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方法文章

具有温度控制功能的垂直观察显微镜载物台的制备

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DOI：

10.3791/59799

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2019年7月31日

 ,  , 
1Department of Physics, Graduate School of Science, Tokyo University of Science

本文内容

摘要

本文介绍了一种使用温控显微镜载物台的实验方案，该载物台可将样品容器安装在直立显微镜上。

摘要

样品通常被放置在水平的显微镜载物台上进行显微观察。然而，为了观察重力对样品的影响或研究样品的漂浮行为，需要将显微镜载物台调整为垂直方向。为此，已设计出一种侧向倒置并倾斜90°的显微镜。使用该显微镜观察样品时，必须将培养皿或玻片等样品容器垂直固定在载物台上。本文介绍了一种可将样品容器牢固固定在垂直显微镜载物台上的装置。将该装置安装到载物台后，即可实现对样品在垂直平面内动态行为的观察。此外，通过使用硅橡胶加热器调节温度，还可观察样品随温度变化的行为。同时，温度数据可传输至互联网服务器，用户可通过计算机或智能手机远程设置温度参数并监控温度记录。

引言

光学显微镜是一种利用透镜和可见光对样本进行放大，从而增加可观察细节的技术。在光学显微镜中，光线被投射到样本上，随后透射光、反射光或荧光被放大透镜捕获，用于观察。目前存在多种类型的显微镜，其设计各不相同，以适应不同的用途和观察方法。不同的设计包括正置显微镜和倒置显微镜：正置显微镜的结构是从下方照射样本，从上方进行观察；而倒置显微镜则从上方照射样本，从下方进行观察。正置显微镜是最常见且应用最广泛的类型。倒置显微镜常用于观察那些无法允许物镜从上方近距离接近的样本，例如贴附在容器底部的培养细胞。许多研究团队已报道了在广泛研究领域中使用倒置显微镜进行的观察1,2,3,4,5,6,7。此外，还开发了许多利用倒置显微镜特性的附加装置8,9,10,11,12,13。

目前，所有传统的显微镜设计中，显微镜载物台均为水平方向，因此不适合观察在垂直平面内发生运动的样品（由于重力、浮力、运动等因素）。为了实现此类观察，必须将显微镜载物台和光路旋转至垂直方向。该垂直载物台需能够将玻片或培养皿等样品容器垂直固定在载物台上。为此，已有研究设计出一种侧向倒置、整体倾斜90°的显微镜。然而，使用胶带或其他粘合剂固定样品无法实现所需的长期稳定性。本文介绍了一种可实现必要稳定性的装置，该装置允许对样品在垂直平面内的运动进行长时间观察。此外，通过安装硅橡胶加热器，还可观察温度变化对样品行为的影响。温度数据通过Wi-Fi传输至互联网服务器，用户可通过电脑或智能手机远程设置温度并监控记录。据我们所知，将载物台连接至侧向倾斜90°的显微镜的装置此前尚未在已有研究中报道。

显微镜载物台由三层铝板构成。中间的铝板安装在与载物台相连的下层铝板上。含有温度传感器的硅橡胶固定在中间铝板与上层铝板之间。使用橡皮筋固定样品。上层铝板左右两侧的四个点上装有爪状结构，用于固定橡皮筋。温度控制器的控制电路接收来自嵌入硅橡胶中的温度传感器的信号，并通过脉宽调制（PWM）方法调节电功率。温度可以以1 °C为增量逐步升高至50 °C。该装置适用于样品垂直运动可能依赖于温度的实验应用。

本报告提供了温度对硅藻漂浮现象影响的实例。作为硅藻观测研究的示例，已有文献报道了细胞聚集体沉降速度的测量、运动分析、超微结构研究等14,15,16,17,18,19,20,21,22,23。含有光合生物的硅藻在水中的比重略高于水，因此有下沉趋势；然而，只要有微弱的对流发生，它们便会上升。为研究这一现象，将载玻片垂直固定在显微镜载物台上，观察温度升高对硅藻垂直运动的影响。

