从富集的人类记忆B细胞群体中筛选和回收具有理想特异性的抗体的单细胞筛选方法

摘要

通过流式细胞术结合单细胞PCR与克隆技术，BSelex方法可用于从人外周血单个核细胞中鉴定并回收特异性抗原抗体。

摘要

人类抗体库是尚未充分开发的潜在治疗性抗体和有用生物标志物的重要来源。尽管当前的计算方法（如下一代测序技术，NGS）能够在序列水平上产生大量关于抗体库的数据，但仍需要功能数据来确定哪些序列对特定抗原或一组抗原具有相关性。本文介绍一种从人类献血者的外周血单个核细胞（PBMCs）中识别并回收单个抗原特异性抗体的方法。该方法首先对成熟B细胞进行富集，并结合表型细胞标志物与荧光标记蛋白，通过流式细胞术分离IgG记忆B细胞。随后对重链和轻链可变区进行克隆并重新筛选。尽管该方法仅限于记忆B细胞群体，但它利用流式细胞术检测数百万个B细胞，能够以适合表达和特异性验证的格式，获得来自单个细胞的配对重链与轻链序列。通过该方法获得的抗体可被评估其治疗潜力，也可结合生物信息学方法将特异性与功能关联，用于分析个体内的B细胞库。

引言

抗体是一类不断发展的治疗性分子，而任何人体内现有的B细胞库都是此类抗体的潜在来源。从人类供体中获取的抗体无需进行适应性改造或"人源化"步骤，而这些步骤是其他动物系统中产生的抗体所必需的。目前已有多种方法可用于鉴定和分离人源抗体，包括B细胞活化与增殖¹、通过EBV转化实现永生化^2,3，以及杂交瘤细胞系的建立^4,5。然而，所有这些方法都需要大量的细胞培养工作，以筛选和获得抗原特异性抗体。随着下一代测序（NGS）技术的发展，人们对人源抗体库的认识得到了极大拓展，使得能够鉴定供体样本中存在的大量个体序列。然而，由于NGS提供的是对所有存在序列的无偏视图，因此无法实现对抗原特异性抗体的鉴定与分离，尤其是在稀有或低频抗体的情况下。

该实验的目的在于 "“BSelex”方法旨在从人类供体的外周血单个核细胞中鉴定抗原特异性抗体，并分离和回收这些抗体的序列以进行进一步分析。该方法利用流式细胞术和细胞分选技术，针对记忆B细胞表面表达的B细胞受体（BCR）进行筛选。在启动通量较低的分子生物学方法之前，可通过流式细胞术对数百万个B细胞进行抗原特异性筛选。大多数NGS方法在批量分析细胞序列时无法实现重链与轻链的配对鉴定。而本文所述方法可对单个细胞进行分离，实现重链和轻链序列的配对回收，从而允许直接克隆并表达完整的IgG。

方案

使用人类志愿者样本遵循斯克里普斯研究所机构审查委员会批准的方案。在献血前，已从捐献者处获得知情同意。

1. 试剂配制

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）
   1. 通过Ficoll-Plaque Plus分离法从健康人供体中分离外周血单个核细胞。以每毫升含5000万个细胞的浓度，用90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）进行冻存。先将细胞在-80 °C条件下冷冻，随后转移至液氮中长期保存。
2. 用于分选的靶抗原肽标记
   1. 制备或获取针对目标蛋白的特异性肽段（长度不超过70个残基），并在末端连接生物素。
   2. 在不同的离心管中，分别将每种生物素化肽段各4 nmol与共价连接了PE（R-藻红蛋白）或APC（别藻蓝蛋白）的链霉亲和素进行标记。按9:1的肽段与链霉亲和素（SA）摩尔比进行配制，SA-PE终浓度约为3.2 µM，SA-APC终浓度约为5.7 µM。同时制备生物素四聚体作为阴性对照。
   3. 将各肽段混合物在4 °C避光、缓慢振荡条件下孵育过夜。
   4. 将标记后的肽段通过含有聚丙烯酰胺珠的微柱，以去除未结合的荧光染料。
   5. 肽段四聚体可在4 °C条件下储存最多2个月。

