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通过细针穿刺检测血管外Trypanosoma寄生虫

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DOI：

10.3791/59798

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2019年8月7日

 ,  , 
1Comparative Pathology Unit, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa, 2Biology of Parasitism Laboratory, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa

本文内容

摘要

细针穿刺抽吸是一种通过使用细针从病灶或器官中获取细胞的技术。抽吸所得的样本可涂片、染色后在显微镜下检查以用于诊断，或用于分子生物学、细胞计数或体外分析。该方法成本低、操作简便、速度快，且造成的创伤极小。

摘要

细针穿刺抽吸（FNA）是一种常规诊断操作，广泛应用于医学和兽医学实践中。该操作通过使用一种类似于常规静脉穿刺所用的细针，经皮穿刺从可触及的肿块、器官或积液（体腔内的液体积聚）中抽取细胞和/或微生物。FNA所获取的样本通常细胞含量丰富，收集到的抽吸物随后被涂片、空气干燥、湿固定、染色，并在显微镜下观察。在临床实践中，FNA是一项重要的诊断工具，可为合适的治疗管理提供指导。由于该方法操作简便、快速、创伤小，且对实验室设备和人力资源的需求有限，因此在兽医临床中被广泛应用，主要应用于家养动物，也用于农场动物。在动物模型研究中，FNA的优势在于可在同一动物个体上重复进行，从而通过在疾病发展过程中多次采集肿瘤及器官/组织中的细胞，实现纵向研究。除常规显微镜检查外，所获取的样本还可用于免疫细胞化学、电子显微镜、生化分析、流式细胞术、分子生物学或体外检测。已有研究利用FNA在感染小鼠的性腺中检测到原虫寄生虫Trypanosoma brucei，这为今后在牛群中开展相关诊断提供了可能。

引言

细针穿刺抽吸（FNA）广泛应用于人类和家养动物癌症及非肿瘤性疾病的诊断。该技术经过多年已实现标准化，并在众多教科书中有所描述1,2。

该操作主要通过将细针连接至空注射器，利用负压经皮穿刺抽吸可触及的肿块、器官或积液，从而从病灶中抽取细胞或液体1,3。通常使用的针头规格为22至25G（G表示针头内径），使用较粗针头（大直径，例如21G）有助于提高细胞含量，但可能导致血液污染过多。针头长度需根据病灶深度选择，浅表病灶通常使用1英寸或1½英寸的针头。注射器通常为5至10 mL，较大的注射器可产生更高的负压，从而提高抽吸物的获取量。对于不可触及的深部病灶，也可在影像引导（如超声）下使用较长针头进行穿刺抽吸。获取的抽吸物可涂片后进行空气干燥、湿固定、染色，并在显微镜下观察以获得诊断结果3（图1）。

这是一种简单、经济、无痛且微创的技术，主要用于术前环境中对可触及的肿块进行诊断，同时也适用于淋巴结、甲状腺、前列腺甚至男性外生殖结构等器官。1除了作为诊断工具外，该技术还可用于收集细胞以用于其他目的，即细胞遗传学和电子显微镜（图1D），流式细胞术表征4,5,6,7，细胞培养的建立8. A 临床实践中一个常见的例子是为体外受精进行的精子获取9.

可在同一病灶内反复抽吸数次，以获得多张涂片。对于异质性病灶，例如同时存在实性区域和囊性空间的情况，必须从各个区域分别抽吸细胞。细针穿刺活检（FNA）所获取的标本通常细胞含量丰富，大多数情况下无需进行组织活检即可完成疾病诊断。此外，还可对FNA获得的涂片进行特殊染色、免疫荧光、免疫细胞化学 （图1D）以及分子检测等分析，例如在仅靠形态学无法识别病原体时用于确定感染性病原体10。FNA的一般应用范围以及所需设备和耗材的简要概述分别总结于表1和表2中。

