一种具有稳定人源化肠道微生物组和人类免疫系统的人源化BLT小鼠双模型

摘要

我们介绍一种用于生成双人源化BLT小鼠的新方法，该小鼠具有功能性的人类免疫系统以及稳定植入的人类类似肠道微生物组。本方案无需无菌小鼠或已知菌群动物设施即可实施。

摘要

具有功能性人类免疫系统的人源化小鼠（hu-mice）从根本上改变了人类病原体和疾病的研究。它们可用于模拟那些在人类或其他动物模型中难以甚至无法研究的疾病。肠道微生物组可对人类健康和疾病产生深远影响。然而，小鼠的肠道微生物组与人类的肠道微生物组存在显著差异。 目前亟需改进具有移植人类肠道微生物组的临床前人源化小鼠模型。因此，我们构建了“双人源化小鼠”（double hu-mice），其同时具备人类免疫系统和稳定的人类样肠道微生物组。NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠由于其高度免疫缺陷，是进行人源化研究的最佳动物模型之一。然而，无菌NSG小鼠以及多种其他重要的无菌小鼠模型目前尚无法商业化获得。此外，许多研究机构无法获得无菌生物设施，而在无菌条件下操作通常成本高昂且耗时。重要的是，即使在微生物移植后，无菌小鼠仍存在多种免疫缺陷。因此，我们开发了一种无需使用无菌动物或无菌生物设施的实验方案。为构建双人源化小鼠，NSG小鼠在手术前接受辐射处理，以制备骨髓、肝脏和胸腺人源化（hu-BLT）小鼠。随后，小鼠接受广谱抗生素处理，以清除其原有的小鼠肠道微生物组。在抗生素处理后，通过口服灌胃方式将来自健康人类供体的粪便样本移植至小鼠体内。双人源化hu-BLT小鼠的16S rRNA基因谱特征取决于所移植的人类供体样本。重要的是，移植的人类样微生物组在双人源化hu-BLT小鼠体内保持稳定，在移植后最长可达14.5周的研究期间内未发生显著变化。

引言

人源化小鼠（hu-mice）已彻底改变了人类健康与疾病多个方面的研究，包括造血作用、免疫、癌症、自身免疫性疾病和传染病^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。这类人源化小鼠相较于其他小鼠模型具有显著优势，因其具备功能性的人类免疫系统，并可感染人类特异性病原体。然而，肠道微生物组的重要性已在多种人类疾病中得到证实，如肥胖、代谢综合征、炎症性疾病和癌症^10,11,12,13。黏膜免疫系统与肠道微生物组之间存在相互调控关系，以维持肠道及全身的稳态。免疫系统受肠道微生物组所呈递抗原的塑造，同时免疫系统也在促进共生肠道菌群生长和清除病原体方面发挥重要的调节作用^14,15,16。然而，人源化小鼠的肠道微生物组尚未得到充分表征，且小鼠肠道微生物组在组成和功能上与人类存在显著差异¹⁷。这归因于小鼠与人类肠道之间在进化、生理和解剖结构上的差异，以及其他重要因素如饮食，这些因素可能影响人源化小鼠疾病模型的实验结果¹⁸。因此，除了对人源化小鼠中鼠源性肠道微生物组进行分类外，仍亟需建立一种同时具备人类免疫系统和人类肠道微生物组的动物模型，以在体内研究人类疾病中复杂的相互作用。

直接在人体上研究人类疾病通常不切实际或不符合伦理要求。许多动物模型无法用于研究人类病原体，例如人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。非人灵长类动物模型具有遗传异质性，成本极高，且对许多人类病原体不敏感。无菌（GF）小鼠经重建为具有类似人类肠道微生物组的模型后，已被广泛用于研究人类健康与疾病^19,20。然而，这些动物不具备人类免疫系统，且操作GF动物需要专门的设施、程序和技术专长。因此，亟需改进的临床前模型，以研究肠道微生物组与人类免疫系统之间的复杂关系。许多小鼠品系，例如NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG），无法商业化获得其无菌形式。此外，GF动物可能长期存在免疫缺陷，且微生物定植无法完全逆转这一缺陷²¹。因此，我们构建了一种“双人源化小鼠”（double hu-mice），在特定病原体-free（SPF）条件下同时具备功能性人类免疫系统和稳定的人类样肠道微生物组。为生成双人源化小鼠，我们对NSG小鼠实施手术，构建骨髓、肝脏和胸腺人源化小鼠（hu-BLT）。随后，将hu-BLT小鼠接受广谱抗生素处理，并移植来自健康人类供体的粪便样本。我们对来自45只双人源化hu-BLT小鼠和4份人类粪便供体样本的173份粪便样本进行了细菌肠道微生物组表征。双人源化hu-BLT小鼠的16S rRNA基因谱型具有独特性，取决于所移植的个体人类供体样本。重要的是，移植后的人类样微生物组在小鼠体内保持稳定，持续时间长达移植后14.5周。此外，预测的宏基因组分析显示，双人源化hu-BLT小鼠的预测功能潜力与仅人源化的小鼠不同，而更接近人类供体样本。