2. 细胞分选

1. 在进行 CD22+ 分离前至少 1 小时至 16 小时，解冻供体 PBMCs 并于 37 °C 静置。
   1. 从冰箱中取出冻存的外周血单个核细胞小管，立即放入37 °C水浴中。当小管几乎完全解冻时，转移至工作区域。
   2. 将每支小瓶中的内容物转移至含有预热培养基的50 mL离心管中（保持不同供体分开）。加入培养基至终体积为50 mL。轻轻混匀管内物质。
   3. 370 x g 离心 g 室温孵育6分钟。弃去上清液，将细胞重悬于15 mL RPMI完全培养基中，并进行细胞计数。
   4. 调整细胞浓度至 2.0 x 10⁷ 以 RPMI 完全培养基重悬至细胞密度为 cells/mL，转移至 T75 培养瓶或更大容器中，于 37 °C 培养至少 1 小时，最长可至 16 小时，以使冻存细胞恢复。
   5. 收集细胞（可根据需要合并），在370 x g下离心 g 4 °C下离心6分钟。弃去上清液，将细胞重悬于5 mL预冷的MACS缓冲液（PBS，pH 7.6，含0.5% BSA和2 mM EDTA）中，用MACS缓冲液定容至50 mL，并进行细胞计数。
   6. 以 400 x g 离心细胞 g 4 °C下离心7分钟。
   7. 分离CD22⁺ 通过CD22微珠捕获进行阳性选择分离B细胞。所有洗涤步骤均使用MACS缓冲液。计数后以400 × g离心 g 4 °C下离心7分钟。预期回收率占总PBMC群体的5-10%。
   8. 将细胞重悬于FACS缓冲液（含0.5% BSA和2 mM EDTA的Tris缓冲液，pH 8.0）中，浓度为4000万细胞/mL，随后对供体细胞进行单独或混合染色。
2. 用于记忆B细胞分选的细胞染色
   1. 取出部分细胞用于流式细胞仪的校准及所用每种荧光染料的补偿调节。以未染色细胞作为对照。
   2. 计算针对CD22抗体的最终染色体积⁺ 每100 μL染色200万个细胞后获得的细胞
   3. 加入B细胞的细胞外标记物（CD19-PerCP-Cy5.5）、IgG（IgG-FITC）以及记忆细胞区室标记物（CD27-PECy7），按照生产商推荐的稀释比例添加，并轻轻混匀。分装10 μL⁷ 将细胞转移至1.5 mL离心管中作为阴性对照，并将剩余细胞转移至15 mL离心管中。
   4. 将双标记的生物素-SA四聚体以每种（PE和APC）36 nM的终浓度加入阴性对照管中，乘以分选管中肽段的数量，并用FACS缓冲液调整终体积至0.5 mL（例如，10种肽段 × 36 nM = 360 nM）。
   5. 将PE和APC标记的肽四聚体分别以36 nM的终浓度加入分选管中，并将细胞调整至2×10⁶⁶ 每100 μL用TBS缓冲液重悬，在4 °C避光、温和旋转条件下孵育30–60分钟。
   6. 4 °C 下以 400 x g 离心洗涤 2 次 g，7 分钟，最后一次洗涤前取出等分试样进行计数。使用 5 mL 带滤帽离心管过滤细胞。分选前加入 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染料至终浓度 0.3 µM，作为细胞膜完整性的标记。
3. 通过流式细胞术进行单细胞分选
   1. 准备用于分选的96孔PCR板中的48个孔。
      1. 配制主混合液：每份样品加入 2 μL 10x RT 缓冲液、0.5 μL RNase 抑制剂、7.5 μL 无菌 PCR 级水。每孔分装 10 μL，盖好后置于 4 °C 保存，待分选时使用。
   2. 在细胞分选仪上运行阴性对照，分析整个样本。
      1. 设置流式细胞术门控以分离用于单细胞分选的适当细胞群体。
         1. 绘制FSC面积与SSC面积的关系图，并设置R1门以分离淋巴细胞。
         2. 绘制FSC高度与FSC宽度的散点图，并设置门控R3以排除FSC双联体。
         3. 绘制SSC高度与SSC宽度的关系图，并设置门R4以排除SSC双联体。
         4. 绘制SSC高度与DAPI的关系图，并设置门控R5以分离活细胞（DAPI^-).
         5. 绘制IgG与CD19的散点图，并设置R6门以圈定IgG⁺ B细胞（CD19⁺ IgG⁺).
         6. 绘制IgG与CD27的散点图，并设置R7门以圈选记忆B细胞（CD27^高).
         7. 绘制抗原-PE（Ag-PE）与抗原-APC（Ag-APC）散点图，并将Ag-PE设为门R8⁺/Ag-APC⁺ 双阳性门内事件数较少的象限。
   3. 从抗原阳性（Ag）样本中收集等量的记忆细胞⁺用于信噪比测定的样本
   4. 分选具有 CD19 表型的单个细胞⁺ CD27⁺ Ag-PE⁺ Ag-APC⁺ （门控R8）加入预先准备的96孔PCR板中。
   5. 用铝箔胶带封板，400 × g 离心 1 分钟，随后于 -80 °C 保存，以备后续克隆使用。

