在明确定义的剪切应力下进行单细胞离子电流的电生理记录

摘要

本实验方案的目的是描述一种改良的平行板流动室，用于研究剪切应力对机械敏感性离子通道的实时激活作用。

摘要

流体剪切应力在内皮细胞功能中起着重要作用，这一点已广为人知。在大多数血管床中，血流急性增加所导致的剪切应力升高会触发一系列信号级联反应，引起血管舒张，从而减轻血管壁上的机械应力。剪切应力的模式也被证实是动脉粥样硬化发展过程中的关键因素，其中层流剪切应力具有抗动脉粥样硬化作用，而扰动剪切应力则促进动脉粥样形成。尽管我们对各种中间细胞信号通路已有较为深入的理解，但将机械刺激最初转化为化学介质的受体尚未被完全阐明。机械敏感性离子通道在响应剪切应力中至关重要，可调控剪切诱导的细胞信号传导，从而控制血管活性介质的生成。这些通道是剪切作用下最早被激活的信号组分之一，已被证实可通过促进一氧化氮生成（例如内向整流性K⁺ [Kir]通道和瞬时受体电位[TRP]通道）以及内皮超极化因子的产生（例如Kir通道和钙激活K⁺ [KCa]通道）介导剪切诱导的血管舒张；同时，通过涉及Piezo通道但机制尚不明确的途径介导剪切诱导的血管收缩。阐明这些通道如何被剪切力激活的生物物理机制（即直接激活或通过初级机械感受器间接激活），可能为解决内皮功能障碍和动脉粥样形成相关的病理生理过程提供潜在的新靶点。利用电生理学技术实时记录流体诱导的离子通道激活仍是一项重大挑战。传统的施加明确定义剪切应力的方法，如锥板式流变仪和封闭式平行板流动腔室，均无法实现对离子通道激活过程的实时研究。本实验方案的目标是描述一种经过改进的平行板流动腔室，可在明确定义的剪切应力条件下实现对机械敏感性离子通道的实时电生理记录。

引言

血流产生的血流动力学力在内皮细胞和血管功能中发挥重要作用，这是众所周知的^1,2。同样广为人知的是，多种类型的离子通道会迅速响应剪切应力的变化^3,4,5，由此提出了离子通道可能是剪切应力的主要感受器的假说。最近，我们及其他研究者发现，机械敏感性离子通道在多种对剪切应力敏感的血管功能中起关键作用，包括对剪切应力的血管活性反应^6,7,8以及发育性血管生成⁹。然而，离子通道对剪切应力敏感性的机制几乎完全未知。这一知识空白很可能源于在明确定义的剪切应力条件下进行电生理记录的技术难度。因此，本文提供了一套我们在实验室中常规使用的、实现该目标的详细分步操作方案^6,7,10,11。

本方法的总体目标是能够在生理范围内的明确定义的剪切应力条件下，实时研究离子通道的机械激活。通过改造标准的平行板流动室，使电生理记录微电极可在细胞实时暴露于流体的同时置入腔室并接触生长在底板上的细胞，从而实现这一目标^6,7,11。相比之下，先前文献中描述的标准平行板流动室可用于在剪切力作用下对细胞进行实时成像分析¹²或其他非侵入性研究方法^13,14，但无法用于电生理记录。同样，锥板装置作为另一种施加剪切应力的有效方法^15,16，也不适用于电生理记录。因此，这些流动装置均无法用于研究离子通道对剪切应力的敏感性。在流动条件下进行电生理记录的主要困难，是导致目前关于这些关键效应机制的信息极为匮乏的主要原因。

在实现相同目标的替代方法中，目前尚无任何方法在准确性和可控性方面能与之媲美。一些早期研究曾尝试通过将另一支移液管从细胞上方靠近并释放液流，使细胞暴露于液体流动中，从而记录离子通道活性^17,18。然而这种方法极不生理，因为在该条件下产生的机械力与血管内生理性的剪切应力分布几乎没有共同之处。类似的问题也存在于通过开放式灌注腔室模拟生理性剪切应力的尝试中。正如我们在先前研究中详细讨论的那样¹⁰，开放的液-气界面会引发多种扰动和涡流回旋，这些均不符合生理状态。为解决上述所有问题，我们设计了一种改良型平行板（MPP）流动腔室，在我们之前的研究中也被称为“微创流动装置”^6,7,10,11，该装置由丙烯酸材料制成，并在本实验室得到广泛使用。然而，尽管该装置的原始设计描述已发表近20年，且是目前唯一能够在明确定义的剪切应力条件下进行电生理记录的流动装置，但此方法尚未被其他实验室采纳，仅有极少数研究尝试在流动条件下记录离子电流。因此，我们认为，提供MPP流动腔室的详细使用说明，将对致力于机械敏感性离子通道与血管生物学研究的科研人员大有裨益。