方案

本文所述所有方法均按照内布拉斯加大学林肯分校（UNL）机构动物护理与研究委员会（IACUC）批准的方案进行。UNL 的 IACUC 已批准两项与生成和使用人源化 BLT 小鼠（包括双人源化小鼠）相关的方案。此外，UNL 科学研究监督委员会（SROC）也已批准在人源化小鼠研究中使用人类胚胎干细胞和胎儿组织，这些材料由 Advanced Bioscience Resources 提供（SROC# 2016-1-002）。

1. 小鼠的饲养与维护

1. 购买6-8周龄的NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ）。
2. 将小鼠饲养在具有空气交换、预过滤器和高效微粒空气过滤器（0.22 μm）的SPF环境中，房间温度、湿度和压力均受控。
   1. 将小鼠饲养并维持在可进行空气交换（配备预过滤器和高效微粒空气过滤器，0.22 μm）的架系统中的灭菌独立微隔离笼具内。
3. 所有小鼠操作均应在已用70%乙醇预处理的II级A2型生物安全柜中进行。进入动物房操作前，需淋浴并更换清洁的刷手服、Tyvek防护服、鞋套、头帽、口罩和手套。在进行手术操作时，应在Tyvek防护服外加穿手术 gown。
   注意：操作前建议使用紫外线（UV）照射进行去污染。
   1. 尽可能对所有器械和试剂进行高压灭菌，转移至生物安全柜前再进行表面消毒。
   2. 操作过程中，将动物的独立通气笼具从架系统中取出，并在转移至生物安全柜前进行表面消毒。
4. 为小鼠提供辐照饲料，并给予高压灭菌水。自由供应辐照饲料，并根据需要补充额外的辐照饲料。每周或根据需要更换高压灭菌水。
   注意：也可使用高压灭菌酸化水。所提供的辐照饲料在生产后保质期为6个月。