3. 单细胞克隆

1. 逆转录反应
   1. 将单个B细胞分选板从-80 °C取出，在冰上解冻2分钟。以3,300 × g离心2分钟，使液体汇集至各孔底部后再打开。
   2. 配制含有10%非离子型去污剂和oligo(dT)作为逆转录引物的dNTP/缓冲液主混合液。向含有单个细胞的每个孔中加入酶混合液，切勿混匀。
   3. 在65 °C孵育5分钟。加入含有100 mM DTT、RNase抑制剂和逆转录酶的酶主混合液，使总体积达到20 µL。在50 °C孵育10分钟，然后在80 °C孵育10分钟。
   4. 在开始PCR步骤前转移至冰上
2. 多步巢式PCR反应
   1. 分别使用独立的巢式PCR反应扩增重链（HC）和轻链（LC）。
   2. 在第一轮PCR扩增（步骤I）中，使用一组正向引物和单一的反向引物，在独立的PCR反应中分别扩增HC和LC的可变区（图2）。设计上，该组正向引物可扩增大部分胚系前导（L）序列，而反向引物则特异性针对每条链下游的恒定区，包括轻链中的kappa（κ）和lambda（λ）¹⁶。
      1. 以2.5 µL cDNA产物作为每个PCR（步骤I）反应的模板。每种引物的终浓度为1 µM。将10×聚合酶缓冲液稀释至2×浓度，每反应总体积补至25 µL。HC PCR反应程序为：[94 °C/4 min；94 °C/15 s，55 °C/20 s，68 °C/60 s；68 °C/3 min]，共50个循环。LC PCR反应程序为：[98 °C/4 min；98 °C/15 s，72 °C/20 s，72 °C/60 s；72 °C/3 min]，共50个循环。
   3. 以2.5 µL步骤I的产物作为每个（步骤II）PCR反应的模板。加入特异性针对HC和LC（κ和λ）框架区1（framework 1）的一组正向引物，以及特异性针对每条抗体链连接区的一组反向引物。将10×聚合酶缓冲液稀释至2×浓度，并按照与步骤I相同的参数进行50个循环的PCR扩增。
   4. 将完成的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以观察阳性扩增条带。回收成对的扩增子（来自同一细胞的重链和轻链），并通过凝胶回收试剂盒进行纯化。通过OD₂₆₀测定DNA片段浓度，以准确计算连接反应体系。
   5. 使用商业化试剂盒，通过四片段连接反应将回收的重链和轻链片段与连接子片段及表达载体骨架连接。
   6. 使用商业化试剂盒将连接产物转化至感受态细菌中。接种至含抗生素的平板后，向剩余的转化菌液中加入4 mL含抗生素的培养基，在37 °C、250 rpm条件下过夜培养。此即为"连接混合物培养液"。
   7. 使用商业化试剂盒从过夜培养的连接混合物培养液中提取质粒DNA，并测定所得质粒DNA的浓度。

