使用自动训练器评估小鼠的熟练抓握能力

摘要

评估训练对运动技能影响的方法是一种有用的工具。然而，大多数行为学评估方法可能劳动强度大和/或成本较高。本文介绍了一种用于评估小鼠抓握（伸手抓取）技能的机器人方法。

摘要

我们介绍了一种使 naïve 小鼠学习新型抓握（伸手抓取）任务的方法。将小鼠单独饲养在带有前部狭缝的笼子中，该狭缝允许小鼠伸出爪子并从笼外取回食物颗粒。采用轻微的食物限制以促使小鼠通过狭缝获取食物。当小鼠开始将靠近狭缝与获取食物联系起来时，实验人员手动将食物颗粒移开，以刺激其前肢伸展和旋前，从而通过前部狭缝抓取并取回颗粒。当小鼠在食物颗粒到达狭缝时开始主动伸手抓取，即可通过测量其成功抓取和取回目标颗粒的速率来进行行为学检测。随后，将小鼠引入一种自动训练装置，该装置可自动向小鼠提供食物颗粒，并自动记录成功与失败的伸手和抓取尝试。这种方法可轻松收集多只小鼠的伸手行为数据，供后续实验分析使用。

引言

在神经损伤前后实验性地检测运动技能，并调控运动训练的时间、强度和类型，这些方法对转化研究具有重要意义。在过去十年中，由于小鼠易于进行遗传操作，已成为阐明损伤前后运动学习机制的常用模型系统。然而，小鼠的行为学检测方法尚未像其他哺乳动物（尤其是大鼠）那样得到充分优化。此外，小鼠与大鼠在行为上存在重要差异，这强烈提示应采用不同的训练方式对这两个物种进行训练^1,2。

熟练的抓握动作利用手或前爪将食物送入嘴中、操控物体或使用工具。事实上，在日常生活中伸手抓取各种物体是上肢的一项基本功能，而伸手进食行为是一种许多哺乳动物都具备的抓握形式。目前，科学界已明确界定了许多与抓握技能习得相关的遗传、生理和解剖学变化³。在将临床前研究成果转化为临床应用的过程中，需要一种高效且可重复的相关检测方法。啮齿类动物和人类伸手行为的研究表明，人类与动物的抓握行为具有相似性⁴。因此，这些相似性提示，抓握测试可作为研究运动学习以及人类疾病损害与治疗的转化模型。因此，在小鼠中评估抓握能力可为研究健康与疾病状态的转化研究提供一种强有力的工具⁴。

遗憾的是，即使在小规模实验室环境中，小鼠的抓握任务也可能非常繁琐且耗时。为了解决这一问题，本文介绍了一种自动化的抓握任务方法。该任务要求小鼠通过其饲养笼前部的狭缝伸出单只前爪，将伸出的前爪旋前，抓取食物颗粒奖励，并将颗粒拉回笼内进行摄食。实验结果以抓握成功或失败的形式呈现。该自动化系统能够成功记录数据，显著减轻研究人员参与该任务所需的工作负担和时间投入。

方案

本文所述所有方法均已获得约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。

1. 准备小鼠笼具以供使用

1. 在每个笼子前端底部位置创建一个尺寸为0.8 cm宽、7 cm高的狭缝开口，如图1所示。该狭缝作为动物伸出肢体的通道。
   注意：自动训练装置的设计适用于大多数实验动物供应商提供的标准小鼠笼具尺寸（如图1所示）。此外，该装置也可轻松适配其他类型的笼具。
2. 在每个独立笼具内部，紧邻狭缝处设置一个平台，以便小鼠站立并获取提供的颗粒饲料。确保平台位于笼底垫料层之上，高度约为3 cm。可使用强力胶将培养皿固定，并在其上方覆盖一块约10 cm × 15 cm的金属板作为平台；但任何足够平坦且面积足以让小鼠站立并伸爪取食的表面均可使用。
3. 在笼子前壁中央切割一个垂直凹槽，宽度为0.8 cm，高度为7 cm，以便小鼠能够将前肢伸出笼外。
4. 使用一块薄金属板（厚度约2 mm），将其切割成5 cm × 10 cm的矩形，作为标准化的开口结构，供动物伸爪通过。
   注意：小鼠可能会啃咬塑料笼具，导致开口尺寸发生变化。在测试过程中，将金属笼门用胶带固定于笼具的狭缝开口上时，小鼠将通过这个0.8 cm宽的狭缝伸爪，从而保证不同笼具间有效开口宽度的一致性。
5. 当小鼠未进行测试时，应使用胶带覆盖笼具上的狭缝，以防止垫料从笼内被抛出。

