使用DiI-固定剂心脏灌注标记硬骨鱼脑和垂体中的血管

摘要

本文介绍了一种通过将DiI溶于固定液后进行心脏灌注，以快速标记辐鳍鱼类血管的实验方案，以青鳉（Oryzias latipes）为模型，重点针对脑和垂体组织。

摘要

血管支配着脊椎动物的所有组织，通过提供必要的营养物质、氧气和激素信号来维持其存活。它是发育过程中最早开始发挥功能的器官之一。血管形成机制已成为高度受关注的科学和临床研究课题。然而，在成体动物中，由于血管通常位于其他组织的深层，因此很难在大多数活体动物中观察到其结构。尽管如此，血管的可视化对于内分泌学和神经生物学等多个研究领域仍然至关重要。虽然已在斑马鱼中开发出多种转基因品系，能够通过荧光蛋白的表达直接观察血管，但其他真骨鱼类尚无类似工具。本实验方案以青鳉（Oryzias latipes）为模型，介绍一种通过心脏灌注含DiI的固定液来快速、直接标记脑和垂体血管的技术。该方案有助于加深我们对脑和垂体细胞如何与血管系统在完整组织或厚组织切片中相互作用的理解。

引言

血管在脊椎动物体内发挥着至关重要的作用，因为它们为所有器官提供必需的营养物质、氧气和激素信号。此外，自从发现血管参与癌症发展以来¹，它们在临床研究中受到了广泛关注。尽管已有大量研究探讨了血管生长和形态发生的机制，并鉴定出许多对血管形成至关重要的基因²，但关于细胞或组织与循环血液之间相互作用的许多方面仍有待深入理解。

观察脑和垂体中的血管系统非常重要。脑内的神经元需要大量的氧气和葡萄糖供应³，而垂体包含多达八种重要的激素分泌细胞类型，这些细胞依赖血流接收来自脑部的信号，并将其相应的激素输送至不同的外周器官^4,5。在哺乳动物中，位于下丘脑底部、名为正中隆起的门脉系统连接了脑与垂体⁶，但在硬骨鱼类中尚未描述存在如此明确的血液通路。事实上，在硬骨鱼类中，前视-下丘脑神经元直接将其轴突投射到垂体的神经部⁷，并主要直接支配各种内分泌细胞类型^8,9。然而，其中一些神经元的神经末梢位于血管外间隙，紧邻毛细血管¹⁰。因此，硬骨鱼类与哺乳动物之间的差异并不十分明确，硬骨鱼类中血管系统与脑及垂体细胞之间的关系仍需进一步研究。

斑马鱼在许多方面具有与其他脊椎动物物种在解剖结构和功能上相似的血管系统¹¹。它已成为心血管研究中一种强大的脊椎动物模型，这主要得益于多种转基因品系的建立，这些品系中血管系统的组分被荧光报告蛋白标记¹²。然而，循环系统的精确解剖结构可能在不同物种之间，甚至在同一物种的两个个体之间存在差异。因此，对于尚无转基因技术工具的其他硬骨鱼类而言，血管的可视化也可能具有重要意义。

已有多种技术被用于标记哺乳动物和硬骨鱼类的血管系统，包括针对血管特异性基因的原位杂交、碱性磷酸酶染色、微血管造影以及染料注射（综述见¹³）。荧光脂溶性阳离子吲哚羰花青染料（DiI）最初被用于研究膜脂质的侧向流动性，因其可保留在脂双层中并能在其中迁移^14,15,16。事实上，DiI分子由两条烃链和发色团组成。当烃链插入与其接触的细胞的脂双层细胞膜时，发色团则保留在其表面¹⁷。一旦进入膜内，DiI分子便在脂双层中进行侧向扩散，从而有助于染色那些未直接接触DiI溶液的膜结构。因此，通过心脏灌注注入DiI溶液，可标记所有与该化合物接触的内皮细胞，实现对血管系统的直接标记。如今，DiI还被用于其他染色目的，例如单分子成像、命运图谱绘制以及神经元示踪。值得注意的是，存在多种不同发射波长的荧光基团，可与其它荧光标记联合使用，且DiI的整合及其侧向扩散可在活体组织和固定组织中均发生^18,19。

甲醛由费迪南德·布卢姆（Ferdinand Blum）于1893年发现，至今仍被广泛用作组织固定的首选化学试剂^20,21。它对大多数细胞成分具有广泛的特异性，并能良好保存细胞结构^22,23。此外，甲醛还能保留大多数荧光染料的荧光特性，因此可用于固定转基因动物，使其靶向细胞中表达的荧光报告蛋白得以保存。