4. 通过ELISA筛选确认抗原特异性

1. 将10 µg质粒DNA与阳离子脂质转染试剂共同转染至10 mL悬浮培养的293细胞中，在37 °C、8% CO₂条件下以125 rpm振荡培养3–4天。收获时，将细胞培养物在1,000 × g离心10分钟，并收集澄清的上清液。
   1. 通过蛋白A亲和法测定上清液中的IgG浓度。
   2. 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测每种IgG（在上清液中），浓度为20 µg/mL，靶标为分选时所用的各个肽段，肽段固定于链霉亲和素包被的板上；以肌动蛋白作为阴性对照。采用辣根过氧化物酶标记的 goat anti-human 二抗识别人IgG Fab段，以检测重组克隆。扣除背景后，OD值> 0.5 定义为筛选阳性。
   3. 通过进一步ELISA验证筛选阳性的克隆，使用IgG上清液进行系列稀释，起始浓度为每毫升20 µg，绘制针对初始ELISA筛选中显示反应性的各抗原的OD值浓度曲线。

结果

本方法涵盖从人类供体中分离抗原特异性抗体的多步流程。在此处展示的代表性数据中，细胞与一组荧光标记的多肽混合物共同孵育，这些多肽代表了tau蛋白的多个不同结构域，包括模拟潜在磷酸化位点的磷酸化多肽。这些多肽作为“诱饵”用于识别对特定tau表位具有反应性的细胞。在分选准备过程中，使用一组荧光标记的表型标志物来鉴定富集后的B细胞群体中的不同细胞亚群。通过一系列流式细胞术设门策略来分离目标记忆B细胞（图1）。在流式细胞术中，根据细胞大小和颗粒度，利用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图对淋巴细胞进行圈选^6,7。在排除多重细胞（“双联体”）和死亡细胞后，通过IgG、CD19（B细胞）和CD27（记忆）等表型标志物进一步区分IgG⁺记忆B细胞。在此方法中，CD27标志物的表达不呈现明显的双峰分布，因此将CD27⁺表达水平最高的前45%细胞纳入最终设门范围。最后，在APC和PE两种荧光染料上均呈双阳性的细胞位于设门图的右上象限，表明其对两种标记多肽均有反应性。位于设定门区内的细胞被分离并分选至96孔板的各个独立孔中。使用两种不同标签标记的抗原可提高信噪比，并减少后续分子生物学操作中的假阳性数量。经分选的细胞约占最终门内记忆B细胞的0.1%，占起始细胞样本的0.001%。

单细胞克隆的首个检测结果是确认相应重链和轻链可变区的扩增（图2）。由于目标是成对回收两条扩增产物，因此将PCR反应产物在琼脂糖凝胶上并排电泳，挑选出匹配的条带进行切胶并提取DNA片段。典型的扩增效率为重链30–50%，轻链（κ链）50–70%。成对扩增产物的回收效率通常在25–40%之间。这些效率因供体样本池而异，代表性数据（图3）显示了来自24个单细胞的高效扩增结果（成对回收率达42%）。在完成IgG克隆后，将IgG表达载体转染至人胚胎肾（HEK-293）悬浮细胞中，以最大化蛋白表达量。使用无血清培养基可减少重组抗体制备物中的杂质蛋白，有助于降低后续结合实验中的背景噪声。回收的抗体将通过ELISA方法针对原始的tau多肽组合进行筛选，并根据反应性进行评分（图4）。以OD值超过背景0.5作为初始阈值，判断为抗原阳性反应；β-actin蛋白则用作非特异性结合的对照。如果流式细胞术及分选步骤使用的是混合多肽池，则筛选ELISA是解析回收IgG特异性反应性的第一步。在检测的10种IgG中，有3种对磷酸化的CBTAU22.1多肽表现出反应性，1种对非磷酸化的CBTAU27.1多肽有反应（图4A）。进一步通过相同重组抗体样品对初筛中鉴定出的多肽进行浓度梯度实验，另设一种多肽作为阴性对照，以进行额外验证（图4B）。对于每一个阳性结果，均从转化后的克隆池中分离出单个质粒克隆，并通过相同的ELISA方法重新验证。图中仅展示了克隆34的数据，结果显示其对非磷酸化的CBTAU27.1多肽的反应性得到确认，但也观察到其对磷酸化的27.1多肽存在较低亲和力的结合（图4C）。