方案

本研究中使用动物的方案已获得伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理委员会批准（编号：#16-183）。

1. 改良平行板流动腔的组装

注意：请参考表1和图1以获取MPP流室组件的编号。请参考图1中的示意图，了解组装过程中各室组件的排列方向。

1. 将500 µL硅胶弹性体固化剂充分混入5 mL硅胶弹性体基础液中，配制硅胶弹性体溶液，用于将矩形盖玻片D粘附至部件C的底部。
2. 在部件C的矩形区域边缘均匀涂布一层薄薄的硅胶弹性体溶液，然后轻轻将矩形盖玻片D直接放置于该弹性体溶液上，确保D完全覆盖C的开口矩形区域。小心擦去多余的硅胶弹性体溶液。
3. 重复步骤1.2，将矩形盖玻片F粘附至部件E的底部，并在室温下静置过夜，使硅胶弹性体溶液充分固化。
   注意：固化后，矩形盖玻片可牢固粘附长达六个月，之后才需更换。
4. 从底部腔室部件E开始，按以下顺序依次叠加各部件，组装MPP流动腔：部件E（底部）、部件C、部件B、部件A（顶部）。
5. 对齐各部件角落处的螺丝孔，并用螺丝紧密固定，以防止向MPP流动腔施加流体时发生泄漏。

2. 细胞准备及接种至MPP流动室

注意：培养的内皮细胞请按照步骤 2.1−2.7 进行操作。从小鼠肠系膜动脉弓分离内皮细胞并制备新鲜分离的内皮细胞，请按照步骤 2.8−2.14 中详述的方法进行操作。

1. 在6孔板中，每孔放置4至5个12 mm的盖玻片，并将细胞以10%至30%的融合度接种，以便能够对单个细胞进行电生理记录。
2. 将细胞在标准培养条件（5% CO₂，37 °C）下孵育，时间不少于2小时，以使细胞贴壁；但不超过24小时，因为根据作者的经验，内皮细胞在亚融合状态下培养超过24小时后会变得非常扁平，难以进行膜片钳操作。
3. 从6孔板的一个孔中取出带有贴壁细胞的盖玻片，迅速用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后转移至含有2 mL电生理浴液（表2）的35 mm培养皿中，再将其转移至MPP流动室。
4. 将盖玻片转移至MPP流动室的矩形盖玻片（部件D）上，该部件已粘附于流动室的部件C，确保有足够溶液保留在盖玻片上，防止细胞暴露于空气中。加入所需浴液（约250 µL），使盖玻片及细胞完全浸没于溶液中。
5. 将盖玻片放置在靠近真空储液池一侧的半边位置，以确保细胞与部件B的狭缝开口对齐。确保盖玻片通过溶液与玻璃之间的粘附力牢固贴附于部件D，从而在施加流动时不会导致盖玻片移位。
6. 按照步骤1.4和1.5所述顺序并参照图1所示，将MPP流动室各部件旋紧组装。将组装好的流动室转移至显微镜载物台上，并立即用浴液灌注流动室，使液体到达真空储液池以进行吸引（约10 mL）。
7. 通过识别具有深色边缘和明显细胞核的细胞，选择一个健康的细胞用于实验。避免选择出现起泡现象或与其他细胞接触的细胞。
   注意：在作者的实验室中，使用的是人主动脉内皮细胞和原代小鼠肠系膜动脉内皮细胞。然而，任何其他与特定研究需求相关的贴壁细胞类型也可采用相同方法使用。
8. 用解离液（表2）清洗分离的动脉弓。将动脉弓转移至含有2 mL预热（37 °C）解离液的2 mL离心管中（解离液配方见表2），其中包含中性蛋白酶（0.5 mg/mL）和弹性蛋白酶（0.5 mg/mL）。在37 °C下孵育1小时，每10分钟轻轻振荡一次。
9. 移除1 mL中性蛋白酶/弹性蛋白酶解离液，加入1 mg/mL I型胶原酶。将胶原酶溶液重新加入含有动脉的溶液中，使最终I型胶原酶浓度为0.5 mg/mL。在37 °C下孵育2−3分钟。
10. 使用5号镊子，迅速将动脉弓转移至一个直径为35 mm的培养皿中，其中含有750 µL新鲜且预冷的解离液。使用两根20 G注射器针头通过机械方式进一步解离组织，从酶消化后的动脉中释放内皮细胞。
11. 使用一支9英寸一次性巴斯德玻璃移液管，将细胞悬液吹打10次，然后用该玻璃移液管将细胞转移至新的1.5 mL离心管中。
12. 用另外750 µL解离液冲洗培养皿，并将冲洗液转移至同一离心管中。使用玻璃移液管进一步通过反复吹打（至少10次）机械分散细胞，形成单细胞悬液，注意避免引入可能损伤内皮细胞完整性的气泡。
13. 直接将750 µL内皮细胞悬液（约500−1,000个细胞）加入MPP流动室的部件D上，靠近储液池真空侧的一半区域。在室温下静置45分钟至1小时，使内皮细胞贴壁。
14. 按照步骤1.4和1.5所述顺序并参照图1所示，将MPP流动室各部件旋紧组装。将组装好的流动室转移至显微镜载物台上，并立即用浴液灌注流动室，使液体到达真空吸引端（约10 mL）。通过细胞粗糙且呈圆形的表型识别可记录的内皮细胞^19,20。
    注意：已有多种消化方法和酶混合方案被用于从不同动脉床中分离内皮细胞。详见表3，其中列出了多位研究者用于分离内皮细胞以进行机械敏感性离子通道膜片钳电生理研究的具体操作方案。这些方法很可能适用于与MPP流动室联合使用。