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方案

1. 设计

  1. 铝板的制备
    1. 在尺寸为 150 mm × 200 mm × 2 mm 的铝板中心，使用激光加工设备切割一个直径为 101 mm 的孔，用作前部面板。在八个位置加工卡扣，用于固定两个沿铝板长度方向或两个沿宽度方向的橡胶圈（参见 补充图 1A 和 补充图 2A).
    2. 使用激光加工机在另一块150 mm × 200 mm × 5 mm的铝板中心切割一个130 mm的孔，该铝板将用作中间上层板。在此板的长度方向两侧或宽度方向两侧各加工八个用于固定橡皮筋的凹槽（参见 补充图1B 和 补充图2B）.
    3. 在150 mm × 200 mm × 4 mm的铝板中央用激光加工机切割一个130 mm的孔，用作中部下板（见 补充图1C 和 补充图2C）.
    4. 在一块 150 mm × 200 mm × 1.5 mm 的铝板中心切割一个 30 mm 的孔，用作底板（参见 补充图1D 和 补充图2D）.
  2. 制作两个铝制底座
    1. 在铝板（直径100 mm，厚度3 mm）的中心切割一个直径30 mm的孔，并从一侧切出一个尺寸为42 mm宽 × 30 mm深的缺口（见 补充图3A）.
    2. 在铝板（直径100 mm，厚度4 mm）中心切割一个30 mm的孔，并在距中心25 mm处钻三个直径3 mm的孔，孔间距均布 120° 彼此之间（参见 补充图3B).
  3. 三个压制软木圆盘的制备
    1. 在压制软木圆盘（直径 100 mm，厚度 2 mm）中心用水射流切割机切割一个直径 20 mm 的孔。先进行一次 42 mm 长、30 mm 深的切割，然后进行一次 4 mm 宽、5 mm 深的切割（见 补充图 4A).
    2. 在直径100 mm、厚度1 mm的压制软木圆盘中心，使用水射流切割机切割一个直径20 mm的孔。进行一次42 mm长、30 mm深的切割，以及一次4 mm宽、40 mm深的切割（见 补充图4B).
    3. 从直径为100 mm的软木圆盘上切割出一块压制软木板，宽度为42 mm，深度为30 mm。需要两片厚度为1 mm的板材和一片厚度为2 mm的板材（见 补充图 4C).
  4. 硅橡胶加热器的制备
    1. 使用一块直径为100 mm、厚度为2.5 mm的硅橡胶圆盘，内置镍铬合金丝，制成加热器，并在圆盘中心切割一个20 mm的孔（参见 补充图5).
  5. 按照步骤 1.1–1.4 中所述部件，按图示方式堆叠组装 补充图6。
  6. 构建显微镜载物台，请参考 补充图6，显微镜载物台的横截面。固定 静力平衡；ΣFx=0，MA=0；示意图；方程、力、力矩平衡分析。 和 静态平衡，ΣFx=0，用矢量图示说明力平衡原理。，然后 静力平衡示意图，ΣFx=0，用于物理教学中梁受力分析。 和 瞬态吸收光谱全局分析的光谱拟合图；结果图。 用螺丝固定。 瞬态吸收光谱全局分析的光谱拟合图；结果图。 和 静态平衡，∑Fx=0 方程，受力分析图，物理概念，教育研究 用螺丝固定。 静力平衡，ΣFx=0，用矢量图示说明力平衡原理。 和 静力平衡示意图，ΣFx=0，用于物理教学中梁受力分析。, 化学元素周期表符号；元素性质图表；教学参考工具 和 静态平衡，∑Fx=0 方程，受力分析图，物理概念，教育研究, 化学元素周期表符号；元素性质图表；教学参考工具 和 静力平衡；ΣFx=0；示意图；结构分析；物理教育；受力分析图, 静力平衡；ΣFx=0；示意图；结构分析；物理教育；受力分析图 和 静力平衡示意图；ΣFx=0；力的平衡；物理教学图表；力学概念，以及 静力平衡，∑Fx=0 方程，受力分析图，物理概念，教育研究。 和 静力平衡示意图；ΣFx=0；力矢量图示；力学分析 用粘合剂。

