需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用逼近视觉刺激评估小鼠视觉

11.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59766

⸱

2019年6月13日

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Visual and Anatomical Sciences, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

为了研究小鼠的视觉功能，我们进行了逼近视觉刺激实验。将小鼠置于一个顶部装有显示器的大型方形旷场中。逼近视觉刺激在小鼠中 consistently 引发了僵直或逃跑反应。

摘要

中枢神经系统中的视觉系统可处理多种视觉信号。尽管从视网膜经外侧膝状体到视觉皮层的整体结构已得到明确，该系统仍十分复杂。研究人员已开展细胞与分子水平的研究，以阐明视觉处理的机制，并进一步揭示相关疾病的发病机制。这些研究可能有助于人工视觉系统的开发。为了验证上述研究结果，必须进行行为学视觉检测。本文展示了一种可靠的、仅需相对简单装置的小鼠视觉检测方法——逼近刺激实验。该实验在一个较大的围栏中进行，围栏一角设有躲避处，天花板上安装有一台计算机显示器。显示器旁放置一台CCD相机，用于观察小鼠行为。将小鼠放入围栏中适应并探索环境10分钟，随后显示器程序化地投射10次逼近刺激。小鼠对刺激的反应表现为冻结行为或逃向躲避处。记录小鼠在逼近刺激前后的行为，并利用运动追踪软件分析视频。结果显示，小鼠运动速度在逼近刺激后发生显著变化。相比之下，盲鼠未表现出任何反应。我们的结果表明，这种简单的逼近实验是一种可靠的小鼠视觉检测方法。

引言

视觉系统始于视网膜，在此处视觉信号由光感受器捕获，并传递至双极细胞（2nd-级神经元），最后传递至神经节细胞（3rd-级神经元）。视网膜2nd- 和 3rd-order 神经元被认为可形成多条神经通路，分别传递视觉信号的特定方面，如颜色、运动或形状。这些不同的视觉特征被中继至外侧膝状体和视觉皮层。相比之下，引发眼球运动的视觉信号则被传送到上丘。传统上已鉴定出两条视网膜-皮层通路：大细胞通路和小细胞通路。这些通路分别编码运动物体和静止物体，其存在体现了平行加工的基本概念1,2,3,4,5,6最近，已发现超过15种双极细胞7,8,9,10,11 和神经节细胞12,13,14,15,16 已在包括灵长类动物视网膜在内的多种物种视网膜中报道过此类细胞。这些细胞不仅在形态学特征上有所区别，还因其表达不同的标志物和基因而得以区分。8,10,17,18，表明视觉信号的不同特征是并行处理的，这一过程比最初预期的更为复杂。

细胞与分子技术推动了我们对视觉信息处理机制以及异常视觉处理可能引发的疾病机制的理解。这种理解可能有助于人工眼的开发。尽管细胞检测与分析能够提供细胞层面的深入知识，但行为学实验与细胞实验相结合，将显著增强我们对细微视觉过程的现有认知。例如，Yoshida 等人19发现，星形无长突细胞是小鼠视网膜中运动检测的关键神经元。在完成细胞实验后，他们进一步开展了视动性眼震（OKN）行为学实验，证明星形无长突细胞功能异常的突变小鼠对移动物体无反应，从而验证了其细胞学研究结果。此外，Pearson 等人20在小鼠视网膜中进行了光感受器移植，以恢复患病小鼠的视力。他们不仅开展了细胞实验，还通过视动反应记录和水迷宫任务评估小鼠行为，从而使 Pearson 等人得以证实移植的光感受器恢复了原本失明小鼠的视觉功能。综上所述，行为学实验是评估小鼠视觉功能的有力工具。