2. 人源化BLT小鼠的制备

注意：人源化BLT小鼠的制备方法此前已有描述^22,23,24。

1. 手术当天，给予小鼠全身照射，剂量为每克体重 12 cGy。
2. 准备小鼠进行手术。
   1. 通过腹腔（IP）注射，给予每只经照射的小鼠混合麻醉剂，其中氯胺酮工作浓度为 100 mg/kg，赛拉嗪浓度为 12 mg/kg，根据体重每只小鼠注射量为 130–170 μL 。配制 3 ml 氯胺酮和赛拉嗪混合液时，将 0.27 mL 浓度为 100 mg/mL 的氯胺酮原液与 0.03 mL 浓度为 100 mg/mL 的赛拉嗪原液加入 2.7 mL 无菌生理盐水中，充分混匀。 注射前用 70% 异丙醇对皮肤进行消毒。
   2. 通过皮下注射给予每只经照射的小鼠布托啡诺（1 mg/kg 体重，半衰期 72 小时，SR-LAB），用于长效镇痛管理。
   3. 通过腹腔注射给予每只经照射的小鼠头孢唑林 100 μL（858 μg），用于术前抗生素预防。
   4. 使用电动剃毛器剃除小鼠左侧外侧及内侧手术区域的毛发，以便暴露左肾。
   5. 通过足底反射（用力捏脚趾）确认麻醉深度是否合适。
   6. 若手术过程中任何阶段需要追加麻醉，可给予 3–5% 异氟烷气体。
   7. 在双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。如有需要，可加装耳标。
3. 进行手术，将肝脏和胸腺组织植入左肾包膜下。
   1. 对手术部位皮肤进行消毒，先用碘伏由手术区域中心向外作环形擦拭。随后用 70% 异丙醇重复一次，再用碘伏重复一次。
   2. 使用镊子先将一块人胎儿肝脏组织碎片装入套管针中，再用镊子将一块人胎儿胸腺组织碎片装入套管针，最后再用镊子装入另一块人胎儿肝脏组织碎片。组织应切割为 1–1.6 mm³ 大小，以适配套管针的内径。
   3. 用镊子提起皮肤，用剪刀纵向做一小切口，并将其延长至小鼠左侧 1.5–2 cm。
   4. 用镊子提起肌肉层，用剪刀纵向做一小切口，根据需要延长切口以暴露肾脏。
   5. 轻轻夹住肾脏周围脂肪组织以暴露肾脏，避免直接接触肾实质。
   6. 使用手术刀在肾包膜后端做 1–2 mm 的切口。
   7. 将预装组织的套管针缓慢经切口平行于肾脏长轴插入，并将组织释放至肾包膜与肾脏之间。
   8. 小心将肾脏和肠管复位。使用可吸收的 5/0 P-3（P-13）缝线配合 13 mm 3/8 圆形针缝合肌肉层，使用皮肤缝合钉关闭皮肤。
4. 术后将小鼠放入洁净的高压灭菌微隔离笼中恢复。
   1. 为减少术后恢复期间的热量散失，将装有小鼠的笼子置于连接水泵的加热垫上，该水泵可加热水并循环维持温度。
   2. 持续监测小鼠，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。
5. 手术完成后 6 小时内，通过尾静脉注射从人胎儿肝脏组织中分离的 CD34+ 造血干细胞。
   1. 使用加热灯对小鼠进行保温。用 70% 异丙醇消毒尾部，然后向尾静脉注射 1.5 至 5 × 10⁵ 个干细胞/200 μL。
   2. 止住注射部位出血后，将小鼠放回微隔离笼，并将笼子放回笼架。
      注：术后小鼠通常在恢复期间及之后每笼合养五只，置于同一微隔离笼中。但仅当所有小鼠均在同一天接受手术时方可合养。
6. 每日检查小鼠，仔细观察手术缝合钉情况并根据需要更换。密切监测小鼠是否有感染或不适迹象。术后数天内在微隔离笼底部提供高压灭菌饲料。
7. 术后 7–10 天拆除手术缝合钉。使用 3–5% 异氟烷气体麻醉小鼠。小心拆除缝合钉后，在伤口处涂抹抗生素和镇痛软膏。
8. 给予 9–12 周时间以完成人源免疫细胞的重建，随后从小鼠的内侧隐静脉采集外周血。
   1. 使用合适尺寸的塑料锥形固定器限制清醒小鼠的活动，固定器前端靠近小鼠头部处设有呼吸孔，后端设有腿部开口以固定单侧后肢。将小鼠头部朝前放入固定器，然后轻柔地将一条腿从腿部开口拉出。
   2. 用 70% 异丙醇喷洒被固定腿的内侧，随后在相同部位涂抹抗生素和镇痛软膏。
      注：软膏有助于显示静脉位置，无需剃毛，同时有助于血液滴形成。
   3. 使用 25 号针头以 90° 角穿刺静脉，用 EDTA 涂层采血管采集 50–100 μL 血液。用无菌纱布按压穿刺部位止血。止血完成后，将小鼠放回笼中。
      注：通常每周最多采集 50 μL，或每两周最多采集 100 μL。
   4. 使用采集的外周血通过流式细胞术检测人源免疫细胞重建水平，所用抗体包括 hCD45、mCD45、hCD3、hCD4、hCD8、hCD19。

3. 抗生素处理

1. 在抗生素处理前，采集处理前的粪便样本。将小鼠转移至新的经高压灭菌的独立通风笼具中。
2. 每天新鲜配制广谱抗生素混合液。
   1. 为每笼小鼠准备250 mL饮用水，其中加入新配制的甲硝唑（1 g/L）、新霉素（1 g/L）、万古霉素（0.5 g/L）和氨苄西林（1 g/L）。
      注意：用于配制抗生素饮水的水必须为经高压灭菌或无菌的水。
   2. 在250 mL含抗生素的饮水中加入9.2 g葡萄糖调味饮料粉。
      注意：使用葡萄糖调味饮料粉可掩盖抗生素的苦味，有助于防止小鼠脱水。
   3. 每天更换含抗生素和葡萄糖调味饮料粉的饮水，并将小鼠转移至新的经高压灭菌的笼具中。
      注意：小鼠具有食粪行为，每日更换笼具可防止其通过粪便重新接种肠道细菌。
   4. 为实现类人肠道微生物组的最佳定植，持续给予抗生素14天。在抗生素处理期间，监测小鼠的体重减轻和脱水情况。通常在前3–4天内出现体重下降，之后在整个处理期间趋于稳定。若发生脱水，应通过腹腔注射给予小鼠生理盐水或林格氏液。
      注意：其他肠道微生物组人源化方案采用口服灌胃给予抗生素。尽管该方法在清除小鼠肠道细菌方面有效，但我们发现，将抗生素加入饮水中这一较非侵入性的方法对人源化小鼠造成的应激更小，并可获得更优的实验结果。

