体内免疫荧光定位（IVIL）方法可用于研究抗体及抗体偶联物在活体生物体内的生物分布，该方法结合了体内肿瘤靶向与离体免疫染色技术，适用于肿瘤学研究。
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摘要
摘要
单克隆抗体（mAbs）是癌症检测、诊断和治疗中的重要工具。它们可用于揭示蛋白质在肿瘤发生中的作用，可靶向癌症生物标志物以实现肿瘤的检测与表征，并可用于癌症治疗，例如作为单克隆抗体或抗体-药物偶联物，以激活免疫效应细胞、抑制信号通路，或直接杀伤携带特定抗原的细胞。尽管在新型高特异性单克隆抗体的研发与生产方面已取得临床进展，但诊断和治疗应用仍可能受到肿瘤微环境复杂性与异质性的限制。因此，为了开发高效的基于抗体的治疗与诊断手段，评估抗体偶联物在活体肿瘤微环境中的生物分布及其相互作用至关重要。本文介绍了一种名为体内免疫荧光定位（IVIL）的新方法，用于研究抗体类治疗剂和诊断剂在体内生理与病理条件下的相互作用。该技术通过静脉注射将治疗性或诊断性抗原特异性抗体注入 体内，随后利用二抗在离体肿瘤中进行定位。因此，IVIL 能够反映抗体类药物及靶向剂在体内的生物分布情况。文中描述了两种 IVIL 应用实例，用于评估用于乳腺癌分子成像的抗体类对比剂的生物分布与可及性。本方案将有助于未来研究者将其自身基于抗体的研究应用适配于 IVIL 方法。
引言
单克隆抗体（mAb）是一类属于免疫球蛋白超家族的大型糖蛋白（分子量约为150 kDa），由B细胞分泌，在免疫系统中的主要功能是识别细菌或病毒病原体，并通过抑制其生物学功能或标记其以被清除；此外，单克隆抗体还能识别癌细胞上异常表达的蛋白质1。抗体可对其特异性表位达到飞摩尔浓度级别的极高亲和力，使其成为生物医学领域极具前景的工具2。随着Milstein和Köhler开发的杂交瘤技术（该成果获得1984年诺贝尔奖），单克隆抗体的生产成为可能3。随后，通过噬菌体展示技术或转基因小鼠品系成功制备出人源单克隆抗体，极大地推动了其作为新型研究工具和治疗药物的应用4,5。
癌症是全球性的健康问题，也是导致死亡的主要原因，因此需要开发新的预防、检测和治疗方法6。迄今为止，单克隆抗体（mAbs）已帮助阐明基因及其编码蛋白在肿瘤发生中的作用；当靶向癌症生物标志物时，可用于肿瘤的检测与表征，从而实现患者的分层。在癌症治疗方面，双特异性单克隆抗体、抗体-药物偶联物以及较小的抗体片段正被开发为治疗药物，用于靶向药物递送以提高治疗效果7。此外，抗体还可用于将对比剂靶向至生物标志物，应用于分子成像技术，如荧光引导手术、光声（PA）成像、超声（US）分子成像，以及临床常用的正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射计算机断层扫描（SPECT）8。最后，抗体还可作为诊疗一体化试剂，实现患者分层及靶向治疗疗效的监测9。因此，新型单克隆抗体正逐渐在癌症的检测、诊断和治疗中发挥关键作用。
尽管在新型高特异性单克隆抗体的开发与生产方面已取得关键性进展，但由于肿瘤微环境的复杂性，其诊断与治疗应用可能失效。抗体的相互作用取决于表位的类型，即.，无论是线性表位还是构象表位10除了识别抗原外，抗体还需要克服血管壁、基底膜和肿瘤间质等天然屏障，才能到达表达抗原的靶细胞。抗体不仅通过可变区抗原结合片段（Fab）结构域与组织相互作用，还通过恒定结晶片段（Fc）结构域产生作用，从而引发靶外相互作用。11靶向治疗还因肿瘤内部肿瘤标志物表达的异质性以及肿瘤血管化和淋巴系统的异质性而变得复杂12,13此外，肿瘤微环境由支持肿瘤细胞的癌症相关成纤维细胞、抑制抗肿瘤免疫反应的肿瘤免疫细胞，以及支持氧气和营养物质运输的肿瘤血管内皮组成，这些成分均会干扰基于抗体的治疗或诊断试剂的渗透、分布和可及性。总体而言，这些因素可能限制治疗或诊断效果，降低治疗反应，并可能导致肿瘤产生耐药性。