本文改编了先前用于标记小型实验哺乳动物模型中血管的方案²⁴ ，以适用于鱼类。整个操作过程仅需数小时即可完成。本方法展示了如何将含有DiI的甲醛固定液灌注到鱼类心脏中，从而直接标记模式鱼类青鳉脑部和垂体中的所有血管。青鳉是一种原产于亚洲（主要分布于日本）的小型淡水鱼，是一种具有丰富分子与遗传学研究工具的研究模型生物²⁵。因此，对该物种以及其他鱼类血管的识别，将有助于加深我们对脑组织和垂体细胞在完整组织或厚组织切片中如何与血管系统相互作用的理解。

方案

所有动物操作均按照挪威生命科学大学关于实验动物护理与福利的建议进行，并在授权研究人员的监督下实施。

1. 仪器与溶液的准备

1. 在1.5 mL塑料管中，将5 mg DiI晶体溶于1 mL 96%乙醇（EtOH）中，配制DiI储存液。涡旋振荡30秒，并用铝箔覆盖避光保存。
   注意：DiI储存液可在-20 °C避光条件下保存数月。
2. 通过将一块聚苯乙烯材料切割成5 cm长、3 cm宽、2 cm厚，并将其粘附至一个直径为9 cm的塑料培养皿上，制备鱼类固定装置（图1A）。使用手术刀片在聚苯乙烯上切出一个3 cm长的船形孔洞。
3. 在针头末端连接一段30–50 cm长的塑料导管，以构建灌流系统（图2）。
4. 在50 mL塑料管中，将10 mL 16%多聚甲醛溶液与30 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制40 mL新鲜的4%多聚甲醛（PFA）溶液。
5. 在10 mL塑料管中，将1 mL DiI储存液加入9 mL新配制的4% PFA溶液中，配制10 mL固定液/DiI混合溶液。使用前需避光保存。
   注意：未溶解的DiI晶体可保留在储存液管中，后续可添加新的乙醇以重新配制DiI储存液（见步骤1.1）。
6. 配制50 mL三卡因（MS-222）储存液。
   1. 将200 mg三卡因粉末溶于48 mL H₂O中，加入2 mL 1 M Tris碱溶液（pH 9），用1 M HCl调节pH至7，于-20 °C保存。
7. 在小烧杯中，将5 mL三卡因储存液与50 mL清洁水混合稀释。
8. 按照制造商说明，使用拉管仪拉制玻璃毛细管，制备数根5 cm长的玻璃移液管（图2）。