图1：通过流式细胞术分离抗原反应性单细胞。（A）显示一个代表性图谱，其中淋巴细胞群体位于所划定的门控区域内。（B）根据前向散射和侧向散射（FSC-高度 对 FSC-宽度（R3）；SSC-高度 对 SSC-宽度（R4））设置门控以排除双联体。仅门控区域内的细胞进入后续分析。DAPI⁺细胞被视为死亡细胞并被排除（R5）。本实验共检测了3.7 × 10⁷个“活”细胞。活细胞中大部分为B细胞（CD19⁺），从中分离出IgG⁺细胞（4.66%）（R6）。CD27⁺记忆细胞中荧光信号最强的前43.2%被纳入选择门控（R7）。（C）第二象限（Q2）包含对两种标记抗原均有反应的细胞（肽-APC 对 肽-PE），这些细胞被分选并单独回收至96孔板中。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：PCR扩增回收IgG重链和轻链可变区序列用于克隆。（A）使用巢式PCR反应同时回收重链（VH）和轻链（Vk或Vl）的可变区。第一步引物从前导序列（leader sequence）起始正向扩增，并从恒定区内部反向扩增。多个箭头代表7-12种引物的混合物，用于确保对可能的种系序列实现广泛覆盖。第二步引物为巢式引物，特异性结合可变区开放阅读框的两端，并在扩增产物末端添加与表达载体中相邻序列同源的序列。（B）连接片段包含恒定轻链（Ck或Cl），随后是重链启动子和一段非天然的信号肽序列。扩增产物、连接片段和质粒骨架通过第二步PCR扩增产生的重叠同源序列同时进行连接，并以完整质粒形式被分离。最终表达载体中的重组重链和轻链由独立（且相同）的CMV启动子驱动，翻译为两种独立的蛋白质。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：从单个细胞中回收IgG重链和轻链可变区扩增产物。嵌套PCR反应（步骤II）直接上样至1%琼脂糖凝胶并进行可视化检测。来自同一细胞的重链（H）和κ轻链（L）PCR反应产物上样于相邻加样孔，以便于观察成对的扩增片段。成功的重链和轻链扩增产物大小分别约为400 bp和350 bp。成功回收的成对扩增产物以（*）标示。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：通过重组 IgG 验证抗原特异性。 将含有回收的重链和轻链序列的质粒转染至 HEK 细胞中进行表达。四天后，通过 ELISA 检测重组抗体的反应性。（A）测定澄清培养基中的 IgG 浓度，并稀释至 20 µg/mL。用于分选的肽段混合物在链霉亲和素包被的酶标板上以每孔 40 pmol 的量分别进行检测。所有 IgG 均设置复孔检测。（B）对 OD450 值>0.5 的克隆（克隆 #32、#34、#35）进行重新检测，采用 1:5 梯度稀释法针对筛选中鉴定出的肽段进行验证。（C）确认为阳性后，从克隆 #34 的转化连接产物中分离单个质粒克隆，进行转染并通过 ELISA 重新验证。克隆 #32 和 #35 也进行了相同操作（数据未显示）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍的方法结合了流式细胞术和单细胞克隆技术，所描述的方法基于Tiller及其同事先前开发的方法¹¹。他们的研究描述了单克隆抗体的回收与克隆，旨在单细胞水平上研究人类B细胞受体库。我们对该方法的主要步骤进行了改进，使其能够从记忆B细胞群体中回收抗原特异性的单克隆抗体，包括采用多步扩增引物策略。主要的改进在于加入了标记抗原作为"诱饵"。此外，我们还对已发表的实验方案进行了其他优化，包括（但不限于）将克隆载体骨架改造为单一表达质粒、增加对种系受体库（包括信号肽序列和框架区1）的引物覆盖范围、转染悬浮培养的HEK293细胞以提高表达水平，以及在PCR扩增过程中使用高保真聚合酶。