2. 让小鼠适应抓取动作

1. 记录每只小鼠的初始体重，并计算其初始体重的85%以确定目标体重；若计算结果小于20 g，则将目标体重向上取整至20 g。制定喂养方案，使小鼠达到并维持该目标体重。
   1. 第一天每只小鼠给予2.5 g饲料颗粒，24小时后记录其体重变化。
      注意：每天称重一次，预期每日体重下降0.25–1 g。
   2. 根据初始体重变化及后续每日体重变化，相应调整每只小鼠的每日饲料量，以实现渐进性减重（每日减重少于0.8 g），并维持最终的目标体重。每日饲料量可在三至六粒500 mg颗粒（1.5–3.0 g）之间调整，以达到有效控制。
      注意：在整个实验过程中，小鼠需持续维持此饮食方案以保持目标体重。
2. 当小鼠达到目标体重后，开始训练其前往带门控的狭缝处获取补充性饲料颗粒的概念。训练时，将一颗45 mg的颗粒置于狭缝正前方的颗粒放置面上，允许小鼠自行取食。大多数小鼠可在1–2天内适应此种喂食方式。
3. 一旦小鼠将狭缝开启与喂食建立关联，即应鼓励其使用前肢而非口部进行取食。
   注意：此步骤最为复杂，通常需要1–2天，且极易因操作不当而使小鼠形成不利行为；请参阅讨论部分以获取进一步信息与建议。
   1. 使用一对镊子，将一颗饲料颗粒置于小鼠此前习惯取食的位置。当小鼠开始咬取颗粒时，将其移开约0.5厘米，使颗粒脱离其口部可及范围。
      注意：处于目标体重的小鼠会尝试获取无法触及的颗粒。每当小鼠通过狭缝伸出前肢时，即应通过允许其进食颗粒来强化该行为。部分小鼠在取食时可能表现出对某一前肢的偏好。
   2. 尽管前肢偏好记录并非实验必需，但仍建议记录其使用左肢或右肢的倾向。这可能有助于提高行为检测的整体成功率；或者，为消除变量，可强制所有小鼠使用同侧前肢进行取食。
      注意：若允许小鼠使用其偏好的前肢，通常可获得更佳的实验结果。
   3. 随着小鼠逐渐将前肢伸展动作与进食建立关联，应进一步强化该行为：当小鼠尝试使用口部或舌头取食时，不予提供颗粒。小鼠通常会在2至3天内开始遵循此规则。
   4. 通过将45 mg颗粒放置于笼门边缘外侧不足1 cm处，完成目标前肢取食行为的最终训练。具体位置应使颗粒最左侧或最右侧边缘（从实验者视角看，分别位于笼狭缝的左侧或右侧）与笼门狭缝边缘向外延伸的直线相切。允许小鼠尝试取食颗粒，但若其使用非前肢伸展的方式尝试获取，应立即移除颗粒并阻止其进食。
      注意：当小鼠能够持续伸出前肢并触碰到所提供的颗粒时，即可使用下文所述的自动训练装置及其相关行为检测方法进行测试。从小鼠初次接触至准备就绪所需时间因个体而异；若某些小鼠超过两周仍未能掌握，应将其从数据集中剔除。