关于使用穿刺针进行诊断的首份报告见于阿拉伯医学的早期文献，但现代穿刺抽吸技术是在20世纪初才得以应用11。值得注意的是，可能最早提出将细针穿刺抽吸（FNA）用于感染性疾病诊断的报告是一项1904年的研究，Grieg和Gray报道了对昏睡病患者淋巴结进行穿刺抽吸后，在样本中发现了活动的锥虫12。作者指出，无论是在早期还是进展期病例中均能检测到锥虫，且其密度高于血涂片中的检出率，而血涂片中此类病原体往往极为罕见12。

目前对牛锥虫病的诊断依赖于在血液、淋巴液中直接观察寄生虫，或采用免疫学诊断技术13,14,15。我们先前已证实，在小鼠的实验性Trypanosoma感染中，布氏锥虫（T. brucei）对脂肪组织具有显著的趋向性16，同时也趋向于某些雄性外部生殖结构，特别是附睾17。这些组织的间质中可大量积聚寄生虫16。

以下方案详细描述了在活体小鼠中进行细针穿刺抽吸（FNA）的技术操作步骤，旨在获取存在于雄性外生殖结构（睾丸、附睾及附睾脂肪）中的锥虫，随后进行常规细胞学检查以及针对特定寄生虫蛋白（VSG）的免疫染色16,17。穿刺操作在感染后第6天进行，所遵循的安全操作规程为实验动物常规操作中普遍采用的标准。对于存在免疫缺陷的动物，还需采取额外防护措施（穿戴经蒸汽灭菌的防护服、口罩、头帽、无菌手套，并始终确保无菌操作），以降低意外接触机会性病原体的风险。

方案

本方案中的所有动物实验均按照欧盟法规进行，并已获得分子医学研究所（iMM）动物伦理委员会的批准（AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM）。iMM的动物设施符合葡萄牙关于实验动物使用的法律规定（法令第113/2013号），并遵循欧盟指令2010/63/EU以及欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）关于实验动物福利的指南与建议。

1. 小鼠雄性外生殖器寄生虫的吸取

注意：采用6至 10周龄的野生型雄性C57BL/6J小鼠进行细针穿刺（FNA），通过腹腔注射200 µL含2,000个锥虫（T. brucei）的生理盐水建立感染，具体方法如前所述16。

  1. 对雄性小鼠外生殖器进行细针穿刺抽吸（FNA）时，将小鼠置于超净工作台中，通过腹腔注射200 µL生理盐水配制的混合物（75 mg/kg 氯胺酮 + 1 mg/kg 美托咪啶）进行麻醉。
    1. 使用脚趾夹捏法确认麻醉效果。当腿部回缩反射消失后，将小鼠置于仰卧位（图2A）。
    2. 仔细触诊睾丸，评估其大小及与表层皮肤的距离。用食指与中指或食指与拇指固定器官，将覆盖其上的皮肤紧绷地拉过目标区域以进一步固定。用酒精棉片清洁表面（图2A）。
    3. 手持已组装的22 G针头和5 mL注射器，将针尖刺入目标区域，操作时始终保持推柄处于静止状态（图2B-C）。
    4. 通过将注射器活塞回抽至4 mL至5 mL刻度处，进行2-3次抽吸。在器官内沿直线或多个不同切线方向调整针头位置，以提高获得代表性样本以及穿刺到附睾等较小结构的概率。确保操作轻柔，以尽量减少组织损伤（图2C-D）。
    5. 释放负压后拔出针头。切勿在活塞仍处于回抽状态时重新插入针头，否则会导致抽吸物被吸入注射器筒内而难以回收（图2E）。拔针后，用无菌 纱布敷料在穿刺部位施加压力以控制出血。
    6. 将注射器与针头分离，吸入空气后重新连接针头，并轻柔地将针内内容物排出至载玻片上。针尖应非常接近甚至接触载玻片，以避免飞溅（图2F-I）。
    7. 每个器官/动物至少再进行一次额外抽吸，以确保样本重复性。
    8. 皮下注射200 µL生理盐水配制的1 mg/kg 阿替美唑以逆转麻醉，随后将动物放回原笼中恢复，并持续观察直至完全苏醒。 

