEBR3552
氨苄青霉素钠盐 CellpureCarl RothHP62.1
注射用水Bbraun2351744可由任意厂家产品替代
BD FACSCanto™ IIBD Biosciences
BD FACSDivaBD Biosciences
DAPISigma10236276001
DFC450C相机模块Leica可使用任意相机
DMEM培养基Gibco41966-029可由任意厂家产品替代
DMIL LED荧光显微镜Leica可使用任意荧光显微镜
DNA血液小型提取试剂盒Qiagen51104可由任意厂家产品替代
E.coli DH5alpha感受态细胞Thermo Scientific18258012
FBS Superior胎牛血清MerckMillipore50615可使用任意胎牛血清
FlowJo v10.5.3FlowJo, LLC可使用任意流式细胞术分析软件
上样缓冲液，紫色（6X） NEBB7024可使用任意6x上样缓冲液替代
HEK293T细胞ATCC11268这些细胞持续表达猴病毒40（SV40）大T抗原，克隆17因其高转染效率而被特别选中。
HERAcell® 240i CO2培养箱Thermo Scientific可由任意厂家产品替代
HotStar PCR试剂盒Qiagen203203
Intas凝胶成像系统Intas可使用任意用于染色DNA琼脂糖凝胶的可视化系统
低熔点琼脂糖Biozym850081可由任意厂家产品替代
Opti-MEM培养基Invitrogen31985070可由任意厂家产品替代
pBKV (34-2)ATCC45025携带BK多瘤病毒（BKPyV）Dunlop株全长基因组的质粒；用作阳性对照；DNA序列登录号：KP412983
PBS缓冲液Gibco14190-136
PCR仪 MJ Mini 48孔个人循环仪Bio-Rad已停产产品可使用任意热循环仪
PCR核苷酸混合液，10 mMPromega#C1145可由任意厂家产品替代
PCR1和PCR2引物metabion不适用脱盐处理。用PCR级水稀释至10 µM
青霉素-链霉素溶液（100x）Gibco15140-122可由任意厂家产品替代
Roti®-GelStainCarl Roth3865一种基于荧光的染料，用于测定双链DNA浓度
SpeI-HF限制性内切酶NEBR3133
T4 DNA连接酶NEBM0202
TransIT LT1转染试剂MirusMIR2300
胰蛋白酶0.05% - EDTAGibco25300-054可由任意厂家产品替代
ZymoPURE II质粒提取试剂盒ZymoD4201可由任意厂家产品替代

参考文献

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