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方法文章

成人男性泌尿系统尿功能检测的超声检查

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DOI：

10.3791/59802

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2019年8月14日

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1Department of Urology, University of Wisconsin-Madison, 2K12 Kure, University of Wisconsin-Madison, 3Cardiovascular Research Center, Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, 4Department of Urology, University of Washington, 5University of Massachusetts Boston, 6U54 George M. O'Brien Center, University of Wisconsin-Madison, 7College of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison, 8School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison, 9Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 10Department of Radiology, University of Wisconsin-Madison, 11Department of Medical Physics, University of Wisconsin-Madison, 12Rocky Mountain Regional VA Medical Center, University of Colorado

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了使用高频超声结合对比成像技术来测量膀胱容量、膀胱壁厚度、尿流速度、排尿量、排尿持续时间以及尿道直径的方法。该策略可用于评估多种下尿路功能障碍（LUTD）小鼠模型中的排尿功能障碍及其治疗效果。

摘要

由于人口老龄化，临床良性前列腺增生（BPH）和下尿路症状（LUTS）的发病率不断上升，给经济负担和生活质量带来显著影响。已开发出转基因及其他小鼠模型以模拟这种多因素疾病的各个方面；然而，目前尚缺乏准确量化排尿功能障碍及评估新治疗方法有效性的手段。本文介绍一种可用于测量膀胱容积和逼尿肌壁厚度、尿流速度、排尿量和排尿持续时间以及尿道直径的方法。该方法可实现对疾病进展及治疗效果的长期评估。小鼠采用异氟烷麻醉后，通过超声成像观察膀胱。对于非对比成像，采集膀胱的三维图像以计算容积并评估形态，膀胱壁厚度亦由此图像测量获得。对于增强对比成像，使用27号针头经PE50管连接注射器，并通过膀胱顶部置入导管。将0.5 mL对比剂推注至膀胱内，直至发生排尿事件。尿道直径在首次排尿事件期间多普勒速度取样窗位置处测定。每次后续排尿事件均测量流速，从而获得尿流率。综上所述，高频超声被证明是一种有效评估小鼠排尿功能过程中膀胱和尿道参数的方法。该技术可能在实验条件下评估BPH/LUTS新型疗法中具有应用价值。

引言

良性前列腺增生（BPH）是一种随男性年龄增长而发生的疾病，影响近90%的80岁以上男性1,2。尽管BPH的发生通常与衰老相关，但其他因素如肥胖和代谢综合征也可能导致相对年轻男性发生BPH3,4。许多BPH患者会出现下尿路症状（LUTS），显著降低其生活质量，部分患者还可能出现出血、感染、膀胱出口梗阻（BOO）、膀胱结石和肾功能衰竭等并发症。BPH治疗的年花费超过40亿美元5,6,7。由BPH引起的LUTS诊断通常依赖美国泌尿协会症状指数（AUASI）评分、尿流率测定以及前列腺大小评估8。BPH/LUTS的病因复杂且为多因素所致，疾病的发生和发展与前列腺增生（前列腺细胞增殖）、平滑肌收缩性以及纤维化有关。目前的治疗方法包括使用α-肾上腺素能受体阻滞剂调节膀胱和前列腺内的平滑肌张力以缓解LUTS，和/或使用5α-还原酶抑制剂减少雄激素代谢并缩小前列腺体积。建立更理想的疾病模型（包括小鼠及其他动物模型），以准确研究该疾病过程中各种致病因素和治疗因素随时间变化的影响，具有重要意义9。

啮齿类动物模型已被广泛用于研究尿动力学；然而，大多数研究集中于女性排尿及其相关疾病10。为了全面研究男性下尿路症状（LUTS）的各个方面，研究人员已开发并使用啮齿类动物模型来探讨良性前列腺增生（BPH）的不同特征，包括细胞增殖、平滑肌功能、胶原沉积以及炎症等方面的变化11,12,13,14。然而，啮齿类动物与人类的前列腺解剖结构存在差异。人类前列腺结构致密，并被一层致密的纤维肌性包膜包裹，而啮齿类动物的前列腺则呈分叶状；这些差异使得疾病进展和治疗效果的直接比较变得复杂。此外，在小鼠中评估LUTS较为困难，因为无法直接测量患者的困扰程度。目前的研究方法通常将组织学特征与生理学特征（例如，膀胱容量和膀胱壁厚度与尿流率测定、排尿斑点实验以及膀胱压力测定终点数据）相关联，以比较BPH模型动物与对照动物之间的排尿功能障碍程度12,15,16,17,18。生理学特征通常作为死后解剖的终点进行评估，且无法在同一只动物体内随时间观察膀胱出口梗阻（BOO）的变化。最近，我们通过死后解剖评估发现，在盆腔尿道的一个亚区（前列腺部尿道）中，外源性激素植入会导致该区域狭窄12。目前的方法尚无法实现对排尿过程中尿道狭窄的直接活体评估。