2. 从抽吸物制备涂片

注意：整个操作过程中需佩戴手套，并确保针头和注射器的安全处置。

  1. 两步拉片法
    1. 用非优势手拿起带有吸取液滴的载玻片，用拇指和食指夹住磨砂端（图3A）。
    2. 用优势手拿起另一张干净的载玻片（推片），将其横跨过带有液滴的第一张载玻片。将推片的光滑洁净边缘以约30°的角度置于标本载玻片上液滴的上方（图3B）。
    3. 以一次轻柔、连续且稳定的动作向前滑动推片，形成一层薄薄的涂片（图3C）。
    4. 将载玻片静置，使其材料完全且快速地自然风干（图3D）。切勿加热固定。用铅笔在载玻片的磨砂边缘做好标记。
      注意：本方案可在该步骤暂停，涂片可长期保存，直至准备染色。

3. 涂片染色

注意：整个操作过程中需佩戴手套，并确保步骤 3.1.4 和 3.2.9 在通风橱内进行。

  1. 吉姆萨染色方案
    1. 将空气干燥的涂片浸入盛有100%甲醇的考普林瓶中，固定5分钟（图3E）。
    2. 将玻片转移至盛有20%吉姆萨溶液（用蒸馏水按1:5稀释）的考普林瓶中，染色30分钟；或使用10%吉姆萨溶液染色10分钟（图3F）。
    3. 用自来水冲洗，再用纸巾轻轻吸干。
    4. 将玻片水平放置，在涂片上滴加一滴非水性封片介质。将盖玻片的一边接触玻片，缓缓放下并轻压，以去除气泡。
  2. 细针穿刺涂片的免疫细胞化学染色
    1. 将空气干燥的涂片在室温下用100%甲醇固定10分钟。
    2. 将玻片放入盛有1×磷酸盐缓冲液（PBS）的考普林瓶中洗涤5分钟，重复此步骤3次，每次均使用新鲜的1× PBS。
    3. 从考普林瓶中取出玻片，擦去多余缓冲液，注意不要触碰涂片区域，并使用疏水笔在涂片周围画圈（材料表）。
    4. 将玻片水平放置，向每个涂片上加入150 μL稀释的一抗溶液，在室温下孵育1小时。
      注意：本实验所用一抗为未纯化的兔抗T. brucei VSG13抗原血清（可与多种T. brucei VSG发生交叉反应，实验室自制），用1× PBS按1:50,000稀释。通过以预免疫血清（材料表）替代相应的一抗进行阴性对照，以评估二抗的非特异性结合。
    5. 将玻片放入盛有1× PBS的考普林瓶中洗涤5分钟，重复此步骤3次，每次均使用新鲜的1× PBS。
    6. 将玻片水平放置，向每个涂片上加入150 μL市售的辣根过氧化物酶/DAB显色系统试剂，室温孵育30分钟（材料表）。
    7. 用1× PBS洗涤3次，每次5分钟。
    8. 将玻片浸入盛有哈里斯苏木精液的考普林瓶中进行复染。用自来水冲洗后，用纸巾轻轻吸干。
    9. 将玻片水平放置，在涂片上滴加一滴非水性封片介质。将盖玻片的一边接触玻片，缓缓放下并轻压，以去除气泡。

结果

对感染小鼠的外部雄性生殖器官进行细针穿刺抽吸（FNA） T. brucei 使用连接5 mL注射器的22 G针头以及用于涂片制备的玻璃载片（图1A- C）。该方法简单，但获得最佳结果依赖于几个关键步骤：通过全身麻醉实现小鼠的完全固定，以及在整个操作过程中对器官的稳定。图 2A- B）。进行2-3次负压抽吸，并重新调整针头方向1-2次，以实现对较小器官和组织（附睾及附睾脂肪）的代表性取样。在将针头退出体外前，先释放负压。抽吸物 包含在针头管腔和针座内的（约 20 µL），用于制备2张涂片（图3A- C）。若在未释放负压的情况下拔出针头，材料会被吸入注射器内而无法回收。该过程成功重复了两次，每次针对一对器官。干燥后，涂片经湿固定，并进行锥虫表面蛋白的免疫细胞化学染色。