因此，为了开发高效的基于抗体的治疗方法和诊断技术，评估抗体偶联物在肿瘤微环境中的生物分布及其相互作用至关重要。目前，在临床前研究中，肿瘤研究模型中的标志物表达通常通过免疫荧光（IF）染色对肿瘤切片进行离体分析14。标准的IF染色使用针对特定标志物的一抗，随后通过荧光标记的二抗在从动物体内分离的离体肿瘤组织切片上进行显影。该技术仅能显示组织固定时刻标志物的静态定位，无法揭示基于抗体的治疗剂或诊断剂在生理条件下的分布模式或相互作用情况。利用正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、超声（US）和光声成像（PA）等分子影像技术，可以在活体临床前模型中获取抗体偶联对比剂分布的相关信息8,15。由于这些成像方式具有非侵入性，可开展纵向研究，并在每组使用最少数量动物的情况下收集与时间相关的数据。然而，这些非侵入性分子成像方法的灵敏度和分辨率仍不足以实现抗体分布的细胞水平定位。此外，对比剂的偶联可能显著改变原抗体的理化和生物学特性16。
为了在体内生理和病理条件下研究基于抗体的治疗药物和诊断试剂在肿瘤微环境中的相互作用，并获得非偶联抗体在细胞甚至亚细胞水平上的高分辨率分布图谱，我们提出了一种免疫荧光（IF）方法，称为体内免疫荧光定位法（In Vivo Immunofluorescence Localization, IVIL），该方法通过静脉注射抗原特异性抗体至活体动物体内。该基于抗体的治疗或诊断试剂作为一抗，在功能性血管系统中循环，并在高度真实的活体肿瘤环境中与其靶蛋白结合。在使用一抗对体内标记的肿瘤组织进行分离后，再利用二抗对已富集并滞留的抗体偶联物进行定位。该方法类似于先前报道的将荧光标记抗体注射用于免疫荧光组织学分析的方法17。然而，本方法采用非偶联抗体，避免了因抗体修饰可能引起的生物分布特性的改变。此外，体外应用荧光标记的二抗可避免在组织采集和处理过程中荧光信号的损失，并实现荧光信号强度的放大。我们的标记方法真实反映了抗体类药物及靶向制剂在体内的生物分布情况，可为新型诊断试剂和治疗药物的研发提供重要依据。
在此，我们描述了IVIL方法在以往研究中的两种应用，这些研究旨在探讨基于抗体的对比剂在乳腺癌分子成像检测中的生物分布与可及性。首先，研究了抗体-近红外染料偶联物（与近红外荧光染料吲哚菁绿结合的抗B7-H3抗体，B7-H3-ICG）及同型对照试剂（Iso-ICG）的生物分布 荧光与光声分子成像被探讨18. 本应用的方法在实验方案中有详细描述。接下来，在代表性结果中，通过超声分子成像技术对一种针对netrin-1的构象敏感型抗体的生物分布进行了定量分析和展示，该抗体通常在传统免疫荧光成像中无法被检测到19在本实验方案结束时，读者应能够熟练地将IVIL方法应用于自身的抗体相关研究。
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方案
本文所述所有方法均已获得斯坦福大学实验动物护理机构管理委员会（APLAC）的批准。
1. 乳腺癌发展的转基因小鼠模型
- 在进行下一步操作前，通过触诊或游标卡尺测量，观察所选癌症模型小鼠的适当肿瘤生长情况。
注：本实验采用乳腺癌发展的转基因小鼠模型（FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J）（MMTV-PyMT）。这些动物在6至12周龄期间，每个乳腺中会自发形成侵袭性乳腺癌20。对照组使用无转基因、年龄匹配的同窝小鼠的正常乳腺组织。