4. 供体样本与粪便移植

1. 准备人类供体粪便样本。
   1. 使用经过适当制备的粪便微生物群移植（FMT）材料，用于向人源化小鼠进行粪便移植。
   2. 在厌氧环境中，于厌氧工作站内解冻FMT制剂并进行分装。
   3. 如需要，可在本步骤将等量的粪便样本混合，以制备无偏倚的"人类"样本。
   4. 尽量减少FMT材料的冻融次数；若无需分装或混合样本，则仅在操作前立即解冻。
2. 人类粪便移植
   1. 完成为期14天的抗生素处理后，将小鼠的饮用水更换为高压灭菌水，并将小鼠转移至新的高压灭菌笼具中。停止每日更换笼具，改为每1-2周更换一次笼具。
   2. 在停止抗生素处理后的24小时和48小时，分别进行两次粪便移植。
   3. 抗生素处理结束后24小时，解冻所需量的FMT材料，通过口服灌胃方式给予每只小鼠200 μL的FMT材料。在抗生素处理后48小时重复该操作一次。
   4. 将任何剩余或解冻后多余的FMT材料涂抹于人源化小鼠的毛发上或笼具垫料中。

5. 新鲜粪便样本采集

1. 在将单个纸袋转移至通风橱之前，先进行高压灭菌处理。
2. 在通风橱内，将每只小鼠分别放入单独的纸袋中，让小鼠自然排便。
3. 使用无菌镊子将粪便样本收集至1.5 mL塑料管中，并于-80 °C冷冻保存。随后将小鼠放回独立通气隔离笼具中。
   注意：该粪便样本采集方法可在不施加任何应激性操作的情况下，从单只小鼠获取新鲜粪便样本。

结果

图1展示了构建双人源化BLT小鼠的方法概要，并简要描述了向NSG小鼠添加功能性人源免疫系统和稳定的人样肠道微生物组的过程。图2展示了术后10周人源化BLT小鼠外周血流式细胞术分析的一个示例。图3展示了用于移植肠道微生物组以构建双人源化小鼠的人类粪便供体样本的相对丰度。图4展示了抗生素处理对脾脏和盲肠引起的表型变化，类似于在无菌动物中观察到的现象。图5展示了16S rRNA测序数据的主成分分析（PCA）图，显示双人源化小鼠具有与人类供体样本相对应的独特人样肠道微生物组。

讨论

本文所述方案用于构建双人源化BLT小鼠，此类小鼠同时具有功能性的人免疫系统和稳定的人类肠道微生物组。该方案可适用于其他人源化或非人源化小鼠模型，且无需无菌动物和无特定病原体设施。尽管此处描述的方法相对简单，但成功构建双人源化BLT小鼠仍需注意若干关键细节。NSG小鼠免疫缺陷极为严重，预防感染是确保小鼠长期存活的关键。我们采取了以下措施以防止感染：首先，动物饲养于配备高效微粒空气（HEPA）过滤器（0.22 μm）的独立微隔离笼具中，笼架系统具备空气交换率调控功能，并置于专用动物房内。笼架的空气处理系统包含预过滤器，以及经HEPA过滤（0.22 μm）的送风与排风系统，同时对笼具排风的温度和相对湿度进行实时在线监测。其次，所有进入动物房的人员必须淋浴，并穿戴洁净的刷手服和鞋子，同时佩戴手套、一次性Tyvek防护服、鞋套、头帽和面罩。第三，所有操作（包括换笼、添加食物和水）均在II级A2型生物安全柜内进行，操作前使用70%乙醇和紫外线对安全柜进行预消毒。第四，存活手术过程中采用无菌外科技术，外科医生及助手需额外穿戴手术衣和手套等防护装备。手术在已消毒的生物安全柜中进行，仅使用无菌器械、纱布和伤口闭合材料，并在整个手术过程中维持手套和器械的无...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物喂养针头 18G	Cadence Science	9928B
Clidox-s 活化剂	Pharmacal Research Laboratories	95120F
Clidox-s 基础液	Pharmacal Research Laboratories	96125F
DGM 108 笼架	Techniplast
扁平棕色购物袋 3-5/8"D × 6"W × 11-1/16"L	格雷格纳	12R063
FMT 上消化道递送菌群制备	OpenBiome	FMP30
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hCD3-PE	Biolegend	300408
hCD4-Alexa 700	Biolegend	300526
hCD45-FITC	Biolegend	304006
hCD8-APC/Cy7	Biolegend	301016
乳酸钠林格溶液	Boston BioProducts 公司	PY-906-500
mCD45-APC	Biolegend	103111
Microvette 100 K3E	Microvette	20.1278.100
新孢素急救抗生素/止痛软膏	Neosporin
NSG小鼠（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ）	杰克逊实验室	005557
PrecisionGlide 25 G 针头	BD	305127
RS200 X射线辐照仪	RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 微隔离笼具	Techniplast
无菌非织造纱布	Fisherbrand	22-028-558
Teklad 全球 16% 蛋白质辐照小鼠饲料	Teklad	2916