2. 硬件设计概要

  1. 按照补充图7所示准备“电源及编程电路”。通过连接交流适配器的 J4 端子，向加热控制器提供 12 V 直流电源。由于 CPU 的供电电压为 3.3 V 直流，需使用稳压器将电压从 12 V 直流降至 3.3 V 直流，以供电路使用。
    注意：USB 1 是开发用计算机的 5 V 直流电源和串行信号端子。尽管 5 V 直流并非必需，但可用作对 CPU 进行编程的电源，该电压也通过稳压器转换为 3.3 V 直流。J1 是编程时的控制信号端子。该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  2. 按照补充图7所示准备“加热控制电路”。使用 Q5（P 沟道 MOS 场效应管）切换 12 V 直流电源，并将其供给加热器。Q5 是一种开关元件，通过 PWM 控制 12 V 直流电源，以调节供给加热器的功率。
    注意：该电路包含一个 LED，用于直观确认是否向加热器供电。该驱动信号（HEATER_C）来自 CPU 的 PWM 信号。当保护电路检测到过热信号时，BREAKER 信号变为低电平，MOS-FET 停止工作。该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  3. 按照补充图7所示准备“加热单元连接电路”。安装 USB 连接器，用于与加热部分连接。
    注意：该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  4. 按照补充图7所示准备“温度传感器连接电路”。安装连接器（Euroblock 插座 2P），用于连接温度传感器。
    注意：该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  5. 对于补充图7所示的“模数转换器”，使用 ADS 1015 作为模数转换器件。
    注意：模数转换器件将温度传感器和过热检测传感器的电压值转换为数字值。该器件为 12 位多路复用模数转换器，通过 I2C 接口与 CPU 连接。该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  6. 按照补充图7所示构建“保护电路”，将过热检测传感器（OHS）信号连接至运算放大器的反相输入端，并将其与连接至同相输入端的可调电阻电压进行比较。
    1. 确保当该信号电压低于可调电阻电压时，运算放大器输出变为高电平，使相连的 NPN 晶体管 Q2 导通，BREAKER 信号变为低电平。
    2. 同时确保 Q4 导通，使相连的过热指示 LED D6 点亮。
      注意：该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  7. 对于补充图7所示的“显示部分”，使用分辨率为 192 × 64 点的 OLED 显示屏，并通过 I2C 接口与 CPU 连接。
    1. 通过 NPN 晶体管 Q1 控制 OLED 的接地端，利用 CPU 信号 IO0 断开 OLED 的接地，从而实现 OLED 的复位。
      注意：该 OLED 用于显示多种信息。该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  8. 对于补充图7所示的“带按键开关的 LED 与旋转编码器”，通过焊接安装一个兼具按键开关功能并集成两个 LED 的旋转编码器。
    1. 将其中一个 LED 连接到 VCC，作为电源指示灯；另一个 LED 连接到 CPU，用于在加热器运行期间作为工作状态指示灯。
    2. 将按键开关触点连接至 CPU，用于加热器的启动/停止控制。将旋转编码器的 A 和 B 输出端连接至 CPU 中设置为中断输入的 IO 引脚。
      注意：该电路安装于补充图8所示的控制器外壳中。
  9. 对于补充图7中的 CPU，使用 WROOM - 02D 型号的 CPU。
    1. 从 IO12、IO13 输出至“显示单元”，因为显示接口符合 I2C 标准。将 IO0 连接到“显示单元”，用于复位 OLED。
    2. 将 IO15 连接到“加热控制单元”，通过 PWM 输出控制供给加热器的功率。
    3. 将 IO2 连接到“LED 与带按键开关的旋转编码器”，用于点亮启动指示 LED。将 IO4 和 IO14 连接到“LED 与带按键开关的旋转编码器”，接收旋转编码器的 REA 和 REB 信号，以设定温度。将 IO5 连接到“LED 与带按键开关的旋转编码器”，用于启动或停止加热器。