3. 控制MPP流动室中的剪切应力以记录剪切力激活的机械敏感性离子通道的电生理学实验

1. 通过将一个30 mL带刻度的注射器连接至一个三通鲁尔锁接头，并在接头上安装适合插入MPP室部件A直径为3 mm进液孔的微孔管（内径：0.05英寸，外径：0.09英寸），搭建重力灌注系统。
2. 将量筒固定在电生理设备周围的法拉第笼外侧图2）使用双面胶带。在将管路插入MPP腔室之前，先用灌流液预充满注射器和管路（参见 表2 用于研究内向整流钾通道的灌流溶液⁺ 内皮细胞中的通道）。将管路插入A部件的MPP流动室入口孔中。
3. 预先用溶液填充MPP流室，使溶液流入真空储液罐中。停止向流室供液，并将量筒重新加液至最上方刻度线。通过让溶液流经流室，并使用秒表记录在特定注射器筒高度下溶液流出的毫升数/秒，手动计算流速。
4. 调节注射器的高度以改变流速，从而改变腔室内的剪切力，并持续此过程直至达到所需的剪切应力水平。
5. 使用以下公式计算平行腔室中的剪切应力²¹:
   τ = 6µQ/h²w
   其中，µ 为流体黏度（g/cm·s），Q 为流速（mL/s），平行板腔的宽度（w = 2.2 cm）和高度（h = 0.1 cm）。
   注意： 在当前的重力灌注系统中，当注射器筒高度（从筒顶部测量）高于显微镜载物台57 cm时，流速为0.3 mL/s。在此注射器筒高度和流速下，灌注腔室内计算得到的剪切力为0.7 dyn/cm²需要注意的是，也可使用其他灌流系统（如蠕动泵）来控制向MPP流室输送液体的流速。然而，这些设备可能会引入不必要的湍流，从而影响在流动条件下进行的电生理测量的稳定性，因此建议使用本文所述的重力灌流系统。
6. 将已接种贴壁细胞的组装腔室转移至电生理设备的显微镜载物台上，并将预先充满灌流液的管路插入A部件的孔中。通过旋转三通鲁尔锁接头使液体流向腔室，用10 mL灌流液同时灌注腔室并清洗细胞。
7. 在获得理想的膜片构型后，于室温静置浴液中使通道电流稳定。待电流稳定后，逐步施加剪切力，每次增加剪切力前需等待电流达到稳定状态。
   注意： 作者在研究内皮细胞中的机械激活离子通道时，发现采用穿孔膜片钳构型效果最佳。进行穿孔全细胞膜片钳记录时，将5 µL浓度为60 mg/mL的两性霉素B二甲基亚砜（DMSO）储备液加入1 mL经0.2 µm无菌过滤的移液管溶液中。在形成细胞贴附构型的吉欧姆密封后，穿孔全细胞膜片通常在2−5分钟内形成。
8. 通过停止向腔室灌注流体，消除细胞所受的剪切力，使机械敏感性通道电流恢复至静态浴液中观察到的基线水平。
9. 通过改变溶液价态（例如 60 mM K⁺ 在无钙浴液中²⁺ 在移液管溶液中研究内向整流性 K+ 通道。 表2 显示示例溶液配方）和/或通过药理学方法抑制潜在的污染电流来源。

