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方法文章

利用神经元放电活动在神经生理学实验中触发闭环刺激

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DOI：

10.3791/59812

⸱

2019年11月12日

 ,  ,  , 
1Canadian Center for Behavioural Neuroscience, Department of Neuroscience, University of Lethbridge, 2Clinical Neurosciences, Cumming School of Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案演示了如何使用电生理系统，根据神经元活动模式触发闭环刺激。同时还提供了可轻松修改以适配不同刺激设备的示例 Matlab 代码。

摘要

闭环神经生理系统利用神经元活动模式来触发刺激，进而影响大脑活动。这类闭环系统已应用于临床，并且是基础脑科学研究的重要工具。近年来一个特别引人关注的发展是将闭环方法与光遗传学技术相结合，使得特定的神经元活动模式能够触发对选定神经元群体的光学刺激。然而，建立用于闭环实验的电生理系统可能较为困难。本文提供了一套可直接应用的 Matlab 代码，用于根据单个或多个神经元的活动来触发刺激。该示例代码可根据具体需求轻松修改。例如，代码展示了如何触发声音刺激，以及如何修改以触发连接至计算机串口的外部设备。所介绍的实验方案设计为与一种广泛用于动物研究的神经记录系统（Neuralynx）配合使用。文中在清醒大鼠中演示了闭环刺激的实现过程。

引言

本实验方案的目的是演示如何在神经生理学实验中实施闭环刺激。神经科学领域中闭环实验的典型设置是基于神经元活动的实时读取来触发刺激。这反过来会引起大脑活动的改变，从而形成反馈回路1,2。相较于标准的开环实验设置，此类闭环实验具有多种优势，尤其是与光遗传学技术结合时，后者使研究人员能够靶向特定的神经元亚群。例如，Siegle 和 Wilson 利用闭环操控来研究θ振荡在信息处理中的作用3。他们证明，在θ振荡的下降相刺激海马神经元对行为的影响，与在上升相进行相同刺激的效果不同。闭环实验在临床前研究中也正变得越来越重要。例如，多项癫痫研究表明，在癫痫发作起始时触发神经刺激是减轻发作严重程度的有效方法4,5,6。此外，用于自动检测癫痫发作并随之递送治疗的系统7,8在癫痫患者中显示出显著益处9,10,11,12。闭环方法快速发展的另一个应用领域是通过皮层脑-机接口控制神经假体装置。这是因为向假体设备使用者提供即时反馈可显著提高操作的准确性和能力13。

近年来，多个实验室已开发出用于在闭环系统中同时记录神经元电活动并传递刺激的定制系统14,15,16,17,18。尽管这些装置中的许多都具有出色的性能，但在其他实验室中实施它们并不总是容易的。这是因为这些系统通常需要经验丰富的技术人员来组装所需的电子设备以及其他必要的硬件和软件组件。

因此，为了促进闭环实验在神经科学研究中的应用，本文提供了一种实验方案及相应的Matlab代码，用于将开环电生理记录系统19,20,21,22 转换为闭环系统2,6,23。该方案设计用于Digital Lynx记录硬件，这是一种广泛应用于神经元群体记录的实验室系统。典型的实验流程包括以下步骤：1）记录5至20分钟的神经元放电数据；2）进行 spike sorting 以建立神经元模板；3）利用这些模板在线检测神经活动模式；4）当检测到用户设定的特定模式时，触发刺激或实验事件。

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方案

本文所述所有操作均在莱斯布里奇大学动物福利委员会批准的动物研究方案下进行。

1. 手术

注意：用于植入神经生理记录探针的手术操作已在其他出版物中介绍过24,25,26。闭环刺激手术的具体细节取决于所使用的记录探针类型以及目标脑区。然而在大多数情况下，典型的手术通常包括以下步骤。

  1. 将装有一只待植入硅胶探针或电极阵列以记录神经元活动的大鼠的笼子带入手术室。
  2. 使用2-2.5%异氟烷麻醉啮齿动物，并将头部固定在立体定位仪上。通过观察动物对轻微触觉刺激是否有运动反应，确保其在手术期间处于无意识状态25。
  3. 涂抹眼膏，以尽量减少手术期间角膜干燥。
  4. 剃除手术区域的毛发，并使用2%氯己定溶液和70%异丙醇对皮肤进行消毒。
  5. 在电极拟植入脑区对应的头皮下注射利多卡因（5 mg/kg）。
  6. 在拟植入区域的头皮做切口，使用手术刀和棉签清除暴露颅骨上的骨膜25。
  7. 在颅骨上钻4-8个孔，用于植入固定螺钉（约0.5 mm），为植入物提供结构支撑25。将螺钉插入孔中并固定，确保其牢固稳定。
  8. 在指定坐标处钻开颅窗，并插入微驱动装置/探针植入物。
    注意：所述闭环刺激方案适用于电极插入的任何脑区。
  9. 使用牙科丙烯酸树脂将微驱动装置/探针及所需的电接口连接器固定在颅骨上。所用牙科丙烯酸树脂的量应足以牢固固定植入物，但不得接触周围软组织25。
  10. 术后密切监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位25。术后连续3天，皮下注射镇痛药（如美达佳，1 mg/kg）和抗生素以预防感染（如恩诺沙星，10 mg/kg）。
    注意：动物通常在手术后恢复一周，再进行任何测试或记录。