3. 软件设计概要

  1. 使用 Arduino CORE for WROOM - 02D 作为该系统的 CPU 控制器。
    注意：输入设备包括启动/停止开关、旋转编码器和温度传感器（热敏电阻）；输出设备包括 LED、字符显示屏（OLED）和加热器。通信设备采用 Wi-Fi。
  2. 操作流程概述
    1. 检测 补充图 7 中“带推压开关的 LED 与旋转编码器”所示的旋转编码器操作，将其存储为设定温度，并在 OLED 上显示。将 CPU 上连接旋转编码器相位端子 REA 和 REB 的输入端口设置为中断输入端口，并通过中断处理旋转编码器的正转与反转。设定正转为 +1，反转为 -1。将设定温度写入全局变量，用于加热器的温度控制。同时更新 OLED 上的设定温度显示。
    2. 通过 补充图 7 中“CPU”部分的 CPU IO 5 引脚，利用启动/停止开关（SW-S）识别启动与停止状态。启动/停止开关的状态每 50 ms 通过定时器中断进行一次检测。
      注意：由于该开关为瞬动开关，每次按下并释放时，启动/停止状态即发生翻转。该状态保存在全局变量中。
    3. 使用热敏电阻作为温度传感器。通过 A/D 转换器（见 补充图 7 中“A/D 转换器”部分）将样品传感器的测量值（见 补充图 7 中“加热器连接用连接电路”）读入 CPU。通过开启 补充图 7 中“CPU”部分的 IO15 端口，向加热器供电。
      注意：温度传感器有两种类型。一种用于测量样品温度，并根据设定温度控制加热器；另一种安装在加热器上，用于过热防护。将热敏电阻通过一个电阻连接至 3.3 V，将电阻变化记录为电压变化。采用移动平均法消除噪声。
    4. 使用热敏电阻作为过热防护温度传感器。利用热敏电阻（R2）（见 补充图 7 中“加热器连接用连接电路”）进行过热检测，当温度超过设定值时，切断加热器电流（见 补充图 7 中“保护电路”）。
      注意：该传感器集成于独立电路中，不经过 CPU。该传感器独立于 CPU，通过差分放大器以模拟方式与由可调电阻设定的电阻值进行比较。当检测到温度超过设定值时，该电路介入 FET 开关，切断流向加热器的电流，强制停止供电。其目的是在 CPU 无法正常工作的情况下，防止加热器温度超过安全限值。
    5. 当设备运行时，由 CPU（见 补充图 7 中“CPU”部分）控制 补充图 7 中“带推压开关的 LED 与旋转编码器”部分的 LED 点亮。
    6. 由 CPU（见 补充图 7 中“CPU”部分）在 补充图 7 中“显示部分”的 OLED 上显示设定温度和测量值。
    7. 由 CPU 输出 PWM 信号，驱动 补充图 7 中“加热器控制电路”部分的 FET 开关，以控制加热器。
    8. 基于温度传感器获取的测量温度，采用 PID 控制加热器。PID 运算使用 Arduino 的 pid_v1.h 库。
      注意：CPU 进行时间校准、与服务器通信、传输数据并接收服务器指令。当传感器温度超过设定温度时，将加热器电流设为 0，以抑制超调。
    9. 利用 CPU 内置的 Wi-Fi 连接功能接入互联网。通过 Wi-Fi 将设定温度、加热器温度等数据传输至指定服务器。

4. 系统配置

  1. 根据补充图9构建系统。
  2. 为控制器配备 Wi-Fi。
  3. 使用热敏电阻作为温度测量的传感器。将热敏电阻导线连接至控制器外壳上的“SENSOR”端子，接收热敏电阻测得的温度信号。
  4. 使用专用电缆将集成橡胶加热器的显微镜载物台与控制器外壳上的“HEATER”端口连接，控制流向橡胶加热器的电流。
  5. 通过控制器上的旋钮调节设定温度。
    注意：温度日志监控和温度设定可通过 PC 或智能手机远程操作。
  6. 通过互联网将测得温度、设定温度及测量时间信息从控制器传输至服务器。数据测量周期为 5 s，数据上传至服务器的周期为 1 min。
  7. 从控制器端定期访问服务器，将存储在控制器 CPU 中的测量数据传输至服务器，用于分析和绘图。
  8. 有关服务器操作方法，请参阅补充材料。

