本实验方案的目的是描述一种改良的平行板流动室，用于研究剪切应力对机械敏感性离子通道的实时激活作用。
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摘要
摘要
流体剪切应力在内皮细胞功能中起着重要作用，这一点已广为人知。在大多数血管床中，血流急性增加所导致的剪切应力升高会触发一系列信号级联反应，引起血管舒张，从而减轻血管壁上的机械应力。剪切应力的模式也被证实是动脉粥样硬化发展过程中的关键因素，其中层流剪切应力具有抗动脉粥样硬化作用，而扰动剪切应力则促进动脉粥样形成。尽管我们对各种中间细胞信号通路已有较为深入的理解，但将机械刺激最初转化为化学介质的受体尚未被完全阐明。机械敏感性离子通道在响应剪切应力中至关重要，可调控剪切诱导的细胞信号传导，从而控制血管活性介质的生成。这些通道是剪切作用下最早被激活的信号组分之一，已被证实可通过促进一氧化氮生成（例如内向整流性K+ [Kir]通道和瞬时受体电位[TRP]通道）以及内皮超极化因子的产生（例如Kir通道和钙激活K+ [KCa]通道）介导剪切诱导的血管舒张；同时，通过涉及Piezo通道但机制尚不明确的途径介导剪切诱导的血管收缩。阐明这些通道如何被剪切力激活的生物物理机制（即直接激活或通过初级机械感受器间接激活），可能为解决内皮功能障碍和动脉粥样形成相关的病理生理过程提供潜在的新靶点。利用电生理学技术实时记录流体诱导的离子通道激活仍是一项重大挑战。传统的施加明确定义剪切应力的方法，如锥板式流变仪和封闭式平行板流动腔室，均无法实现对离子通道激活过程的实时研究。本实验方案的目标是描述一种经过改进的平行板流动腔室，可在明确定义的剪切应力条件下实现对机械敏感性离子通道的实时电生理记录。
引言
血流产生的血流动力学力在内皮细胞和血管功能中发挥重要作用，这是众所周知的1,2。同样广为人知的是，多种类型的离子通道会迅速响应剪切应力的变化3,4,5，由此提出了离子通道可能是剪切应力的主要感受器的假说。最近，我们及其他研究者发现，机械敏感性离子通道在多种对剪切应力敏感的血管功能中起关键作用，包括对剪切应力的血管活性反应6,7,8以及发育性血管生成9。然而，离子通道对剪切应力敏感性的机制几乎完全未知。这一知识空白很可能源于在明确定义的剪切应力条件下进行电生理记录的技术难度。因此，本文提供了一套我们在实验室中常规使用的、实现该目标的详细分步操作方案6,7,10,
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方案
本研究中使用动物的方案已获得伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理委员会批准（编号：#16-183）。
1. 改良平行板流动腔的组装
注意：请参考表1和图1以获取MPP流室组件的编号。请参考图1中的示意图，了解组装过程中各室组件的排列方向。
- 将500 µL硅胶弹性体固化剂充分混入5 mL硅胶弹性体基础液中，配制硅胶弹性体溶液，用于将矩形盖玻片D粘附至部件C的底部。
- 在部件C的矩形区域边缘均匀涂布一层薄薄的硅胶弹性体溶液，然后轻轻将矩形盖玻片D直接放置于该弹性体溶液上，确保D完全覆盖C的开口矩形区域。小心擦去多余的硅胶弹性体溶液。
- 重复步骤1.2，将矩形盖玻片F粘附至部件E的底部，并在室温下静置过夜，使硅胶弹性体溶液充分固化。
注意：固化后，矩形盖玻片可牢固粘附长达六个月，之后才需更换。 - 从底部腔室部件E开始，按以下顺序依次叠加各部件，组装MPP流动腔：部件E（底部）、部件C、部件B、部件A（顶部）。
- 对齐各部件角落处的螺丝孔，并用螺丝紧密固定，以防止向MPP流动腔施加流体时发生泄漏。 ....