目前有多种方法可用于测量小鼠视力，这些方法各有优势与局限性。活体视网膜电图（ERG）可提供信息，用于判断小鼠视网膜（特别是感光细胞和ON双极细胞）是否能适当地响应光刺激。ERG可在暗视（scotopic）或明视（photopic）条件下进行测试21,22。然而，ERG需要使用麻醉剂，而麻醉可能影响测量结果23。视动反射（optokinetic reflex, OKR）或视动反应（optomotor response, OMR）是一种评估小鼠对比敏感度和空间分辨力的可靠方法，这两者均为小鼠视觉的功能性组成部分。然而，OKR需要通过手术将固定装置连接至小鼠颅骨24。OMR则无需手术或对小鼠进行训练，但需要实验人员经过训练，以主观识别小鼠在光学滚筒内对移动光栅刺激所产生的细微头部运动25,26。瞳孔对光反射通过测量瞳孔在光刺激下的收缩反应来评估视觉功能，该方法无需麻醉，且具有客观而稳定的响应19。尽管瞳孔对光反射可在活体内模拟视网膜的光反应，但该反射主要由内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs）介导27。由于ipRGCs仅占视网膜神经节细胞（RGCs）中的极小部分，并不承担常规的成像功能，因此该测量方法无法反映大多数神经节细胞的功能状态。

临近视觉刺激实验此前并未被视为测量小鼠视觉能力的主要测试方法。然而，该实验实际上是一种在多种物种中均稳健可靠的视觉检测方法，包括小鼠28,29、斑马鱼30、蝗虫31,32以及人类33,34,35。重要的是，临近实验是少数可用于检测成像通路（而非反射通路）的方法之一，因为该通路涉及中枢神经系统中的视觉系统与边缘系统36,37,38。我们已建立了一套临近视觉刺激系统，并证实其能够诱发小鼠的运动检测反应，我们以此作为评估小鼠视觉系统完整性的间接指标。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验和动物护理均按照韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案（方案编号：17-11-0399）进行。

1. 实验准备

  1. 构建一个矩形的无顶盖围栏，用于在呈现逼近视觉刺激时容纳小鼠。我们使用铝制框架和PVC板构建了一个40 cm × 50 cm × 33 cm的围栏（图1A,B）。在围栏整个底部铺设一张纸，以确保每次实验后易于清理。在围栏的一个角落放置一个不透明的庇护所，其入口朝向 arena 中心，便于小鼠进出。
  2. 设置一台配备广角镜头的摄像机，用于记录小鼠的行为。将摄像机固定在紧邻围栏的桌面支架上。为获得最佳视频质量，摄像机帧率应设置为60 FPS或更高。
  3. 在围栏顶部安装一台计算机显示器。由于从外部无法看到该显示器，另准备第二台显示器，用于同步复制主显示器上的图像。
  4. 准备用于投射的逼近刺激图案。一种方法是使用MatLab软件中的PsychToolbox3编写一个逐渐扩大的黑色圆形图案（图1C）。将刺激设置为从2°的视觉角度开始，在250 ms内扩展至50°；这些参数决定了刺激速度（视觉角度计算见图1D）。设置程序代码使刺激重复10次，每次间隔1 s。
    注意：每次刺激在前一次结束后立即开始。有关刺激呈现的更多细节，请参见第3节。
  5. 选择用于逼近刺激实验的小鼠。本实验使用32只C57背景的健康眼小鼠，雌雄均有，年龄为4至14周。同时使用3只盲鼠（双眼患有严重白内障），以评估对逼近刺激的反应是否确实为视觉引导行为。这些盲鼠无瞳孔对光反射，也无视觉运动反应。

2. 小鼠适应性驯养

  1. 将一只小鼠放入围栏中，使其自由探索周围环境。在转移动物时，应尽量减少其应激反应，可将空闲手的掌背作为小鼠的依托处，避免让其悬空无支撑。应确保小鼠感觉整个围栏环境是安全的，并能发现隐蔽处。在与庇护所相对的角落撒入少量食物颗粒，以鼓励小鼠停留在庇护所之外。
  2. 让小鼠适应环境 7 至 15 分钟29,39。本实验在刺激开始前给予 10 分钟适应期。此外，在实验前一天进行 10 分钟的适应，可能有助于减轻小鼠的应激反应。