在本文所述方法中，最关键的步骤集中在流式细胞术与单细胞克隆之间的过渡环节。首先，将分选后的单个细胞准确地放置到孔板中至关重要。在分选仪上正确设置液滴延迟时间是关键步骤之一。还需考虑环境因素，例如低湿度环境；我们发现，除非在目标分选板上使用防静电枪，否则细胞回收效率会显著下降。在完成细胞放置后，需对孔板进行离心，以确保细胞与孔底的10 µL缓冲液充分接触。上述所有措施对于后续分子生物学实验的成功至关重要。如果单个细胞的逆转录反应条件不理想，即使对β-actin进行PCR扩增也可能变得困难。本方法的优势在于能够检测数百万个细胞，并仅分选出符合针对目标抗原的抗原反应性标准的细胞。这要求信噪比尽可能高，因此需要在分选前优化诱饵抗原的浓度。采用双标记的抗原诱饵有助于减少假阳性细胞的回收，因为单一荧光染料可能存在较高的背景信号。使用多种抗原诱饵可能会增加信噪比优化的难度，但该方法的另一优势在于能够同时检测多个肽段。

当回收效率较低时，可使用一组嵌套式β-actin引物来确认模板cDNA的存在。该方法的缺点在于难以判断是由于孔中原本无细胞，还是逆转录反应失败所致，从而增加了故障排查的难度。偶尔也会出现相反情况，即回收效率高于预期。重链的典型回收率为30–45%，轻链则更高，为40–60%。每个PCR反应（第一步 & II）采用50个循环从单个细胞进行扩增。总循环数较高也使得该方法容易受到污染。通过对扩增产物进行序列分析，可以判断是否存在污染物引入，或是否真正实现了异常高的回收率。

该方法在回收针对特定抗原的天然人源抗体方面存在若干重要局限性。首先，流式细胞术中仅能使用可标记的可溶性蛋白作为"诱饵"。在代表性结果所展示的实验中，我们采用了由tau蛋白合成的一系列重叠线性肽段，因为使用完整蛋白的尝试被证明较为困难。使用线性肽段可能并非最佳选择，因其可能限制对非线性或构象性表位抗体的识别。然而，我们仍成功鉴定出多个针对tau蛋白的独特抗体，目前这些抗体正在接受进一步评估^8,9。另一项局限性在于IgG抗体的分子生物学回收与克隆过程通量较低。初始分选策略可实现对数百万个细胞的筛选，但后续的分子生物学操作包含多个步骤。尽管目前正在进行优化，尝试引入如Gibson Assembly¹⁰等新技术以简化多个流程，但瓶颈仍在于单个重链与轻链配对的克隆环节。