高质量的涂片（图 4A-C）表现为细胞呈单层分布且细胞密度良好，宿主细胞形态结构保存完整，能够识别其组织来源及彼此之间的相对比例。寄生虫经免疫染色后清晰可辨，易于识别和计数（图 4B）。此外，还展示了一例感染小鼠腹腔积液的细针穿刺样本，经吉姆萨染色后用于直接观察和诊断（图 3D-F 和 图 4C）。

FNA 结果不佳或呈阴性可能由多种原因导致：（1）涂片上表达的 FNA 样本量过少，不能充分代表原始样本；（2）单张涂片上表达的 FNA 样本过多，导致涂片过厚，影响细胞学评估；（3）制备涂片时用力过大，导致细胞破裂，出现大量裸核和 DNA 条索（压碎假象）；或（4）制备涂片时用力不足，细胞未充分分散，形成分层结构，妨碍对细胞形态特征的评估（图 5）。

当我们比较细针穿刺细胞病理学与组织病理学，即细胞分析与组织分析时，前者的优势在于细胞形态得以更好地保存，且细胞的相对比例和计数能够更准确地评估（图6）。此外，免疫细胞化学比免疫组织化学更简单、快速且易于优化，后者通常在福尔马林固定和石蜡包埋的组织上进行。

靶标应用优势局限性
可触及肿块常规显微镜检查、诊断操作简单、快速无法保留组织结构
器官免疫组织化学成本低盲穿抽吸（针头可能切线偏离靶区；抽吸可能获取坏死、囊性或出血区域）
积液流式细胞术可从多个位点取样
细胞遗传学细胞形态保存良好
电子显微镜无并发症
PCR 及其他分子技术诊断准确性高
生化分析麻醉（用于固定）
体外实验、细胞培养非终末性操作

表1：细针穿刺的靶目标、一般应用、优势与局限性。

FNA试剂盒抽吸针与注射器的典型结构
抽吸操作：针头部件：
1. 一次性塑料注射器（5 或 10 mL）（图1B）斜面（bevel）。 针头末端呈倾斜状以形成尖端，该倾斜面即为斜面。仅带斜面的针头适用于经皮穿刺抽吸。
3. 规格为22至25 G（直径）；长度分别为0.75、1.0、1.5英寸，配备标准斜面针尖（图1A）针体（shaft）。 针头的中空管状部分，其长度可根据病灶深度进行调整。针头规格（gauge）对应其内腔直径，即针体内部的直径（规格数值越大，针越细）。使用较大内径的针头（小于22 G）有助于提高细胞量，但可能造成过度的医源性血液污染。
1. 麻醉（如必要）。FNA相关的疼痛程度类似于静脉穿刺，但良好的抽吸操作需要受试对象保持充分固定，尤其在小型动物和/或存在小而波动性病变或器官的情况下尤为重要。接受FNA的大鼠和小鼠应适当被动约束，必要时可给予镇静或轻度全身麻醉。针座（hub）。 针头的塑料部分，用于连接注射器；应为透明材质以便观察抽吸物。FNA过程中获得的抽吸物应收集于针体中，当观察到抽吸物进入针座时，应立即停止抽吸。
FNA涂片制备与判读：注射器部件：
1. 带磨砂端的玻璃显微镜载玻片（图1C）筒体/缸体（barrel/cylinder）。 注射器的中空部分。除非处理囊性病变或积液，抽吸至筒体内的物质通常无法回收。FNA细胞学检查的理想抽吸体积约为5 μL，相当于平均填充针体和针座空间的体积。
2. 瑞氏型染色剂（如Diff-Quik、Giemsa）接口（tip）。 筒体末端，用于连接针座。
3. 显微镜（明场）活塞（plunger）。 注射器的可移动部分，一端为扁平圆盘或凸缘，另一端为橡胶密封圈。活塞插入筒体内，通过产生负压将细胞或液体吸入针头。为获得足够的抽吸物产量，活塞必须密封良好，以形成有效的负压。

