我们介绍一种利用细菌细胞色素P450酶（BM3）大规模酶法合成和纯化花生四烯酸（AA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）的特定对映异构体和区域异构体环氧化物的方法。
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本文内容
摘要
摘要
多种多不饱和脂肪酸（PUFA）的环氧化代谢物被称为环氧脂肪酸，在人体生理过程中具有广泛的作用。这些代谢物由细胞色素P450酶系在体内生成。由于其具有多样且强烈的生物学效应，人们对研究这些代谢物表现出极大的兴趣。然而，确定这些代谢物在体内的独特功能是一项困难的任务，因为首先必须以较大量的高纯度形式获得这些环氧脂肪酸。从天然来源获取化合物通常费时费力，且可溶性环氧化物水解酶（sEH）会迅速将其水解。另一方面，通过化学反应合成这些代谢物效率极低，原因在于难以获得高纯度的区域异构体和对映异构体、产率低，以及需要复杂且昂贵的纯化步骤。本文介绍了一种高效的酶促合成方法，利用源自巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）并在大肠杆菌（Escherichia coli）中易于表达的细菌CYP450酶BM3，将二十二碳六烯酸（DHA）转化为19(S),20(R)-和16(S),17(R)-环氧二十二碳五烯酸（EDP）。通过核磁共振波谱（NMR）、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）对产物进行表征并确定其纯度。该方法展示了酶促合成PUFA环氧代谢物的优势，同样适用于其他脂肪酸的环氧化反应，例如花生四烯酸（AA）和二十碳五烯酸（EPA），分别生成相应的环氧二十碳三烯酸（EETs）和环氧二十碳四烯酸（EEQs）。
引言
近年来，随着人们对多不饱和脂肪酸（尤其是ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸）在人类生物学中所起作用的兴趣日益增长，研究人员开始关注其代谢产物所表现出的广泛有益效应。其中，细胞色素P450酶类产生的环氧脂肪酸代谢物已成为研究的重点。例如，多种多不饱和脂肪酸环氧化物，包括环氧二十碳三烯酸（EETs）、环氧二十二碳五烯酸（EDPs）和环氧二十碳四烯酸（EEQs），在血压调节和炎症调控中发挥着关键作用1,2,3,4,5。有趣的是，花生四烯酸（AA）和二十碳五烯酸（EPA）环氧化物的特定对映异构体和区域异构体已被证实对血管收缩具有不同的影响6,7。尽管EETs和EEQs的对映异构体与区域异构体的生理效应已有文献记载，但对于由DHA形成的类似环氧二十二碳五烯酸（EDPs）的作用仍知之甚少。富含EPA和DHA的鱼油被广泛使用8，也进一步激发了人们对EDPs的研究兴趣9。这些补充剂的益处被认为部分归因于DHA的下游代谢产....
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方案
警告：使用所列化学品前，请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。
1. 野生型BM3的表达
- 将转染了 pBS-BM3 的 DH5α E. coli（由 Dr. F. Ann Walker 惠赠）接种于含有 0.5 mg 氨苄青霉素的 5 mL 无菌 LB 液体培养基中，置于 20 mL 培养管内。
- 在 37 ˚C、200 rpm 条件下振荡培养细胞 24 小时。将过夜培养的菌液（5 mL）和 100 mg 氨苄青霉素加入 1 L 无菌 LB 液体培养基中，置于 Fernbach 或 Erlenmeyer 烧瓶内，先在 37 ˚C、200 rpm 条件下振荡培养 6 小时，随后在 30 ˚C、200 rpm 条件下继续振荡培养 18 小时。
- 在 4 ˚C、1,000 × g 条件下离心收集菌体 10 分钟。弃去上清液，将菌体沉淀保存于 -78 ˚C，待进行酶纯化。
注意：上清液可通过加入漂白剂进行化学灭菌，或使用高压灭菌器灭菌后，再排入下水道。
2. BM3的纯化。
- 细胞裂解
- 将细胞沉淀在冰上解冻，并用40 mL预冷（4 ˚C）的溶解缓冲液（10 mM Tris，0.01 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），0.01....