5. 侧向倒置显微镜的设计

  1. 用螺丝将两块厚度为15 mm的铝板垂直固定，以构建基本支架。
  2. 将一个夹具（一处）安装到支架的水平部分。
  3. 将显微镜载物台部分垂直放置，将两个夹具（两处）安装到支架的垂直部分，并将显微镜底部固定在支架上。
  4. 用螺丝固定显微镜载物台。

6. 操作方法

注意：此处使用的样品为改良 Bold 基础淡水营养液培养基、硅酸钠、维生素和无菌水的混合物。取 800 μL 该样品加入 10 mL 新鲜培养基中进行稀释。

  1. 观察方法
    1. 将1,000 μL制备好的样品注入自制玻璃腔室中。
      注：自制玻璃腔室由两片载玻片平行排列，并用粘合剂固定而成。普通培养皿厚度较大，细胞在腔室内易沿深度方向逃逸，难以在显微镜下观察。为防止此现象，设计了深度较小的腔室，可有效限制细胞在深度方向上的移动。使用低温固化环氧树脂粘合剂在玻璃周围进行密封，防止样品从腔室中滴落。
    2. 将另行准备的摄像机连接至显微镜。通过显微镜专用镜头适配器连接摄像机，并对样品进行拍摄。
    3. 使用配备10倍目镜和200倍物镜的显微镜。
    4. 使用4 mm螺丝在四个位置将垂直显微镜载物台固定于显微镜上。
      注：铝板的设计图参见补充图1A和补充图2A。本实验中使用倒置显微镜，将其倾斜90°，并通过螺丝将制作的显微镜载物台固定。参见图1。
    5. 利用纵向制作的四个卡爪，用两条橡皮筋固定样品。将样品置于与地面垂直的显微镜载物台上。
    6. 使用补充图8所示控制器将温度设定为40 °C。旋转控制器旋钮以设定温度，并在显示屏上确认设定温度。按下旋钮启动温度控制，蓝色LED灯亮起；再次按下旋钮可关闭LED灯并停止温度控制。
      注：测量温度实时显示，加热器将自动调节以达到设定温度。温度控制启动后，蓝色LED灯亮起，并在加热器运行期间持续点亮。当加热器过热时，红色LED灯亮起，加热器将自动停止。
    7. 服务器操作请参阅补充信息中的“服务器操作手册”。
      注：需要配备用于数据存储的服务器。服务器数据库采用My-SQL。

7. 橡胶加热器表面温度分布的测量

  1. 通过热成像测量橡胶加热器表面温度的分布，以检查温度均匀性。
  2. 将带有支架的显微镜载物台与橡胶加热器连接。
  3. 将橡胶加热器表面的设定温度分别调整为 35 °C、45 °C、55 °C 和 65 °C，并从前方进行热成像测量（参见 补充图 10）。

8. 温度响应测试

  1. 通过将样品设定温度设为 30 °C 开始温度控制。等待测量值达到 30 °C 并稳定。将预设温度从 30 °C 以 5 °C 为步长逐步升高至 50 °C，每次调整后需等待测量值稳定。
  2. 将预设温度从 50 °C 以 5 °C 为步长逐步降低至 30 °C，检测测量值的跟踪能力。

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结果

图2显示了橡胶加热器的温度分布。在每个设定温度下，橡胶加热器的表面温度均保持均匀。图3显示了实测温度对设定温度变化的响应情况。橙色线表示设定温度，蓝色线表示样品温度的变化。实测值对设定值变化的超调量较小，且跟踪响应迅速。

硅藻细胞被用于展示该装置应用的一个具体实例。对运动中硅藻细胞轨迹的分析是评估硅藻细胞运动能力的有效方法。然而，尽管普通倒置显微镜可对样品进行水平观察，却不适用于观察重力或垂直方向上漂浮运动的影响。

在本实验中，将带有温度控制器的显微镜载物台连接至已旋转90°的倒置显微镜上，成功记录了硅藻随温度变化的垂直运动。通过该方法，检测到了硅藻垂直运动的轨迹，如图4<...

