本文介绍了一组用于表征与疾病相关的 RAF 家族激酶突变体的实用且可行的方法，包括体外激酶活性检测、RAF 共激活检测以及互补型分裂荧光素酶检测。
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本文内容
摘要
摘要
快速加速的纤维肉瘤（RAF）家族激酶在细胞生物学中发挥着核心作用，其功能障碍会导致癌症和发育性疾病。对与疾病相关的RAF突变体进行表征，将有助于我们为治疗这些疾病选择合适的治疗策略。近期研究表明，RAF家族激酶具有催化活性和变构活性，这些活性受到二聚化的严格调控。本文中，我们建立了一套实用且可行的方法，用于测定RAF家族激酶及其突变体的催化活性、变构活性以及相对二聚体亲和力/稳定性。首先，我们改进了经典的体外激酶活性检测方法，通过降低缓冲液中的去污剂浓度、采用温和的快速洗涤步骤，并使用谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白，防止RAF二聚体在纯化过程中解离，从而能够准确测量组成型活性RAF突变体的催化活性。其次，我们开发了一种新型的RAF共激活检测方法，利用N端截短的RAF蛋白评估激酶失活RAF突变体的变构活性，避免了现有方案中对活性Ras的依赖，从而实现了更高的检测灵敏度。最后，我们建立了一种独特的互补型分裂荧光素酶检测方法，可对多种RAF突变体的相对二聚体亲和力/稳定性进行定量测定，相较于传统的共免疫沉淀检测，该方法更可靠且更灵敏。综上所述，这些方法具有以下优势：（1）操作简便；（2）无需高端设备即可有效实施；（3）成本低廉；（4）灵敏度高且可重复性强。
引言
RAF 激酶家族是 RAS/RAF/MEK/ERK 信号级联通路中的关键组分，负责将信号从 RAS 传递以激活丝裂原活化蛋白激酶（MEK）1,2,3,4。该激酶家族在细胞生长、存活和分化过程中发挥重要作用，其异常改变可导致多种疾病，尤其是癌症5,6,7,8。近年来，基因组测序已鉴定出许多与疾病相关的 RAF 突变体，这些突变体在 RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路中的信号传递表现出不同的特性9,10,11。对 RAF 突变体进行细致的表征将有助于我们理解其改变 RAS/RAF/MEK/ERK 通路信号输出的分子机制，最终为治疗各类由 RAF 突变驱动的疾病选择合适的策略提供依据。
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方案
1. 用于测量 RAF 突变体催化活性的体外激酶实验
- 使用Gibson组装或传统分子克隆方法构建在C末端带有FLAG(DYKDDDDK)标签的RAF突变体编码载体（图1A）。
- 通过PCR将FLAG标签和突变引入RAF编码序列，然后使用Gibson组装或T4 DNA连接酶按照制造商说明书将完整序列插入pCDNA3.1(+)载体中。PCR反应条件如下：(1) 95 °C，2 min；(2) 95 °C，30 s；(3) 59 °C，30 s；(4) 68 °C，3 min；(5) 20个循环（步骤2至4）；(6) 4 °C保存。
注意： 克隆用PCR引物序列：5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 和 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3。 - 将GST编码序列插入RAF突变体编码序列的上游，使用与步骤1.1.1所述相同的方法构建编码GST融合RAF突变体的载体。
- 转染前通过DNA测序验证所有载体。
- 通过PCR将FLAG标签和突变引入RAF编码序列，然后使用Gibson组装或T4 DNA连接酶按照制造商说明书将完整序列插入pCDNA3.1(+)载体中。PCR反应条件如下：(1) 95 °C，2 min；(2) 95 °C，30 s；(3) 59 °C，30 s；(4) 68 °C，3 min；(5) 20个循环（步骤2至4）；(6) 4 °C保存。
- 转染前一天，以每孔5 × 105个细胞的密度将293T细胞接种于6孔板中。第二天当细胞融合度达到80~90%时，按照转染试剂说明书（材料表）将编码FLAG标....
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结果
RAF 家族激酶具有催化活性和变构活性，使其疾病相关突变体能够通过不同机制激活下游信号通路13,14,16,17,18。组成型活化的 RAF 突变体可直接磷酸化其底物，而激酶失活的 RAF 突变体则通过反式激活野生型 RAF 来发挥功能。如图 1B所示，在 293T 细胞中表达时，组成型活化的 RAF 突变体（如调节性脊柱（R-脊柱）突变体（BRAF(L505M)、CRAF(DDEE/L397M) 和 ARAF(DGEE/L358M)）13,23,2.......
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讨论
本文介绍了三种用于表征与疾病相关的RAF突变体的方法，包括体外激酶活性检测、RAF共激活检测以及互补型分裂荧光素酶检测。由于RAF激酶具有催化活性和变构活性，不同的RAF突变体可通过两种不同的机制激活下游信号通路13,14,16,17,18。组成型活性RAF突变体可直接磷酸化下游效应分子MEK，而激酶失活型RAF突变体则通过反式激活其野生型对应物来触发下游信号传导。然而，无论是组成型活性还是激酶失活型RAF突变体，其功能的实现均依赖于二聚化15,16,17,19.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢毛细胞白血病奖学金对袁继民的支持。本工作获得亚洲癌症研究基金（AFCR2017/2019-JH）、杜克-国大科桥基金奖（Duke-NUS-KBrFA/2018/0014）、国家癌症中心研究基金衔接拨款（NCCRF-YR2018-JUL-BG4）、国家癌症中心研究基金试点拨款（NCCRF-YR2017-JUL-PG3）以及SHF学术医学研究拨款（AM/TP011/2018）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗磷酸化ERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| 抗磷酸化MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| 抗ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| 抗MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| 抗FLAG（小鼠） | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| 抗FLAG（兔） | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| 抗-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| 抗FLAG磁珠（M2） | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP标记的抗兔IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning 试剂盒 | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| 无酚红DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-荧光素 | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis标记的MEK1 (K97A) | 由本实验室前期研究制备 | N.A. | 参考文献15 |
| GloMax-多模式检测系统 | Promega | E7041 |
参考文献
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
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重印与许可
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