3. 逼近视觉刺激投影

  1. 在将小鼠放入实验区域之前，确保刺激程序已准备就绪，以便在小鼠处于围栏内时尽可能减少光照变化。一旦软件准备就绪，轻柔地将小鼠放入围栏中。
  2. 在刺激开始前10秒，启动视频录制。
  3. 当小鼠远离庇护所并在开阔区域内自由活动时，开始呈现逼近视觉刺激。在最后一次刺激呈现后等待10秒，再结束录像。
    1. 当小鼠位于距离庇护所最远的角落时，开始刺激呈现。然而，若小鼠似乎不愿探索该远端角落，可在小鼠位于实验区域其他角落时进行刺激呈现。这似乎不会影响动物的行为反应。
  4. 将小鼠转移回其原始饲养笼。通过向围栏壁和庇护所喷洒70%乙醇并擦拭，清洁围栏以供下一只小鼠使用。若纸质地面衬垫被污染，则予以更换；若在转移动物或清洁围栏过程中移动了庇护所，应将其重新放置到相同的初始位置。

4. 视频分析

  1. 将每只小鼠的视频片段以无压缩的 .avi 格式保存，以确保在传输至分析软件过程中无数据丢失。
    注意：无压缩会导致文件体积较大，因此建议使用外接硬盘进行存储。
  2. 使用分析软件追踪小鼠在刺激呈现前、期间及之后在实验区域内的运动情况。使用具有手动追踪功能的商业软件（参见材料表），逐帧追踪小鼠头部位置，从而每 1/60 毫秒生成一次 X 和 Y 坐标。其他可用的运动追踪软件包括 FIJI（NIH）40 和 EthoVision（Noldus）。
  3. 计算小鼠相对于避难处的速度和距离。若由于摄像角度导致实验区域图像发生畸变，需在计算前校正 X 和 Y 坐标（图 2）。
  4. 比较逼近刺激开始前后的行为参数，以确定小鼠对刺激的反应方式，例如僵直、逃逸或行为无明显变化29。将僵直定义为速度低于 20 mm/s 且持续时间达 0.5 秒或更长的时段；将逃逸定义为速度增至 400 mm/s 或更高，并以小鼠进入避难处为结束的时段。僵直与逃逸的定义参考 Franceschi 等人29 所设定的标准。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

将一只眼睛健康的小鼠放入围栏中，使其适应环境10分钟。实验 arena 的天花板上装有显示器，环境光照条件保持在中等光照水平（7 × 105 光子/μm2/s）。在适应期间，小鼠探索环境并发现不透明的穹顶可作为庇护所。当小鼠离开庇护所后，开始视频记录，随后启动视觉刺激。面对逼近刺激，大多数小鼠会逃入穹顶内（逃避反应），31只小鼠中有30只（97%）表现出该反应。部分小鼠在逃跑前出现静止不动的冻结反应（31只中有19只，61%）。逼近刺激使光照强度降低1个数量级（6 × 105 光子/μm2/s）。

使用具有手动追踪功能的商业分析软件（Image Pro Plus）或FIJI（NIH）对捕获的视频片段进行分析。利用追踪功能，在逼近刺激发生前、期间和之后的视频每一帧（60帧/秒）中确定小鼠的位置。我们分析了随时间变化的速度以及与庇护所之间的距离（图3）。当发生逃跑行为时，速度迅速增加，同时与庇护所的距离相应减少。相比之下，当小鼠呈现静止状态...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在逼近视觉刺激系统下，大多数（97%）健康眼睛的小鼠表现出逃跑反应。29只小鼠中有1只未表现出明显的逃跑反应，但该小鼠会走向穹顶并在其附近停留，直到逼近刺激消失，表明该小鼠在逼近刺激出现时至少表现出警觉性。因此，逼近刺激在健康眼睛的小鼠中始终能够引发先天性的恐惧反应。另一方面，三只盲鼠对逼近刺激未表现出任何反应（初步结果）。综上所述，我们证明逼近实验是一种对小鼠有效且一致的视力检测方法。