2. 特异性与非特异性抗体试剂的静脉注射
- 使用脱盐柱（例如 PD-10）纯化兔抗小鼠 B7-H3 抗体和兔 IgG 同型对照抗体，以去除防腐剂和储存缓冲液，操作步骤遵循制造商说明。
注意：某些抗体可能需要根据文献21所述的方案，进一步使用 Protein-A 琼脂糖珠进行纯化。 - 将每种抗体偶联物以 33 µg 剂量分装至独立的微量离心管中。
注意：给药剂量可能因应用而异，应与该抗体偶联物常规使用的剂量一致。若注射体积超过 100 µL，为保障动物安全，需确认抗体溶液的浓度。 - 在组织采集前的预定时间点（本实验为 96 小时），使用流速为 2 L/min、浓度为 2% 的异氟烷氧气混合气体对荷瘤动物进行麻醉，并将其置于 37 °C 加热台上。 在操作前通过夹趾反应测试确认动物已达到适当的麻醉深度。
- 为准备抗体溶液的尾静脉注射，用酒精棉片擦拭动物尾部三次进行消毒。使用加热垫加热约 30 秒以扩张尾静脉，注意避免加热整个动物。 移除加热垫后，再次用酒精棉片擦拭尾部。
- 使用 27G 尾静脉导管，将蝶形针插入两条侧尾静脉之一，并用外科胶带将带针的尾部小心固定在台面上。
注意：导管内可见血液回流表明针头已正确进入尾静脉。 - 先用 25 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗导管，然后使用胰岛素注射器将抗体溶液注入导管，之后再次用 25 µL 无菌 PBS 冲洗导管。
- 从尾部拔出针头，并施加压力以止血。
- 关闭麻醉气体，观察动物直至其完全清醒，并监测是否有任何痛苦迹象。
3. 目标肿瘤组织的采集与制备
- 在预定时间点，根据机构认可的安乐死程序人道处死动物，此处采用逐渐吸入100% CO₂的方法。2 来自压缩气罐，腔室置换流速为10-30%体积/分钟。
注意：IVIL 技术的某些应用需要通过 PBS 心脏灌注实施安乐死，以清除循环中的游离抗体19,22. - 在通过呼吸和心跳停止、脚趾捏压无反应以及黏膜变灰等指标确认实施人道安乐死后，使用手术剪和镊子按如下步骤切除肿瘤组织：
- 将小鼠仰卧放置，仅捏住靠近尾部最后一对乳腺之间的外层皮肤（5th用镊子夹住，用手术剪做一个小切口。
- 将闭合的剪刀插入切口，缓慢张开剪刀尖端，仔细分离皮肤与下方腹壁膜，保持腹壁膜完整。
- 沿腹部向上做一纵向切口，继续将皮肤与内层膜分离。在第3rd 和 4th 乳腺，横向切开腹部皮肤，以便牵拉皮肤并暴露乳腺组织。
注意：乳腺肿瘤和腺体位于皮肤下方的浅层。 - 用镊子夹住每个肿瘤或正常腺体，用手术剪小心剪除附着的皮肤。
- 将切除的组织置于预先标记并装有最佳切割温度（OCT）包埋介质的一次性组织底模中，然后将模具置于干冰上快速冷冻。为研究脱靶递送情况，可切除其他感兴趣的组织或器官（例如.肝脏或肺部
注意：若需在此处暂停实验流程，可将组织冻块于 -80 °C 保存，待准备继续时再进行后续操作。 - 使用冷冻切片机将冷冻组织块切成10 µm厚度的切片，并将相邻切片置于预先标记的防脱片玻璃载玻片上。
注意：如需在此处暂停实验流程，可将切片保存于 -80 °C，待准备继续时再取出使用。
4. 离体染色方案
注意：为进行荧光显微镜图像间的定量比较，所有载玻片需同时使用相同配制的溶液进行染色。
- 用室温 PBS 冲洗冷冻组织切片 5 分钟，以去除 OCT 包埋剂。
- 使用疏水屏障笔标记组织区域，以减少染色过程中所需溶液的用量。