表2：细针穿刺所需的设备和耗材。

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图1：细针穿刺抽吸的工具与结果 (A细针穿刺（FNA）的理想针头直径为22至25 G。B获得良好抽吸物产量的理想注射器容量为5至10 mL。C洁净、干燥、无油脂的载玻片，带有磨砂标记区以便用铅笔书写，并预先包被（如用于免疫组织化学）。D) 示例 锥虫 经吉姆萨染色观察（黑色箭头）、VSG表面蛋白免疫染色（白色箭头）及透射电子显微镜观察（方头箭头）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图2：示意图显示小鼠雄性外生殖器官（睾丸、附睾和附睾脂肪）的细针穿刺抽吸（FNA）操作。 （A）固定动物后，拿起预先组装好的穿刺器械。（B-C）将针尖插入目标器官。（D）通过将注射器活塞回抽至1 mL至2 mL刻度处，反复3-4次施加负压。在施加负压的同时，也可将针尖在目标组织内前后移动，以收集足够的样本。（E）先释放负压，再退出针头。（F）将针头从注射器上取下，（G）向后拉动活塞。（H）重新将针头安装到注射器上。（I）迅速推动活塞，将样本喷射到载玻片上。为避免飞溅，应使针尖非常靠近甚至接触载玻片表面。吸取物液滴应置于磨砂标记区边缘约1 cm处。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：涂片制备与染色。 （A）用拇指和食指夹住载玻片的一端（磨砂区域）。（B）将第二张载玻片（推片）的光滑洁净边缘置于标本载玻片上液滴前方。（C）以适中速度向前推动推片一次，形成一层薄层。（D）让载玻片自然风干，并用铅笔在磨砂端标记。（E）完全干燥后，用甲醇固定5分钟。（F）用20%吉姆萨染液染色30分钟（或用10%吉姆萨染液染色10分钟）。用清水轻轻冲洗，彻底干燥后浸入二甲苯，再用水不溶性封片剂封片。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：感染布氏锥虫的小鼠雄性外生殖结构经细针穿刺抽吸（FNA）后制备涂片的显微照片。 T. brucei. (A) 高质量直接涂片的大体外观：将穿刺物滴加在载玻片上，位置距离磨砂端边缘约1 cm处（黑点），涂布并终止于载玻片边缘前0.5 cm处（平行线所示）。(B) 对感染第6天时从雄性外生殖器官FNA获取的涂片进行寄生虫表面蛋白（VSG）免疫细胞化学染色。可见大量寄生虫（箭头所示）与小鼠生殖细胞（箭头所指）混合存在。DAB显色，苏木精复染。原始放大倍数：40x（比例尺 = 50 μm）。(C) 感染第21天腹腔积液FNA后制备涂片的吉姆萨染色结果显示，大量寄生虫（箭头所示）与宿主（小鼠）细胞混合存在，此处为炎性细胞、巨噬细胞（箭头）和淋巴细胞。原始放大倍数：40x（比例尺 = 50 μm）。 请点击此处查看该图的高清版本。

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图5：质量较差的细针穿刺涂片。 (A) 细胞含量不足的涂片，不能充分代表病灶或器官组织。(B) 涂片过厚。(C) 挤压伪影，表现为细胞结构破坏、裸核及DNA条带。(D) 细胞聚集成团并呈分层排列。DAB复染，苏木精为对比染色。原始放大倍数：20×（比例尺 = 100 μm）。请点击此处查看该图的高清版本。