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讨论

对运动中的硅藻细胞进行轨迹分析，是评估硅藻运动性的有效方法。然而，常规倒置显微镜为水平方向观察样本，难以用于研究重力或垂直方向漂浮运动对硅藻的影响。本文研发并描述了一种带有温度控制功能的垂直显微镜载台，可连接至已旋转90°的倒置显微镜。该带温度控制的显微镜载台可实现对硅藻细胞温度依赖性垂直运动的观察。

该方案中的一个关键步骤是控制器电路的设计。为确保安全，已实施了断路电路。当传感器与样品断开连接或微控制器无法正常工作时，一个独立于微控制器的电路将切断加热器的电流。

由于控制系统采用PID系统来控制加热器的电流，因此需要一种用于确定PID最优参数的技术。与现有方法相比，本系统可通过Wi-Fi功能实现远程操作与监控、服务器上的数据采集以及温度设定功能。由于连接在显微镜上的载物台部分结构较为复杂，其结构的简化有待今后进一步研究。

该设备采用加热器升高温度，但冷却过程无动力支持；因此，设定温度无法低于室温。若需将样品冷却至低于室温的温度，将需要复杂的冷却装置，此类装置目前正在考虑...

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披露

作者声明无利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12V2A 交流适配器Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.AD-D120P200Tokyo, Japan
ADS1015 基板Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.adafruit PRODUCT ID: 1083Tokyo, Japan
铝板（背面板）Inoval Co., Ltd.W 150mm×L 200?×T 1.5mmGifu, Japan
铝板（前板）Inoval Co., Ltd.W 150mm×L 200?×T 2mmGifu, Japan
铝板（中下板）Inoval Co., Ltd.W 150mm×L 200?×T 4mmGifu, Japan
铝板（中上板）Inoval Co., Ltd.W 150mm×L 200?×T 5mmGifu, Japan
铝制基座（下板）Inoval Co., Ltd.D 100mm×T 3mm (30Φ)Gifu, Japan
铝制基座（上板）Inoval Co., Ltd.D 100mm×T 3mm (30Φ)Gifu, Japan
Bold 改良型基础淡水营养液Sigma-Aldrich Co. LLCB5282-500MLSt. Louis, USA
控制器外壳Marutsu Elec Co., Ltd.pff-13-3-9Tokyo, Japan
CPUAkizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.ESP-WROOM-02DTokyo, Japan
倒置显微镜Olympus CorporationCKX 53Tokyo, Japan
低温固化环氧树脂胶粘剂ThreeBond Co., Ltd.TB2086MTokyo, Japan
多圈半固定式垂直型 500 Ω 电位器Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.3296W-1-501LFTokyo, Japan
OLED 模块Akihabara Inc.M096P4WTokyo, Japan
压制软木（用于支撑电极）Tera Co., Ltd.W 42mm×L 30?Ishikawa, Japan
压制软木（下圆盘）Tera Co., Ltd.D 100mm×T 0.5mm (20Φ)Ishikawa, Japan
压制软木（上圆盘）Tera Co., Ltd.D 100mm×T 2.5mm (20Φ)Ishikawa, Japan
带开关及双色 LED 的旋转编码器Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.P-05772Tokyo, Japan
硅橡胶加热器Three High Co., Ltd.D 100mm×T 2.5mm (20Φ)Kanagawa, Japan
基板Seeed Technology Co., Ltd.mh5.0Shenzhen, China
温度传感器Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.NXFT15XH103FA2B050Tokyo, Japan
三端直流/直流稳压器 3.3 VMarutsu Elec Co., Ltd.BR301Tokyo, Japan
通用柔性支架Banggood Technology Co., Ltd.YP-003-2Hong Kong, China
USB 线缆 USB-A - MicroUSBAkizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.USB CABLE A-MICROBTokyo, Japan
摄像机Sony CorporationHDR-CX590Tokyo, Japan

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