注意：操作时需小心，避免笔迹覆盖到组织样本，否则可能导致组织从载玻片上脱落，或影响被覆盖区域的正常染色。在任何步骤中均不得让组织切片发生干燥。 - 用 4% 多聚甲醛溶液固定组织切片，时间为 5 分钟。
- 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 用含 0.5% Triton-X 100 的 PBS 溶液对组织切片进行通透处理，时间为 15 分钟。
- 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 用含 3% w/v 牛血清白蛋白（BSA）和 5% v/v 山羊血清的 PBS 溶液（封闭液）在室温下封闭组织切片 1 小时。
注意：封闭液中的血清应与二抗的宿主动物相匹配。 - 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 根据需要，加入用于记录定位的一抗，例如常用的核标记物（如 DAPI）、血管标记物（如 CD31）或胞质标记物（如肌动蛋白）。本实验中，在封闭液中加入大鼠抗小鼠 CD31 抗体（血管标记物），按 1:100 稀释，根据制造商说明，在 4 °C 条件下避光孵育过夜，并置于载玻片架上防止干燥。
注意：不要额外添加一抗或抗体偶联物。此前已注射并在体内组织中富集的偶联物将作为 一抗使用。 - 用 PBS 冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗三次，每次更换 PBS。
- 加入二抗孵育，以标记一抗。本实验中，使用 AlexaFluor-546 标记的山羊抗兔抗体（1:200 稀释，根据制造商说明优化）检测抗 B7-H3 抗体，同时使用 AlexaFluor-488 标记的山羊抗大鼠二抗（1:200 稀释，根据制造商说明优化）检测 CD31，均在封闭液中孵育，置于载玻片架上避光并防止干燥，室温孵育 1 小时。
注意：二抗应来自相同宿主动物，且其结合特异性需与相应一抗的宿主物种相匹配。从本步骤起，所有操作均需避光。 - 用 PBS 冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗三次，每次更换 PBS。
- 在组织切片中央滴加一滴封片剂，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。
- 用透明指甲油密封盖玻片边缘，并静置使其干燥。
注意：若需在此步骤暂停实验流程，可将载玻片在 -20 °C 条件下保存最多一周，待后续继续操作。
5. 共聚焦显微镜成像与定量图像分析
注意：共聚焦显微镜的准备及成像参数的设置取决于所使用的共聚焦系统。本实验所用显微镜为商业购置（例如，Zeiss LSM 510 Meta 系统），并使用相应的采集软件（例如，Zen 2009）。然而，其中许多步骤适用于任何共聚焦显微镜，且假定操作者已具备共聚焦显微镜的基本知识。
- 系统开启并预热后，选择所需物镜；此处使用了 20 倍（数值孔径 = 0.8）物镜。
- 将阳性对照玻片盖玻片朝下放入载物台，以便为最强信号设置优化参数。在红色通道中成像，于实时成像模式下对样品进行聚焦。
- 对所使用的每个激光通道，按以下步骤优化激光强度、主增益和针孔大小：
- 切换至连续成像模式。
- 在监控查找表（LUT）直方图的同时，调节激光强度（控制激光功率）和增益（主）（控制光电倍增管电压）滑块。调整这两个参数，使直方图的动态范围被充分填充，同时避免像素饱和。
注意：若激光强度过高，将导致光漂白；若增益（主）过高，图像将产生噪声。理想情况下，增益（主）应设置在其范围的中间值。 - 将针孔设置为 1 阿里单位（AU），以获得最高分辨率和最薄的 z 轴切片。