我们将逼近刺激的速度设定为 192 度/秒。Franceschi 等人29研究了在不同速度（5 至 84 度/秒）下的逼近反应，发现冻结反应更倾向于在较低速度下出现。Yilmaz 和 Meister28观察到在 35 至 350 度/秒范围内的逃跑反应；然而，在较高速度下，逃跑反应的潜伏期更长。因此，为了引发一致的逃跑反应，逼近刺激的速度应至少达到 50 度/秒或更高。即使使用标准的呈现软件，也可以轻松生成逼近刺激。然而，这类软件无法实现更高速度的逼近刺激。我们转而使用 MatLab 和 PsychTo...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 EY028915（TI）和RPB基金资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10.1" 显示器（2° 显示）ElecrowElecrow 10.1 英寸树莓派 1920x1080p 分辨率显示屏
14" 商务笔记本电脑 5490Dell84 / rcrc961481-4860836
20" × 50" 吸水垫Fisher ScientificAL2050用于保护实验区域地面效果良好，也可使用其他类型的垫子
21.5" 显示器（1° 显示）AcerAcer R221Q bid 21.5 英寸 IPS 全高清显示屏
CCD 相机Lumenera CorporationInfiniyy3S-1UR由于高帧率（60 fps），非常适合行为学研究
enclosure（铝框和PVC面板）80/20 Inc.4x 货号#9010, 4x 货号#9005, 1x 货号#9000, 5x 货号#65-2616性能优异，使用快速构建选项卡查找PVC材料、接头和框架
乙醇Fisher Scientific22-032-601
Excel 电子表格软件Microsoft Office用户友好，且 Microsoft Office 软件广为人知
FreearmAmazon用于将相机固定在桌面上，也可使用任何可安装的伸缩臂
ImagePro Premiere 3DMedia Cybernetics版本 9.3功能良好，但自动追踪功能有待进一步更新
Matlab 软件（Psychotoolbox 3）MathWorksMatlab R2018b 64 位 (9.5.0.944444)优秀的软件，可用于生成任意条件下的图形刺激
SteamPix 软件NorpixStreamPix 7 64 位单相机版运行良好，偶有丢帧问题，但客户服务良好
WD My Book 外置硬盘Western DigitalWDBBGB0080HBK 硬盘 8 TB USB 3.0若使用无压缩编解码器的 .avi 文件，由于文件体积较大，此设备为必需
广角镜头NavitarNMV-5M23性能优异，且为完整捕捉整个实验区域所必需