2. 解剖与灌注

注意：PFA 是一种有毒的挥发性化合物，因此解剖和灌注操作应在通风橱或通风良好的房间内进行，操作者必须佩戴防毒面具。

1. 解剖前准备好解剖工具，包括小剪刀、一把尖头镊子和一把粗齿镊子。
2. 将注射器插入盛有PFA/DiI混合液的50 mL离心管中吸取溶液，完成填充。然后将带有套管的针头连接至注射器末端（图2）。
3. 使用多段胶带以不同方向将注射器固定在实验台面上，并调整显微镜和座椅位置，以获得适合进行解剖及用肘部按压注射器活塞的操作姿势（图1B）。
   注意：本方案中使用肘部按压注射器活塞，但也可采用其他方式，例如由他人协助操作。
4. 将鱼放入步骤1.7中配制的过量三卡因溶液中实施安乐死。等待30秒后，用镊子夹住鱼的尾鳍测试其反射反应。当鱼不再对刺激产生反应时即可用于后续操作。
5. 将鱼腹面朝上置于鱼体固定装置中，用一根针固定头部末端，另一根针固定尾部上方，以稳定鱼体位置。
6. 用剪刀水平剪开腹部前方的表层皮肤，打开前腹部。
7. 使用镊子移除心脏上方的皮肤，直至清晰暴露心室和动脉球（图3）。
8. 将玻璃移液管连接至毛细管末端，并折断玻璃移液管尖端。
   注意：折断后的尖端孔径应足够大以允许液体顺利流出，但仍需足够小以便轻松插入组织。若未断裂或堵塞，玻璃移液管可重复使用。
9. 将玻璃移液管靠近心室，并用肘部施加压力推动注射器活塞，使液体排出。
10. 在持续向注射器施压的同时，用玻璃移液管固定心室。
11. 紧接着，用镊子穿刺静脉窦，使血液能够从循环系统中流出。
    注意：由于固定剂的作用，心室组织会变得更加脆弱；同时因血液被固定剂/DiI溶液稀释，颜色也会变浅。
12. 从心室开始，调整玻璃移液管的角度，寻找动脉球的入口。将移液管开口插入动脉球内（如图2所示），并继续对注射器施加压力。
    注意：动脉球呈透明状，组织具有弹性。当DiI/固定剂替代血液时，心脏内的玻璃移液管会更加明显，且随着压力增加，动脉球体积应出现扩张。此步骤至关重要，用以确保已施加足够压力，使所有血管均被固定剂/DiI溶液充分灌注。成功时，PFA常引发肌肉收缩，导致鱼体出现运动。
13. 继续保持对注射器施压30–60秒，同时维持玻璃移液管位于动脉球内。
14. 移除鱼体上的玻璃移液管和固定针。
15. 解剖取出脑组织和垂体，并将组织置于新鲜的4% PFA PBS溶液中，在室温避光条件下固定2小时。
    注意：脑和垂体的解剖方法此前已由Fontaine等²⁶ 和Ager-Wick等²⁷详细描述。由于固定作用，组织会变得较硬，脑与垂体之间的脆弱连接可能断裂。解剖后，也可在4 °C条件下进行过夜后固定处理。
16. 成像前用PBS冲洗组织两次，每次10分钟。
    注意：随后可将组织置于载玻片与盖玻片之间，使用间隔垫片和封片剂进行共聚焦显微成像（见图4）；或如Fontaine等²⁶ 所述，先用振动切片机进行切片，再置于载玻片与盖玻片之间，用于体视显微镜成像（见图4）。

结果

本方案演示了对青鳉大脑和垂体中的血管进行标记并同时固定组织的逐步操作流程。通过心内注射含有DiI的固定液至心脏后，可在切片上使用荧光体视显微镜（图4）或在完整组织上使用共聚焦显微镜（图5）观察到血管。无论是在较厚的组织切片还是在完整组织上，均可实现对血管结构的三维观察。在固定完成后，可使用标准免疫荧光方案对组织切片进行特定靶蛋白的标记，也可在转基因品系中对目标细胞表达荧光报告蛋白的情况进行观察（图6）。这使得研究者能够探究血管与其他特定细胞类型之间的相互作用。例如，此处使用了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）的青鳉转基因品系，以揭示垂体Lh细胞的位置²⁸。可以观察到这些细胞向血管发出突起。若灌注效果不理想，部分血管可能无法被充分标记。例如，若将溶液注射至心室而非动脉球，或注射时注射器活塞施加的压力过低和/或时间过短，则可能出现此情况（图7）。最后，通过以相同...

讨论

先前已使用DiI进行心脏灌注以标记多种模式物种中的血管²⁴，包括硬骨鱼类¹³_。

由于DiI通过血管灌注直接递送至内皮细胞膜，因此可通过提高固定液中DiI的浓度来增强信噪比。此外，该荧光染料在激发时可产生强烈的染色信号，且光漂白程度较低，因而能够实现相对较长时间的荧光发射^18,30。 同时，标记信号可维持数天，并可与其他需要温和处理条件的标记技术联合使用，例如免疫荧光（IF）³¹。

然而，该技术存在一些局限性。组织从固定液中取出后，应尽快完成标记和成像操作，因为随着时间推移，标记强度会减弱，信号也会发生扩散（图8）。若使用可增加膜通透性的去垢剂，这一过程将更快发生。此外，由于PFA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL 聚丙烯/聚乙烯无针注射器	Sigma	Z116866-100EA	注射器
BD Precisionglide 注射器针头	Sigma	Z118044-100EA	针头 18G (1.20*40)
硼硅酸盐玻璃，外径 10 cm，1.2 mm	sutter instrument	BF120-94-10	玻璃移液管
DiI (1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐)	Invitrogen	D-282
低密度聚乙烯管，外径 1.7 mm，内径 1.1 mm	Portex	800/110/340/100	套管
磷酸盐缓冲液 (PBS) 溶液	Sigma	D8537-6X500ML
移液管拉制仪	Narishige	PC-10
塑料培养皿	VWR	391-0442
超级胶水凝胶	loctite	c4356
三卡因 (ms-222)	sigma	E10521-50G