超声是一种非侵入性诊断和评估技术，已成功应用于其他疾病模型。该技术可用于量化器官体积并评估血管血流19,20,21。超声还可用于可视化和引导微注射，实现干细胞或其他药物的靶向注射，并可用于评估心脏的收缩和舒张功能。

本方案描述了使用高频超声评估麻醉小鼠下尿路解剖结构及尿液生理功能的方法。我们介绍了利用超声测量膀胱容积和膀胱壁厚度的技术。此外，还介绍了使用增强对比超声测量尿流速度、尿液体积、排尿持续时间以及尿道直径的方法。超声技术的应用可更全面地了解体内下尿路的功能状态，明确疾病如何改变正常的排尿功能，并为我们提供更有效的工具以评估新型治疗方案的效果。目前，非对比成像方案为非终末性操作，而现有的增强对比成像方案则属于终末性操作。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 动物准备

  1. 将一只24月龄的C57Bl6/J雄性小鼠放入预先充有3-5%异氟烷的麻醉室中，直至其翻正反射消失且呼吸频率减慢。
  2. 如有需要，使用电推剪剃除动物腹部用于手术和/或成像区域的毛发，并用脱毛膏彻底清除残留的毛发。 
  3. 将小鼠仰卧置于带有2%异氟烷的鼻罩中，并放置于加热平台上以维持麻醉状态。通过检测动物对足底回缩反射的反应是否消失来确认麻醉深度（图1B）。

2. 超声设备设置

  1. 将中心频率为 30 MHz 的 MV707 探头连接至主动端口，应用预设为 "腹部影像学图1A).
  2. 将超声探头平行于膀胱的长轴放置（图1C).
  3. 膀胱、前列腺和尿道的长轴与短轴B型超声图像图1D).
  4. 使用 "使用显微操作器（xy" 微操作器）移动小鼠。

3. 无对比剂成像方案

  1. 使用线性距离测量工具，在获取B模式图像后，沿膀胱壁外缘至内缘追踪，测量膀胱壁厚度。
  2. 在3D模式图像采集时，使用容积测量工具沿膀胱壁内侧进行描记以创建轮廓，系统将通过膀胱壁厚度生成多个轮廓，从而计算膀胱的3D容积。

4. 微泡造影剂的重悬/活化

  1. 通过在涡旋混合器中振荡45秒来激活造影剂（例如DEFINITY），使微泡包封于溶液中。此步骤对获得最佳的对比度增强至关重要。

5. 导管插入

  1. 将小鼠麻醉后固定在加热平台上，使用直头锐性/钝性剪刀经皮肤和腹壁做正中切口，暴露膀胱。
  2. 将连接聚乙烯软管（PE 50）的27号针头插入膀胱，聚乙烯软管另一端连接注射器。预先用生理盐水充满软管，以确保注入膀胱时无气泡。

6. 增强对比成像方案

  1. 为确认针头位置，向内注入10 µL生理盐水 通过超声观察的同时对膀胱进行操作。
  2. 将生理盐水注射器更换为含造影剂的注射器，以更好地显示尿道壁及排尿过程，因为尿道通常处于塌陷状态。获得完整的尿道长轴图像并保存后，将探头旋转90°，获取短轴切面及M型超声图像。
  3. 以每3秒0.5 mL的速度向膀胱内注入微泡造影剂，直至发生排尿事件。
  4. 首次排尿事件期间，使用线性距离测量工具，测量多普勒速度采样窗位置处的尿道直径，从边缘到边缘进行测量。
  5. 在准确定位尿道后，调整探头相对于尿道的角度，使其更平行于尿液流动方向。
  6. 向膀胱内注入第二剂微泡，使用速度时间积分（VTI）工具测量事件速度。
  7. 数据采集后，采用颈椎脱位法处死小鼠。