参考文献

  1. Enroth-Cugell, C., Robson, J. G. The contrast sensitivity of retinal ganglion cells of the cat. The Journal of Physiology. 187 (3), 517-552 (1966).
  2. Boycott, B. B., Wässle, H. The morphological types of ganglion cells of the domestic cat's retina. The Journal of Physiology. 240 (2), 397-419 (1974).
  3. Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Segregation of form, color, movement, and depth: anatomy, physiology, and perception. Science. 240 (4853), 740-749 (1988).
  4. Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Psychophysical evidence for separate channels for the perception of form, color, movement, and depth. The Journal of Neuroscience. 7 (11), 3416-3468 (1987).
  5. Wässle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5 (10), 747-757 (2004).
  6. Awatramani, G. B., Slaughter, M. M. Origin of transient and sustained responses in ganglion cells of the retina. The Journal of Neuroscience. 20 (18), 7087-7095 (2000).
  7. Ghosh, K. K., Bujan, S., Haverkamp, S., Feigenspan, A., Wässle, H. Types of bipolar cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neuroscience. 469 (1), 70-82 (2004).
  8. Wässle, H., Puller, C., Muller, F., Haverkamp, S. Cone contacts, mosaics, and territories of bipolar cells in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
  9. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
  10. Shekhar, K., et al. Comprehensive Classification of Retinal Bipolar Neurons by Single-Cell Transcriptomics. Cell. 166 (5), 1308-1323 (2016).
  11. Wu, S. M., Gao, F., Maple, B. R. Functional architecture of synapses in the inner retina: segregation of visual signals by stratification of bipolar cell axon terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (12), 4462-4470 (2000).
  12. Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neuroscience. 451 (2), 115-126 (2002).
  13. Volgyi, B., Chheda, S., Bloomfield, S. A. Tracer coupling patterns of the ganglion cell subtypes in the mouse retina. The Journal of Comparative Neuroscience. 512 (5), 664-687 (2009).
  14. Kong, J. H., Fish, D. R., Rockhill, R. L., Masland, R. H. Diversity of ganglion cells in the mouse retina: Unsupervised morphological classification and its limits. The Journal of Comparative Neuroscience. 489 (3), 293-310 (2005).
  15. Sumbul, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512(2014).
  16. Baden, T., et al. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529 (7586), 345-350 (2016).
  17. Lindstrom, S. H., Ryan, D. G., Shi, J., DeVries, S. H. Kainate receptor subunit diversity underlying response diversity in retinal Off bipolar cells. The Journal of Physiology. 592, Pt 7 1457-1477 (2014).
  18. Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
  19. Yoshida, K., et al. A key role of starburst amacrine cells in originating retinal directional selectivity and optokinetic eye movement. Neuron. 30 (3), 771-780 (2001).
  20. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
  21. Saszik, S. M., Robson, J. G., Frishman, L. J. The scotopic threshold response of the dark-adapted electroretinogram of the mouse. The Journal of Physiology. 543, Pt 3 899-916 (2002).
  22. Reuter, J. H., Sanyal, S. Development and degeneration of retina in rds mutant mice: the electroretinogram. Neuroscience Letters. 48 (2), 231-237 (1984).
  23. Woodward, W. R., et al. Isoflurane is an effective alternative to ketamine/xylazine/acepromazine as an anesthetic agent for the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 187-201 (2007).
  24. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), 2055(2008).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Lu, Q., Ganjawala, T. H., Hattar, S., Abrams, G. W., Pan, Z. H. A Robust Optomotor Assay for Assessing the Efficacy of Optogenetic Tools for Vision Restoration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (3), 1288-1294 (2018).
  27. Xue, T., et al. Melanopsin signalling in mammalian iris and retina. Nature. 479 (7371), 67-73 (2011).
  28. Yilmaz, M., Meister, M. Rapid innate defensive responses of mice to looming visual stimuli. Current Biology. 23 (20), 2011-2015 (2013).
  29. De Franceschi, G., Vivattanasarn, T., Saleem, A. B., Solomon, S. G. Vision Guides Selection of Freeze or Flight Defense Strategies in Mice. Current Biology. 26 (16), 2150-2154 (2016).
  30. Temizer, I., Donovan, J. C., Baier, H., Semmelhack, J. L. A Visual Pathway for Looming-Evoked Escape in Larval Zebrafish. Current Biology. 25 (14), 1823-1834 (2015).
  31. Guest, B. B., Gray, J. R. Responses of a looming-sensitive neuron to compound and paired object approaches. Journal of Neurophysiology. 95 (3), 1428-1441 (2006).
  32. McMillan, G. A., Gray, J. R. A looming-sensitive pathway responds to changes in the trajectory of object motion. Journal of Neurophysiology. 108 (4), 1052-1068 (2012).
  33. Vagnoni, E., Lourenco, S. F., Longo, M. R. Threat modulates neural responses to looming visual stimuli. Eur The Journal of Neuroscience. 42 (5), 2190-2202 (2015).
  34. Coker-Appiah, D. S., et al. Looming animate and inanimate threats: the response of the amygdala and periaqueductal gray. Social Neuroscience. 8 (6), 621-630 (2013).
  35. Tyll, S., et al. Neural basis of multisensory looming signals. Neuroimage. 65, 13-22 (2013).
  36. Wei, P., et al. Processing of visually evoked innate fear by a non-canonical thalamic pathway. Nature Communications. 6, 6756(2015).
  37. Shang, C., et al. Divergent midbrain circuits orchestrate escape and freezing responses to looming stimuli in mice. Nature Communications. 9 (1), 1232(2018).
  38. Salay, L. D., Ishiko, N., Huberman, A. D. A midline thalamic circuit determines reactions to visual threat. Nature. 557 (7704), 183-189 (2018).
  39. Vale, R., Evans, D., Branco, T. A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice. Journal of Visualized Experiments. (137), 56988(2018).
  40. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), 215-220 (2017).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

CCD
使用逼近视觉刺激评估小鼠视觉
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。