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图6小鼠感染后附睾细胞学与组织学的比较 T. brucei (A) 细针穿刺涂片的显微照片以及 (Ba 4 μm 石蜡切片，相同放大倍数下（20倍原始放大倍数，比例尺 = 100 μm），均对寄生虫表面蛋白（VSG）进行免疫染色。涂片显示大量寄生虫（箭头所示），细胞形态保存良好，混有中等数量的生精细胞和少量精子（箭头）。组织切片显示组织结构保存良好，由附睾管组成，管腔内可见精子（箭头），并可见大量寄生虫浸润并扩张附睾间质（箭头所示）。DAB显色，苏木精复染。原始放大倍数：20x（比例尺 = 100 μm). 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

细针穿刺抽吸（FNA）是一种广泛用于人类和家养动物疾病诊断的方法。该技术经过多年标准化1,2，使用细口径针头从可触及的肿块或器官中抽吸细胞或液体1,3。随后通常将抽吸物涂布在玻璃载片上，染色后进行显微镜观察以获得诊断结果，但该技术也可用于获取细胞以用于其他目的4,5,6,7,8,9。

该操作快速（对于有经验的研究人员，每只小鼠<5 分钟），并发症风险极低，与接受简单静脉穿刺时的风险相似。因此，对于可触及肿块的细针穿刺抽吸（FNA），仅在解剖位置敏感或需要对动物进行良好固定，以及对拟抽吸器官或肿块实现极佳稳定以获得最佳结果时，才需要麻醉。这在小型实验动物中较为常见，因为在无麻醉情况下，用一只手安全有效地固定小型啮齿类动物，同时用另一只手确保最佳穿刺区域通路，通常难以实现。短期麻醉在大多数情况下已足够，但对小鼠成功实施良好的FNA而言仍是必要的。良好的固定可最大程度地获取能够代表病灶细胞成分的抽吸物，同时最大限度地降低施加负压时针头尖端移出目标位置的风险。

尽管该操作本身非常简单，但真空的协调施加与释放是最关键的步骤。针头插入后，需回抽注射器的活塞以产生可控的负压（抽吸），并且只有在松开活塞释放负压后，才能将针头从病灶中取出（图2）；否则，抽吸物会被吸入注射器筒内，难以回收。另一个非常重要的步骤是制备高质量的涂片。制备涂片的方法有多种，但无论采用何种方法，都应在材料放置到载玻片上后立即进行涂片。应轻柔地涂布生物材料，以避免细胞压碎的人工假象。使用盖玻片作为推片有助于防止此类假象。然而，涂片过程中施力过大可能会导致盖玻片破裂。高质量的涂片通常使大部分细胞呈单层分布，以便于光线透过。细胞成分不应过多地被困在血凝块中。

细针穿刺抽吸（FNA）的目的是从肿块、组织或器官中采集细胞。使用较大内径的针头有助于增加细胞含量，但可能伴随过多的血液污染；而使用较小针头采样则可获得质量更高但数量较少的标本。在本实验中，对实验性感染布氏锥虫（T. brucei）的小鼠，采用22号针头连接5 mL注射器经皮穿刺抽吸雄性外生殖结构。小鼠经麻醉后，一手固定睾丸，另一手进行穿刺并实施抽吸。我们获得了大量与生精细胞、精子、上皮细胞及间质细胞混合的锥虫，将其涂片后针对寄生虫表面蛋白（VSG）进行免疫染色（图4）。

由于细针穿刺抽吸是一种盲穿操作，无法观察到针尖位置以及靶器官或肿块，因此即使对同一病灶的多个区域进行多次取样，仍可能存在取样误差，导致结果呈阴性。这一点在临床环境中尤为重要，因为对于可疑病灶，即使细针穿刺细胞学检查（FNA）结果为阴性，也不能排除进一步检查的必要性；但在疾病动物模型中，这一问题的重要性较低。因此，该方法的主要局限性包括假阴性结果（较为常见）和较少出现的假阳性结果（例如由血液污染引起）。而在动物实验背景下，最重要的局限性在于无法获得组织结构信息17，而组织病理学检查则可提供此类信息，例如寄生虫分布模式、免疫细胞分布以及细胞间相互作用特征。尽管如此，FNA 的优势在于其为非终末性操作，可在同一动物体内进行多次重复取样，并且始终能够获得更佳保存的细胞形态（图5）。相比之下，从实验小鼠体内获取宿主细胞、免疫细胞或微生物的其他方法，则始终依赖于处死小鼠以采集目标肿块或器官。