3. 使用自动训练仪

注意：有关自动训练仪的硬件、软件及其物理操作的完整描述，请参见图1-3及讨论部分。

1. 准备训练实验。
   1. 校准诱饵颗粒传感器。在 LabVIEW 界面中点击运行箭头，记录放置颗粒与未放置颗粒时的传感器读数。点击停止按钮以结束本次测试运行，并将诱饵颗粒传感器的目标值设置为这两个读数之间的数值（图3 和 Table 2）。大多数光照条件下，读数介于 1 至 4 之间。
   2. 将改造后的小鼠笼具放置在自动训练仪上（图2）。安装笼门（图1），并将颗粒对准狭缝边缘，操作方式与手动程序相同。
2. 使用 LabVIEW 界面运行小鼠的训练实验。
   1. 根据需要输入信息，以记录训练实验的相关数据（图3 和 Table 2）。
      1. 点击小鼠编号字段，使用计算机键盘输入每次训练实验的文件名。
      2. 点击常规程序中需分配的总颗粒数字段，以控制单次实验中分配的颗粒数量（通常为 20–30 颗）。可通过点击上下箭头或使用计算机键盘输入数值来设置。
      3. 点击在第几颗颗粒后暂停字段，以在指定颗粒从小跳板移除后设置 5 秒的暂停。可通过点击上下箭头或使用计算机键盘输入数值来设置。
      4. 点击暂停时长字段，以设置颗粒从小跳板移除至下一颗颗粒分配之间的时间间隔。可通过点击上下箭头或使用计算机键盘输入数值来设置。
         注：通常 1 秒为合适的暂停时间。若小鼠在每次分配颗粒后表现出焦虑，建议通过暂停时长字段将暂停时间延长至 5 秒。
      5. 在抓取距离字段中手动记录颗粒放置的距离。可通过点击上下箭头或使用计算机键盘输入数值来设置。
         注：加速度和时间数组的大小字段为调试用途而开放，可忽略。
      6. 点击日志文件保存文件夹字段，选择用于保存采集数据的文件位置。
      7. 填写完所有信息字段后，点击运行按钮以开始训练实验。自动训练仪将逐颗分配颗粒，并持续监测颗粒是否通过漏斗掉落，直至分配完设定的总颗粒数，且最后颗粒已被小鼠取走或掉落。程序将在该点自动停止。如有必要，也可通过点击停止按钮提前终止程序。
   2. 软件设置完成后，将待测小鼠的家笼放置在基座上，并观察小鼠行为，以判断其是否已学会尝试所需的新型抓取动作。点击运行按钮后，允许小鼠探索狭缝及其新的、陌生的环境。
      注：与向小鼠引入抓取概念时类似，预期不同小鼠的配合程度会有所差异。已掌握该概念的小鼠通常会在 5–10 分钟内尝试抓取，并将自动训练仪的运动与颗粒的出现相关联，正如在本实验方案初期阶段，它们将未遮挡的狭缝与食物关联一样。

结果

通常建议每次训练包含约 20-30 次试验，用户可自行设定，由自动训练器自动运行，并将每次训练 session 和每只小鼠的数据保存为单个日志文件。每次试验可依次连续进行，中间暂停 2-5 秒。在自动训练器上训练的小鼠经过 10 次训练后表现出技能的提升。

为了比较自动训练装置与手动训练（被视为金标准）的效用，我们采用手动方式和自动训练装置对年龄为100至140天的成年雄性C57bl/6小鼠进行了训练。所有动物操作和使用均依照约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会的批准进行。使用自动训练装置训练的小鼠学会了抓取任务，并表现出明显的运动技能提升（图4）。这种技能提升与未使用自动训练装置而采用手动训练时观察到的结果相似（图4）。在这些数据中，手动抓取任务的成功定义为：小鼠将前肢穿过狭缝，抓取食物颗粒并将其吃掉，且未将颗粒从初始位置碰落、...

讨论

我们的自动训练装置以自动化方式评估前肢抓取（抓握）功能。为实现这一目标，许多为小鼠抓握任务设计的参数，包括颗粒位置、颗粒大小和训练标准，已在多年中经过多次优化，并借鉴了先前的实验方案^2,5,6。本研究的进展在于利用机器人实现了任务的自动化，并可在小鼠的居住笼中进行训练。居住笼训练使小鼠保持镇静，减少焦虑，从而更有效地完成任务。非居住笼训练会增加应激反应，可能导致训练时间延长且操作精度下降^7,8,9。本文展示的实验精度与我们此前手动进行居住笼训练所获得的结果相似^5,7,8。尽管已有适用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABS 线材	定制 3D 打印	N/A	用于颗粒支架、框架、臂部和漏斗
ABS 板材	McMaster-Carr	8586K581	厚度为 3/8"；用于平台组件、定位支架导轨和底座
Adruino Mini	Adruino	A000087	纳米版本同样兼容，其他类似微控制器也可使用
台式可调高度定位支架	McMaster-Carr	9967T43	负载能力为 35 磅
透明亚克力圆管	McMaster-Carr	8532K14	内径为 3/8"
低碳 钢丝	McMaster-Carr	8855K14	直径为 0.148"
颗粒分配器	Lafayette Instrument: Neuroscience	80209-45	配备 45 mg 可更换颗粒尺寸转轮及可选支架
光电中断器分线板	SparkFun	BOB-09322 ROHS	专为 Sharp GP1A57HRJ00F 设计
反射式物体传感器	Fairchild Semiconductor	QRD1113	光电晶体管输出
舵机电机	SparkFun	S8213	通用金属齿轮（微型）
透射式光电中断器	Sharp	GP1A57HRJ00F	间隙：10 mm，狭缝：1.8 mm