- 滑动数字偏移条，使 LUT 直方图的噪声基底最小化，从而实现真正的黑色背景。
注意：一旦为每个激光通道和物镜优化了显微镜设置，应在整个成像过程及所有玻片的成像中保持这些参数恒定，以便实现玻片间的定量比较。
- 在采集模式选项卡下的平均设置中，选择所需的数量和位深度。点击“最优”按钮以设置最佳像素尺寸。
- 使用快照采集按钮获取高质量图像。此处从肿瘤内部随机选择视野，但其他应用可能关注不同区域（如血管、肿瘤边缘、穿透深度等）。
- 以共聚焦软件使用的格式（此处为 ".lsm"）保存图像文件，用于离线处理和定量分析。
注意：若并非所有玻片在同一次会话中完成成像，应保存设置并在后续访问时重新加载。但由于光漂白问题，不建议重新对同一玻片进行成像。 - 进行荧光强度的定量测量。打开 Fiji（Fiji 即为 ImageJ 软件）19,23，通过将 .lsm 图像文件拖拽至状态栏加载图像。
- 拆分颜色通道数据。进入 图像 > 堆栈 > 拆分通道。
- 根据需要对荧光图像进行预处理，例如减去背景信号（处理 > 减去背景）或通过滤波方法降低噪声。
- 通过设定信号强度的阈值，对参考蛋白（血管、细胞核、细胞染色）对应的颜色通道进行分割（图像 > 调整 > 阈值）。
注意：手动设定阈值会引入图像分析的主观性，因此建议使用自动阈值算法或参考图像直方图，以减少分析结果的偏差。 - 使用该阈值创建二值掩膜（处理 > 二值 > 转换为掩膜）。
- 在掩膜内测量并标记感兴趣区域（ROI）（分析 > 分析颗粒 > 勾选“添加至管理器” > 确定）。
- 将 ROI 应用于目标抗体对应的颜色通道（点击通道图像，分析 > 工具 > ROI 管理器 > 测量）。这会将掩膜中的 ROI 应用于抗体图像，并在结果窗口中提供标记区域的测量数据。保存结果窗口（文件 > 保存）。
- 计算所需的统计量，例如此处所述的平均荧光强度24。
- 对一组玻片中的每幅图像执行完全相同的处理步骤。可创建宏程序以自动处理大批量图像23。
- 仅在完成定量测量后用于图像展示时，可进行定性图像调整，通过将所有玻片的最小值、最大值、亮度和对比度调整至相同水平，以优化生物分布模式的可视化效果（图像 > 调整 > 亮度/对比度）。
- 转换图像类型（图像 > 类型 > RGB 彩色），并将文件以无损格式（如 .tiff）保存（文件 > 另存为 > Tiff…），用于展示和发表。
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结果
体内免疫标记（IVIL）方法被用于研究B7-H3-ICG和Iso-ICG在活体动物中的生物分布及与组织的相互作用。该方法通过将探针经静脉注射至活体动物体内，使其与靶组织相互作用96小时；待组织取出后，再作为一抗进行离体免疫荧光染色。同时，将IVIL方法与针对B7-H3标志物的传统离体免疫荧光染色法进行了比较。正常小鼠乳腺组织不表达B7-H3标志物，这一结果已通过离体标准免疫荧光染色证实，且该组织不会通过其他被动机制富集抗体，因此未检测到B7-H3-ICG或Iso-ICG的蓄积，代表阴性结果。图1，第一行）然而，小鼠乳腺肿瘤在血管和上皮中均表达 B7-H3（经标准免疫荧光染色证实），IVIL 能够突出显示在血管中强烈积聚的 B7-H3-ICG 探针，并可部分从血管外渗，结合至肿瘤细胞本身，但其分布呈异质性，与肿瘤内 B7-H3 标记物的均匀分布相比存在差异，这一点也在图中显示 图1，底排。此外，尽管Iso-ICG试剂不具有...