据我们所知，关于细针穿刺抽吸术（FNA）在小型实验动物中应用的报道极少，其中一篇发表于1949年，描述了使用22 G针头穿刺抽吸骨髓以研究造血功能18；其余研究均将FNA与流式细胞术结合，用于定量肿瘤相关炎性细胞或内皮细胞7,19,20。我们的研究表明，该技术可进一步拓展应用于感染性疾病模型的诊断与研究，并可将细胞学分析与免疫细胞化学或电子显微镜等技术相结合。该方法在实验动物中的两个主要优势在于：（1）该操作为非终末性，即可在活体小鼠中进行；（2）由于其侵入性轻微，可在同一只动物身上进行多次连续穿刺抽吸。因此，每项研究所需的小鼠数量显著减少，且能够方便地分析临床疾病进展与疾病和/或病原体的细胞及分子特征演变之间的相关性，从而实现纵向研究。

关于使用细针穿刺（FNA）诊断感染性疾病的首篇报道，可能是Grieg和Gray在1904年发表的一项研究，该研究报道了对昏睡病患者淋巴结进行针吸，发现了活动性的锥虫12。如果我们在实验小鼠中的发现能够推广至牛群，即如果可通过FNA从雄性外生殖结构中轻松获取锥虫（Trypanosoma），那么可以预期，该技术将有助于兽医在农场现场诊断家畜的锥虫病。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由科学技术基金会（Fundação para a Ciência e a Tecnologia，FCT）/科学、技术和高等教育部（Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior，MCTES）通过国家预算基金（参考编号：ID/BIM/50005/2019）资助。LMF 是科学技术基金会（IF/01050/2014）的研究员，其实验室还获得了欧洲研究理事会（ERC）的资助（项目 FatTryp，编号 771714）。本研究的发表也由科学技术基金会（FCT）/科学、技术和高等教育部（MCTES）通过国家预算基金资助的项目 UID/BIM/50005/2019 提供经费 支持。我们感谢 iMM 组织学与比较病理学实验室的 Andreia Pinto 在电子显微镜技术方面提供的专业协助，并感谢 Sandra Trindade、Tiago Rebelo 和 Henrique Machado（iMM）分享感染小鼠的组织样本。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿替美唑（ANTISEDAN 10 mL）Bio 27418046麻醉逆转
盖玻片（24 × 60，No.1）VWR631-0664涂片制备
DABDakoK3468免疫细胞化学
Entellan（500 mL）VWR1.07961.0500封片介质
Envision Flex 抗体稀释液Dako8006免疫细胞化学
EnVision Flex HRP 标记二抗（抗兔）DakoK4010免疫细胞化学
Envision Flex 洗涤缓冲液DakoK8007免疫细胞化学
吉姆萨染液Atom Scientific LtdRRSPSS-A涂片染色
载玻片（Superfrost Plus）VWR631-9483涂片制备
哈里斯苏木精染液Bio-optica05-06004E免疫细胞化学
过氧化氢溶液SigmaH1009-500ML免疫细胞化学
皮下注射针头 Microlance 3（23 G）Henry Schein902-8001穿刺抽吸技术
氯胺酮（IMALGENE 1,000-10 mL）Bio 27410928麻醉
美托咪啶（DOMITOR 10 mL）Bio 27418335麻醉
甲醇Merck1.06009.2511涂片固定剂
防扩散笔（Pap pen）MerckZ377821-1EA免疫细胞化学
无血清蛋白阻断剂DakoX0909免疫细胞化学
注射器（5 mL，10 mL）Henry Schein900-3311, 900-3304穿刺抽吸技术

参考文献

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