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结果
上图展示了显微镜载物台上MPP流动室的不同视角照片（上图），以及MPP流动室的示意图（下图）（图1）。示意图详细标明了整个装置及流动室的尺寸。图2展示了本实验室中重力灌流系统连接至MPP流动室的照片（上图），以及流动系统的示意图（下图），旨在突出显示将流动室中的细胞与灌流系统溶液快速流入及溶液负压移除力隔离开的关键步骤。
机械敏感性离子通道的一个显著特征是在机械刺激停止后迅速恢复至基线水平3,6,7. 图3 以新鲜分离的内皮细胞中Kir电流的电生理记录为例，结果显示，在记录过程中撤除剪切应力.......
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讨论
血管系统持续暴露于活跃的血流动力学力作用下，这些力可激活机械敏感性离子通道3,22，但这些通道在剪切应力诱导的机械转导中的生理作用才刚刚开始被揭示4,6,8。目前尚不清楚介导剪切应力激活通道机械敏感性的具体机制。本文详细描述了一种用于实时直接研究暴露于层流剪切应力下的机械敏感性离子通道的方法。
本方案的关键且必要的步骤是使用一种经过改进的平行板流动腔室，该腔室具有狭窄的开口，可使电生理移液管下降进入腔室，并在流动条件下接触细胞。该装置的基本原理是，如果开口足够窄，由于表面张力的作用，即使不发生溶液溢出，也能实现生理剪切应力（最高达 15 dyn/cm2）10。为了成功进行这些实验，以下几点至关重要：(i) 将细胞接种在底板上正对开口下方的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国家心肺血液研究所（R01 HL073965，IL）和（T32 HL007829-24，ISF）资助。作者还要感谢伊利诺伊大学芝加哥分校科学机械加工车间，为我们制作了最新的MPP流动腔室。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µm 无菌注射器滤器 | VWR | 28145-501 | 用于过滤电生理记录用移液管溶液 |
| 5号镊子 | Fine Scientific Tools | 1252-30 | 用于将消化后的动脉转移至新鲜溶液中 |
| 9" 巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20D | 用于机械性分散消化后的动脉，并转移新分离的内皮细胞 |
| 直径12 mm的圆形盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-80 | 适用于涉及培养细胞及多种处理的实验研究。细胞贴附于盖玻片上，用于膜片钳分析 |
| 24 mm × 40 mm 矩形盖玻片 | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | 用于添加至MPP流动室组件C中（图1） |
| 24 mm × 50 mm 矩形盖玻片 | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | 用于添加至MPP流动室组件E中（图1） |
| 20 G注射器针头 | Becton Dickinson and Co | 305175 | 用于机械性分散消化后的肠系膜动脉 |
| 35 mm培养皿 | Genesee Scientific | 32-103 | 用于机械性分散消化后的肠系膜动脉 |
| 两性霉素B（已溶解） | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | 用于建立穿孔式全细胞膜片钳构型 |
| 胶原酶I型 | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | 本实验室在中性蛋白酶和弹性蛋白酶初步消化后，用于短暂消化的酶 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Fisher Scientific | 67-68-5 | 穿孔式全细胞膜片钳实验中用于溶解两性霉素B的溶剂 |
| 弹性蛋白酶（冻干粉） | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | 本实验室用于与中性蛋白酶/分散酶组成酶混合液，启动动脉消化以分离内皮细胞 |
| Falcon 组织培养板，6孔，平底，带低蒸发盖 | Corning | 353046 | 适用于涉及培养细胞及多种处理的实验研究 |
| 中性蛋白酶/分散酶 | Worthington Biochemical | 10 mg - LS02100；50 mg - LS02104 | 本实验室用于与弹性蛋白酶组成酶混合液，启动动脉消化以分离内皮细胞 |
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | 硅胶弹性体，用于将矩形盖玻片粘附至MPP流动室组件C和E上（图1） |
| Tygon ND 10-80 管路 | Microbore Tubing | AAQ04133 | 内径：0.05 in，外径：0.09 in，作为灌流系统的进液管路，用于向腔室施加流动 |
参考文献
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G.
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