的 "“BSelex”方法利用记忆B细胞表面表达的BCR来鉴定具有抗原反应性的细胞，随后通过流式细胞术回收这些单个细胞^11,12由于该方法依赖于BCR，因此仅限于记忆B细胞群体，无法捕获抗体分泌细胞（ASCs），例如浆母细胞。然而，与ASCs相比，该方法在回收更广泛的抗原特异性免疫球蛋白库方面可能具有优势。流感疫苗研究显示，尽管反应性ASCs通常由少数扩增的B细胞克隆主导，抗原特异性记忆B细胞群体却很少呈现单克隆特征¹²T细胞表面的T细胞受体（TCR）在基因排列和重排机制上与B细胞受体相似，以实现多样性的最大化。类似于本文所述方法的单细胞技术已用于评估T细胞受体库，包括α链和β链的回收及单细胞克隆¹³然而，T细胞受体（TCR）的识别需要肽段由MHC分子呈递，这为利用标记饵料法鉴定肽特异性T细胞带来了显著的复杂性。与B细胞不同，T细胞不会对整个可变区进行亲和力成熟，因此只需鉴定短小的CDR3区及其部分侧翼序列，即可实现T细胞的识别与重建。最后，本方法描述了通过流式细胞术鉴定IgG分子，但也可使用其他表型标志物来鉴定不同同种型的B细胞。

目前，研究人员正在开发一些方法，以将下一代测序技术产生的海量数据与抗原特异性的功能分析相连接，但这些方法仍在不断完善中。尽管存在局限性，本文所述方法已成功用于发现对传染性和非传染性疾病具有潜在治疗价值的抗体^8,14,15，并代表了一种可靠的技术途径，可直接从人体中回收相关抗原特异性的IgG抗体，而无需对B细胞进行大规模操作或长时间的细胞培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MoFlo Astrio EQ 细胞分选仪	MoFlo		细胞分选
生物素化肽段	New England Peptide		细胞分选 "诱饵"
Micro Bio-spin P30 凝胶柱	BioRad	#7326223
链霉亲和素（R-PE）	Thermo Scientific	SA10041
链霉亲和素（APC）	Thermo Scientific	S32362
CD22 MicroBeads，人源	Miltenyi	#130-046-401
LS 柱	Miltenyi	#130-042-401
预分离滤器	Miltenyi	#130-041-407
PerCp-Cy5.5 标记的小鼠抗人 CD19 抗体	BD Biosciences	BD#340951
PE-Cy7 标记的小鼠抗人 CD27 抗体	BD Biosciences	#560609
FITC 标记的小鼠抗人 IgG 抗体	BD Biosciences	#560952
DAPI	Life Technologies	#D21490
RNaseOUT	Life Technologies	#10777-019
牛血清白蛋白，第五组分	Sigma	#A4503
RPMI 培养基	Hyclone	#SH30096.01
热灭活胎牛血清（HI FBS）	Invitrogen	#10082147
Mastercycler Gradient	Eppendorf	型号 #6325	PCR 仪
PCR 96 孔板	Phenix	MPS-500
PCR 板封膜	Phenix	SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR 脱氧核苷酸混合物	Clontech	#639125
Superscript IV 第一链合成系统	Invitrogen	#18091050
Phusion 高保真聚合酶	Thermo Scientific	F-531-L
Platinum 聚合酶	Invitrogen	#10966108
无核酸酶水	QIAGEN	#129114
寡核苷酸引物	IDT	多种	所有 PCR 步骤所用引物
凝胶回收试剂盒	QIAGEN	#28706
PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	#28106
质粒小提试剂盒	QIAGEN	#27106
NEBuilder HiFi DNA 组装克隆试剂盒	New England Biolabs	E5520S	Gibson 组装
Expi293 表达培养基	Invitrogen	#A14351-01
ExpiFectamine 293 转染试剂盒	Invitrogen	#A14525
Opti-MEM 培养基	Invitrogen	#31985070
CO2 培养箱（Multitron）
Octet RED384 系统	Pall/ Forte Bio
Pierce 链霉亲和素包被高结合力透明 96 孔板	Thermo Scientific	#15500
Corning Costar 96 孔聚苯乙烯高结合半面积板	Corning	#3690
山羊抗人 IgG Fab 二抗	Jackson Labs	#109-036-097
山羊抗小鼠 HRP 二抗	Jackson Labs	#115-035-072
SureBlueTM TMB 微孔过氧化物酶底物（单组分）	KPL	#52-00-03
TMB 终止液	KPL	#50-85-06