使用DiI-固定剂心脏灌注标记硬骨鱼脑和垂体中的血管

摘要

本文介绍了一种通过将DiI溶于固定液后进行心脏灌注，以快速标记辐鳍鱼类血管的实验方案，以青鳉（Oryzias latipes）为模型，重点针对脑和垂体组织。

摘要

血管支配着脊椎动物的所有组织，通过提供必要的营养物质、氧气和激素信号来维持其存活。它是发育过程中最早开始发挥功能的器官之一。血管形成机制已成为高度受关注的科学和临床研究课题。然而，在成体动物中，由于血管通常位于其他组织的深层，因此很难在大多数活体动物中观察到其结构。尽管如此，血管的可视化对于内分泌学和神经生物学等多个研究领域仍然至关重要。虽然已在斑马鱼中开发出多种转基因品系，能够通过荧光蛋白的表达直接观察血管，但其他真骨鱼类尚无类似工具。本实验方案以青鳉（Oryzias latipes）为模型，介绍一种通过心脏灌注含DiI的固定液来快速、直接标记脑和垂体血管的技术。该方案有助于加深我们对脑和垂体细胞如何与血管系统在完整组织或厚组织切片中相互作用的理解。

引言

血管在脊椎动物体内发挥着至关重要的作用，因为它们为所有器官提供必需的营养物质、氧气和激素信号。此外，自从发现血管参与癌症发展以来¹，它们在临床研究中受到了广泛关注。尽管已有大量研究探讨了血管生长和形态发生的机制，并鉴定出许多对血管形成至关重要的基因²，但关于细胞或组织与循环血液之间相互作用的许多方面仍有待深入理解。

观察脑和垂体中的血管系统非常重要。脑内的神经元需要大量的氧气和葡萄糖供应³，而垂体包含多达八种重要的激素分泌细胞类型，这些细胞依赖血流接收来自脑部的信号，并将其相应的激素输送至不同的外周器官^4,5。在哺乳动物中，位于下丘脑底部、名为正中隆起的门脉系统连接了脑与垂体⁶，但在硬骨鱼类中尚未描述存在如此明确的血液通路。事实上，在硬骨鱼类中，前视-下丘脑神经元直接将其轴突投射到垂体的神经部⁷，并主要直接支配各种内分泌细胞类型^8,9。然而，其中一些神经元的神经末梢位于血管外间隙，紧邻毛细血管

方案

所有动物操作均按照挪威生命科学大学关于实验动物护理与福利的建议进行，并在授权研究人员的监督下实施。

1. 仪器与溶液的准备

1. 在1.5 mL塑料管中，将5 mg DiI晶体溶于1 mL 96%乙醇（EtOH）中，配制DiI储存液。涡旋振荡30秒，并用铝箔覆盖避光保存。
   注意：DiI储存液可在-20 °C避光条件下保存数月。
2. 通过将一块聚苯乙烯材料切割成5 cm长、3 cm宽、2 cm厚，并将其粘附至一个直径为9 cm的塑料培养皿上，制备鱼类固定装置（图1A）。使用手术刀片在聚苯乙烯上切出一个3 cm长的船形孔洞。
3. 在针头末端连接一段30–50 cm长的塑料导管，以构建灌流系统（图2）。
4. 在50 mL塑料管中，将10 mL 16%多聚甲醛溶液与30 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制40 mL新鲜的4%多聚甲醛（PFA）溶液。
5. 在10 mL塑料管中，将1 mL DiI储存液加入9 mL新配制的4% PFA溶液中，配制10 mL固定液/DiI混合溶液。使用前需避光保存。
   注意：未溶解的DiI晶体可保留在储存液管中，后续可添加新的乙醇....

结果

本方案演示了对青鳉大脑和垂体中的血管进行标记并同时固定组织的逐步操作流程。通过心内注射含有DiI的固定液至心脏后，可在切片上使用荧光体视显微镜（图4）或在完整组织上使用共聚焦显微镜（图5）观察到血管。无论是在较厚的组织切片还是在完整组织上，均可实现对血管结构的三维观察。在固定完成后，可使用标准免疫荧光方案对组织切片进行特定靶蛋白的标记，也可在转基因品系中对目标细胞表达荧光报告蛋白的情况进行观察（图6）。这使得研究者能够探究血管与其他特定细胞类型之间的相互作用。例如，此处使用了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）的青鳉转基因品系，以揭示垂体Lh细胞的位置²⁸。可以观察到这些细胞向血管发出突起。若灌注效果不理想，部分血管可能无法被充分标记。例如，若将溶液注射至心室而非动脉球，或注射时注射器活塞施加的压力过低和/或时间过短，则可能出现此情况（图7）。最后，通过以相同.......

讨论

先前已使用DiI进行心脏灌注以标记多种模式物种中的血管²⁴，包括硬骨鱼类¹³_。

由于DiI通过血管灌注直接递送至内皮细胞膜，因此可通过提高固定液中DiI的浓度来增强信噪比。此外，该荧光染料在激发时可产生强烈的染色信号，且光漂白程度较低，因而能够实现相对较长时间的荧光发射^18,30。 同时，标记信号可维持数天，并可与其他需要温和处理条件的标记技术联合使用，例如免疫荧光（IF）³¹。

然而，该技术存在一些局限性。组织从固定液中取出后，应尽快完成标记和成像操作，因为随着时间推移，标记强度会减弱，信号也会发生扩散（图8）。若使用可增加膜通透性的去垢剂，这一过程将更快发生。此外，由于PFA.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL 聚丙烯/聚乙烯无针注射器	Sigma	Z116866-100EA	注射器
BD Precisionglide 注射器针头	Sigma	Z118044-100EA	针头 18G (1.20*40)
硼硅酸盐玻璃，外径 10 cm，1.2 mm	sutter instrument	BF120-94-10	玻璃移液管
DiI (1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐)	Invitrogen	D-282
低密度聚乙烯管，外径 1.7 mm，内径 1.1 mm	Portex	800/110/340/100	套管
磷酸盐缓冲液 (PBS) 溶液	Sigma	D8537-6X500ML
移液管拉制仪	Narishige	PC-10
塑料培养皿	VWR	391-0442
超级胶水凝胶	loctite	c4356
三卡因 (ms-222)	sigma	E10521-50G