2. 软件安装

注意：此操作在 Windows 10 64 位版本上进行过测试。

  1. 安装数据采集与处理软件。
    1. 安装数据采集系统 Cheetah 6.4（https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control），该系统包含与 Cheetah 采集系统交互所需的库文件。
    2. 安装 SpikeSort3D（https://neuralynx.com/software/spikesort-3d）或任何其他使用 KlustaKwik27 进行 spike 分类的软件。在线检测软件使用来自 KlustaKwik 引擎的聚类定义。该软件可运行在同一台计算机上，也可运行在同一网络中的不同计算机上。
    3. 安装 NetComDevelopmentPackage（https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0），也可从 https://neuralynx.com/software/netcom-development-package 下载。
  2. 安装 Matlab（https://www.mathworks.com/downloads/；代码已在 Matlab R2018a 版本上测试通过）。确保在 Windows 防火墙中启用了 Matlab。通常在首次连接时会弹出提示窗口。
    1. 登录 Matlab 账户。选择许可证。选择版本。选择操作系统。
  3. 从以下网址下载用于在线事件触发的库文件：https://github.com/leomol/cheetah-interface，并将文件解压至计算机的“文档/Matlab”文件夹中。代码副本已提供在随附的 补充材料 中。

3. 初始数据采集

  1. 使用 Cheetah 软件开始数据采集。
  2. 记录几分钟的尖峰放电数据，以生成模板波形。
  3. 停止数据采集，并对记录的数据进行尖峰排序。
    1. 打开 SpikeSort3D，点击 文件 | 菜单 | 加载尖峰文件，然后从包含记录数据的文件夹中选择一个尖峰文件。
    2. 点击 聚类 菜单，然后选择 使用 KlustaKwik 自动聚类，保持默认设置，然后点击 运行。

4. 闭环实验

  1. 在 Cheetah 中恢复数据采集。
  2. 打开 Matlab。
    1. 打开 ClosedLoop.m 并点击 运行。或者，在 Matlab 命令窗口中执行 ClosedLoop()。确保 ClosedLoop.m 位于 Matlab 路径中。如果用户希望在每次触发时调用自定义函数，请改用 ClosedLoop('-callback', customFunction) 执行，其中 customFunction 是该函数的句柄。
    2. 通过点击 加载，浏览至记录文件夹，并选择其中一个脉冲数据文件（.ntt、.nse），以加载初始记录中定义的脉冲信息。
    3. 通过点击绘制波形下方的复选框，选择一个或多个将触发刺激的神经元。
    4. 在“最小匹配数”文本框中输入一个整数，以定义触发刺激所需的最少神经元数量；在“时间窗口”文本框中输入一个数值，以定义不同波形脉冲被视为共激活的时间窗口。
    5. 点击 发送 以开始。系统将根据所选神经元的脉冲活动，在线触发事件（默认为音调）。

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结果

实验前两周，对在本机构出生并饲养的Fisher-Brown挪威大鼠进行抓握适应训练。通过外科手术植入记录电极，方法类似于先前报道的技术28,29,30,31,32,33,34。神经信号使用数字采集系统以32 kHz的采样率进行记录。神经信号首先通过一个单位增益的无线前置放大器放大，随后以1000倍增益进一步放大，并在600至6,000 Hz之间进行带通滤波。当神经放电信号超过手动设定的幅值阈值（通常为48–60 µV）时，系统会自动保存这些信号，然后将其分类为不同的簇群。因此，每个簇群可能代表来自不同神经元的动作电位27。在本实验...

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讨论

本文所述方案展示了如何使用标准的神经生理记录系统进行闭环刺激。该方案使神经科学领域中计算机专业知识有限的研究人员能够以较低成本快速实施多种闭环实验。此类实验对于研究大脑中的因果相互作用通常是必需的。

在完成动物准备和软件安装（步骤1和2）后，闭环实验包含两个独立阶段。首先，进行初始数据采集（步骤3），以收集数据并定义对应于单个神经元活动的模板（即， spike sorting；步骤3.5）。其次，进行闭环刺激，其中新记录到的神经元放电将被实时自动分配到预定义的聚类中，并在检测到来自特定神经元的放电时触发刺激（步骤4）。所提供的Matlab脚本（见补充材料）演示了基于单个神经元活动以及多个选定神经元活动来触发不同刺激的方法。后一种方式尤为重要，因为人们认为神经元是以群体形式（例如，神经元集群35,36）来处理信息的。因此，基于神经元群体活动模式触发刺激可能是回答广泛研究问题的关键工具。闭环控制期间的数据流程如

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披露

作者与本工作无任何利益冲突。

致谢

本工作获得了NSERC发现基金对AL和AG的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
拜耳灵Bayer, Mississauga, CADIN 02169428抗生素；50 mg/mL
Cheetah 6.4NeuraLynx, Tucson, AZ6.4.0.beta用于数据采集的软件接口 
Digital Lynx 4SXNeuraLynx, Tucson, AZ4SX记录设备
头戴式发射器TBSIB10-3163-GK将神经信号传输至接收器
异氟烷Fresenius Kabi, Toronto, CADIN 02237518吸入性麻醉剂
Jet Denture Powder & LiqudLang Dental, Wheeling, US1230牙科丙烯酸树脂
拉克瑞润滑膏Allergan, Markham, CADIN 00210889眼用软膏
利多卡因-2Rafter 8, CalgaryDIN 00654639局部麻醉剂；20 mg/mL
MatlabMathworksR2018b用于信号处理及触发外部事件的软件
美达康Boehringer, Ingelheim, DEDIN 02240463镇痛药；5 mg/mL
NetcomNeuraLynxv1与 Cheetah 通信的应用程序编程接口（API）
硅胶探针Cambridge NeurotechASSY-156-DBC2植入式装置
SpikeSort 3D NeuraLynx, Tucson, AZSS3D动作电位波形到细胞分类的工具
无线射频接收器TBSI911-1062-00将神经信号传输至 Digital Lynx

参考文献

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