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讨论
该方法包含若干关键步骤，并需要进行潜在的调整，以确保成功实施。首先，抗体或抗体偶联物静脉注射的剂量和时间必须根据具体应用进行优化。通常应采用与抗体偶联物常规使用方式一致的剂量，即与治疗性抗体或基于抗体的对比剂的剂量相匹配。此外，靶组织的采集时间也应仔细考虑。抗体及抗体偶联物在体内的循环时间较常规药物和对比剂更长，但其循环时间差异较大，需针对具体应用进行优化；建议至少保留24小时的循环时间27。其次，在采集靶组织过程中，可能需要采用心脏灌注技术，以清除血液中游离循环的抗体19。在研究B7-H3-ICG在肿瘤中的分布时，由于其循环时间足够长（96小时）且试剂主要定位于血管外，因此未进行灌注。然而，在IVIL方法应用于netrin-1时，考虑到netrin-1在内皮细胞中的表达及其相对较低的表达水平，心脏灌注被认为是必要的。第三，在离体组织染色过程中，所有需进行定量比较的切片必须在同一轮染色中使用相同的试剂进行处理，以避免不同批次间的正常变异。确保各步骤之间切片充分漂洗，并避免疏水笔画线液接触组织，以防染色效果不佳。最后，在共聚焦显微镜成像过程中，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Andrew Olson 博士（斯坦福神经科学显微技术服务中心）在讨论和设备使用方面的帮助。感谢 Juergen K. Willmann 博士提供的指导。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R21EB022214 基金（KEW）、NIH R25CA118681 培训基金（KEW）以及 NIH K99EB023279（KEW）资助。斯坦福神经科学显微技术服务中心由 NIH NS069375 提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | 杰克逊实验室 | 002374 | 雌性，4–6 周龄 |
| 动物操作用品 | |||
| 27G 导管 | VisualSonics | 请致电订购 | Vevo MicroMarker 尾静脉通路套件 |
| 酒精棉片 | 费希尔科技 | 22-246073 | |
| 纱布敷料（4" × 4" 16 层） | Cardinal Health | 2913 | |
| 加热灯 | Morganville Scientific | HL0100 | |
| 异氟烷 | 亨利·谢恩动物健康 | 29404 | |
| 眼科软膏 | 费希尔科技 | NC0490117 | |
| 手术胶带 | 3M | 1530-1 | |
| 组织采集 | |||
| 一次性底模 | 费希尔科技 | 22-363-556 | |
| 最佳切割温度（OCT）包埋介质 | 费希尔科技 | 23-730-571 | |
| 外科伦敦镊子 | 精细科学工具 | 11080-02 | |
| 外科剪刀 | 精细科学工具 | 14084-08 | |
| 抗体 | |||
| AlexaFluor-488 山羊抗大鼠 IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 山羊抗兔 IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 山羊抗人 IgG | Life Technologies | A11014 | |
| 人 IgG 同型对照 | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| 人源化抗 netrin-1 抗体 | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| 兔抗小鼠 CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 克隆 |
| 大鼠抗小鼠 CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 克隆 |
| 试剂 | |||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| 透明指甲油 | 任意本地药店 | ||
| 吲哚菁绿-NHS | Intrace Medical | ICG-NHS 酯 | |
| 封片介质 | 赛默飞世尔科技 | TA-006-FM | |
| 正常山羊血清 | 费希尔科技 | ICN19135680 | |
| 多聚甲醛（PFA） | 费希尔科技 | AAJ19943K2 | |
| 无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | 14190250 | |
| 吐温-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 耗材 | |||
| 粘附载玻片 | VWR | 48311-703 | |
| 脱盐柱 | 费希尔科技 | 45-000-148 | |
| 玻璃盖玻片 | 费希尔科技 | 12-544G | |
| 疏水屏障笔 | Ted Pella | 22311 | |
| 微量离心管 | 费希尔科技 | 05-402-25 | |
| 玻片染色槽 | VWR | 87000-136 | |
| 软件 | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison | 版本 4.0 | https://fiji.sc/ |
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