结果

上图（上图面板）和下图（下图面板）分别展示了显微镜载物台上MPP流动室的不同视角的多张照片以及MPP流动室的示意图（图1）。该示意图详细标明了整个装置及流动室的尺寸。图2展示了本实验室中重力灌注系统连接MPP流动室的照片（上图面板），以及流动系统的示意图（下图面板），旨在突出显示将流动室中的细胞与灌注系统溶液冲击力以及溶液负压移除力隔离开的关键步骤。

机械敏感性离子通道的一个显著特征是，当机械刺激停止时，其活动会迅速恢复至基线水平^3,6,7。图3展示了一个示例：在从新鲜分离的内皮细胞记录Ki...

讨论

血管系统持续暴露于活跃的血流动力学力作用下，这些力可激活机械敏感性离子通道^3,22，但这些通道在剪切应力诱导的机械转导中的生理作用才刚刚开始被揭示^4,6,8。目前尚不清楚介导剪切应力激活通道机械敏感性的具体机制。本文详细描述了一种用于实时直接研究暴露于层流剪切应力下的机械敏感性离子通道的方法。

本方案的关键且必要的步骤是使用一种经过改进的平行板流动腔室，该腔室具有狭窄的开口，可使电生理移液管下降进入腔室，并在流动条件下接触细胞。该装置的基本原理是，如果开口足够窄，由于表面张力的作用，即使不发生溶液溢出，也能实现生理剪切应力（最高达 15 dyn/cm²）¹⁰。为了成功进行这些实验，以下几点至关重要：(i) 将细胞接种在底板上正对开口下方的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 无菌注射器滤器	VWR	28145-501	用于过滤电生理记录用移液管溶液
5号镊子	Fine Scientific Tools	1252-30	用于将消化后的动脉转移至新鲜溶液中
9" 巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20D	用于机械性分散消化后的动脉，并转移新分离的内皮细胞
直径12 mm的圆形盖玻片	Fisher Scientific	12-545-80	适用于涉及培养细胞及多种处理的实验研究。细胞贴附于盖玻片上，用于膜片钳分析
24 mm × 40 mm 矩形盖玻片	Sigma-Aldrich	CLS2975224	用于添加至MPP流动室组件C中（图1）
24 mm × 50 mm 矩形盖玻片	Sigma-Aldrich	CLS2975245	用于添加至MPP流动室组件E中（图1）
20 G注射器针头	Becton Dickinson and Co	305175	用于机械性分散消化后的肠系膜动脉
35 mm培养皿	Genesee Scientific	32-103	用于机械性分散消化后的肠系膜动脉
两性霉素B（已溶解）	Sigma-Aldrich	A9528-50MG	用于建立穿孔式全细胞膜片钳构型
胶原酶I型	Worthington Biochemical	100 mg - LS004194	本实验室在中性蛋白酶和弹性蛋白酶初步消化后，用于短暂消化的酶
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific	67-68-5	穿孔式全细胞膜片钳实验中用于溶解两性霉素B的溶剂
弹性蛋白酶（冻干粉）	Worthington Biochemical	25 mg - LS002290	本实验室用于与中性蛋白酶/分散酶组成酶混合液，启动动脉消化以分离内皮细胞
Falcon 组织培养板，6孔，平底，带低蒸发盖	Corning	353046	适用于涉及培养细胞及多种处理的实验研究
中性蛋白酶/分散酶	Worthington Biochemical	10 mg - LS02100；50 mg - LS02104	本实验室用于与弹性蛋白酶组成酶混合液，启动动脉消化以分离内皮细胞
Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	硅胶弹性体，用于将矩形盖玻片粘附至MPP流动室组件C和E上（图1）
Tygon ND 10-80 管路	Microbore Tubing	AAQ04133	内径：0.05 in，外径：0.09 in，作为灌流系统的进液管路，用于向腔室施加流动