7. 数据计算与分析

  1. 选择 VTI 工具，通过追踪记录的图像来测量速度。
  2. 使用 B 模或 M 模图像，按照“前缘至前缘”的原则测量尿道直径。
  3. 利用上述图像测量结果，通过以下公式计算横截面积（CSA）。
  4. 利用尿道的横截面积与多普勒频谱曲线下的面积（速度时间积分）相乘，计算排尿量（CSA × VTI = 体积）。
  5. 假设尿液密度为每立方厘米一克，计算实际排出的尿液体积。

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结果

根据实验设计和终点测量指标，超声检查可选择是否使用对比增强。小鼠采用异氟烷麻醉，并剃除毛发，再用脱毛膏彻底清除残留毛发。将麻醉后的小鼠置于加热平台上，超声探头沿膀胱长轴位置放置（图1）。

图2展示了在未使用对比剂的情况下获取的小鼠膀胱代表性超声图像。膀胱壁呈高回声（白色），并使用软件测量工具测量膀胱壁厚度。可通过重建膀胱表面投影来确定膀胱容积、壁厚度和壁体积（表1）。

对于增强对比的膀胱及下尿路成像，需将导管插入膀胱并注入微泡造影剂。为获得最佳成像效果，必须按照制造商的说明对微泡进行激活。图3展示了一个充满微泡的膀胱的代表性图像。此时膀胱呈高回声（在图像中显示为白色）。通过低频超声脉冲可破坏微泡，使膀胱暂时变为低回声（显示为黑色），随后微泡重新形成，从而确认该结构为膀胱。在破坏脉冲期间，发射功率升至100%，发射频率...

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讨论

目前评估啮齿类动物下尿路的技术受限于其无法直接关联排尿生理变化与疾病进展所导致的前列腺组织学改变。排尿斑点分析和尿流率测定可用于评估啮齿类动物的自发排尿事件，这些技术可用于在一段时间内评估变化15,16,17。然而，对于这两种技术，在测试开始前无法评估膀胱充盈程度。此外，排尿变化可能由行为因素引起，而非疾病进展的直接结果，这使得确定疾病对排尿影响的程度变得困难。膀胱压力测定是另一种用于评估啮齿类动物膀胱功能障碍的技术，可提供对膀胱功能的活体评估16。然而，啮齿类动物前列腺对排尿功能的动态影响尚不明确。既往研究已记录了与排尿功能改变相关的鼠类尿道组织学变化12。然而，这些研究仅能观察单一时间点的情况，且无法在进行功能测试的同时评估膀胱、前列腺和尿道的解剖结构。其他评估膀胱内变化（如质量、体积）的方法则只能在动物安乐死后进行1...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

我们感谢Emily Ricke、Kristen Uchtmann以及Ricke实验室在动物饲养方面提供的帮助以及对本手稿的反馈意见。我们感谢NIDDK和NIEHS为这些研究提供的经费支持：U54 DK104310（WAR、JAM、PCM、CMV、DEB），R01 ES001332（WAR、CMV），K12 DK100022（TTL、AR-A、DH）。本研究内容由作者全权负责，不代表NIH的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
21毫米透明导管Supera Anesthesia Innov301-150
27号针头BDZ192376
四通道歧管Supera Anesthesia InnovRES536
DEFINITYLantheus Medical ImagingDE4
F/AIR 罐Supera Anesthesia Innov80120
Graefe 镊子（带齿、直型）F.S.T.11050-10
进出口接头Supera Anesthesia InnovVAP203/4
异氟烷Midwest Vet Supply193.33161.3
异氟烷挥发器Supera Anesthesia InnovVAP3000
MV707 探头Fujifilm VisualSonics Inc
氧气流量计Supera Anesthesia InnovOXY660
聚乙烯50导管BD427516
减压阀/压力表Supera Anesthesia InnovOXY508
重复呼吸回路Supera Anesthesia InnovCIR529
小鼠用小型鼻罩Supera Anesthesia InovACC526
无菌生理盐水Midwest Vet Supply193.74504.3NaCl 0.9%，可注射
直型尖头/钝头剪刀Fine Scientific Tools (F.S.T)14054-13
注射器BD3096465mL
Vevo 770Fujifilm VisualSonics Inc
VIALMIXLantheus Medical ImagingVMIX

参考文献

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