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结果
对酶促环氧化反应得到的粗混合物进行纯化后，使用下文所述的自动快速纯化系统进行快速柱层析，结果如图1所示。经酯化反应及区域异构体分离后，得到纯的16(S),17(R)-EDP和19(S),20(R)-EDP甲酯。通常情况下，二者比例约为1:4至1:5，其中主要产物为19(S),20(R)-EDP。未检测到其他EDP区域异构体（如13,14-或10,11-EDP）。16(S),17(R)-EDP（图2A）和19(S),20(R)-EDP（图2B）甲酯的1H-NMR谱图及其结构如下所示，表明这些化合物具有高纯度；其酸形式的C18（非手性）HPLC分析也显示纯度>98%。进一步通过高分辨质谱（酸和酯.......
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讨论
本文介绍了一种操作简便且成本效益高的方法，用于制备DHA的两种最丰富的环氧代谢物——19,20-和16,17-EDP。这些环氧脂肪酸可利用野生型BM3酶以高对映体纯度（作为其S,R-异构体）的形式制备。下文描述了若干关键步骤，可用于问题排查，以及将本方法拓展至制备AA和EPA的对映体纯环氧代谢物的相关内容。
BM3 储存指南
将纯化的BM3酶与等体积甘油混合，用液氮速冻后于-78 ˚C冰箱中保存。酶冻结后可保存长达一年。该酶仅能解冻一次，且必须在冰上解冻，解冻后在冰上放置不得超过4小时。再次冷冻或在无冰浴条件下使其解冻均会导致酶失活。
化学品储存指南
该实验步骤所需的多种化合物对空气敏感，包括二高-γ-亚麻酸（DHA）及其他多不饱和脂肪酸（PUFA）、环氧二十碳五烯酸（EDP）及其他环氧代谢物，以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP.......
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披露
作者无任何利益冲突需披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R00 ES024806）、美国国家科学基金会（DMS-1761320）以及密歇根州立大学的启动资金资助。作者感谢加州大学戴维斯分校的Jun Yang博士和密歇根州立大学的Lalitha Karchalla在酶促反应优化方面的协助，以及密歇根州立大学质谱与代谢组学平台的Tony Schilmiller博士在高分辨质谱数据采集方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 碳酸氢铵 | Sigma | 9830 | NA |
| 氨苄青霉素 | GoldBio | A30125 | NA |
| 无水硫酸镁 | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| 无水甲醇 | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| 无水硫酸钠 | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| 无水甲苯 | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| 花生四烯酸（AA） | Nu-Chek Prep | U-71A | 对空气敏感。 |
| 乙醚 | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO（分子生物学级） | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| 二十二碳六烯酸（DHA） | Nu-Chek Prep | U-84A | 对空气敏感。 |
| EDTA（乙二胺四乙酸） | Invitrogen | 15576028 | NA |
| 二十碳五烯酸（EPA） | Nu-Chek Prep | U-99A | 对空气敏感。 |
| 乙酸乙酯 | Sigma | 34858 | NA |
| Flash柱层析柱：25、40、4、12 g 规格 | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | 或者，也可使用常规柱层析法 |
| 甲酸（HPLC 级） | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| 甘油 | Sigma | G7757 | NA |
| 己烷 | VWR | BDH24575 | NA |
| LB肉汤 | Sigma | L3022 | NA |
| 氢氧化锂 | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| 氯化镁 | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| 甲醇（HPLC 级） | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH 四钠盐 | Sigma-Aldrich | 481973 | 对空气敏感。 |
| 草酸 | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 转染的 DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF（苯甲基磺酰氟） | Sigma | P7626 | 有毒！ |
| 高锰酸钾 | Sigma-Aldrich | 223468 | 用于薄层色谱染色。 |
| 磷酸氢二钾 | Sigma | 795496 | NA |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow 树脂（GE Healthcare life sciences） | Fisher Scientific | 17-0515-01 | 用于酶的阴离子交换纯化 |
| 氯化钠 | Sigma | 71376 | NA |
| 四氢呋喃，无水 | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-重氮甲烷（己烷中 2.0 M） | Sigma-Aldrich | 362832 | 剧毒。 |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
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| 核磁共振（NMR） | 核磁共振：Agilent DD2 波谱仪（500 MHz） | ||
| 旋转蒸发仪 | Buchi | ||
| 超声破碎仪或超声均质器 | Cole-Parmer |
参考文献
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al.
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重印与许可
