利用稳健的生化方法对一种新型激酶蛋白进行分子水平表征

摘要

我们采用严谨的生化方法表征了一种新的激酶蛋白：利用特异性抗体在不同细胞系和组织中进行蛋白质印迹分析，通过共免疫沉淀实验检测其相互作用，通过蛋白质印迹结合磷酸化特异性抗体以及γ[³²P] ATP标记法检测激酶活性。

摘要

大规模全基因组测序已鉴定出许多开放阅读框（ORFs），这些开放阅读框编码大量潜在蛋白质。这些蛋白质可能在细胞中发挥重要作用，并揭示新的细胞过程。在各类蛋白质中，激酶是关键的调控因子，因为它们参与细胞信号转导通路，能够开启或关闭对细胞命运至关重要的多种过程，例如细胞生长、分裂、分化、运动以及死亡。

在本研究中，我们关注一种新的潜在激酶蛋白LIMK2-1。我们通过使用特异性抗体的Western Blot实验验证了其存在。我们采用共免疫沉淀实验评估了该蛋白与上游调控蛋白之间的相互作用。共免疫沉淀是一种非常强大的技术，能够检测两种目标蛋白之间的相互作用，也可用于发现诱饵蛋白的新结合伙伴。诱饵蛋白可通过其序列中设计的标签或特异性靶向该蛋白的抗体进行纯化。随后，这些蛋白复合物可通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离，并利用质谱技术进行鉴定。我们还利用免疫沉淀获得的LIMK2-1，通过γ[³²P] ATP标记法在体外检测其激酶活性。这一成熟的方法可使用多种不同底物，也可利用诱饵蛋白的突变体来评估特定残基的功能。由于该技术具有高度敏感性和定量性，还可用于评估药理学试剂的作用。然而，放射性物质的操作需要特别谨慎。此外，也可使用特异性识别修饰氨基酸上磷酸基团的抗体来检测激酶活性。但这类抗体并非对所有磷酸化修饰的残基都有商业化产品。

引言

几十年来，人们已阐明了众多信号通路，并揭示了它们在细胞分裂、分化、运动、程序性细胞死亡、免疫和神经生物学等关键细胞过程中的作用。激酶在这些信号通路中发挥着重要作用，因为它们通常精细地调控通路的激活或失活，并参与响应外界刺激的瞬时多功能复合物^1,2,3。激酶的突变和失调常导致人类疾病，因此在过去的四十年中，它们已成为最重要的药物靶点之一⁴。

在这一背景下，能够检测激酶与其上游调控因子或下游底物之间的相互作用，并鉴定新的相互作用伙伴，显得尤为重要。亲和纯化和免疫沉淀是分离蛋白质复合物的强有力技术⁵。诱饵蛋白或激酶可被标记上特定的肽序列，从而利用商品化的磁珠，这些磁珠共价偶联了针对该肽段的抗体。这种方法可显著提高实验的可重复性^6,7,8。内源性蛋白也可通过直接靶向诱饵蛋白的抗体进行免疫沉淀。抗体可交联至蛋白A或蛋白G琼脂糖磁珠，或在加入裂解液前简单地与这些磁珠共同孵育。裂解缓冲液必须经过优化，以确保在不破坏蛋白相互作用....

方案

1. 转染用细胞的制备

警告：细胞培养的所有步骤必须在专用实验室中进行，且细胞操作需在二级生物安全柜内完成。

1. 在 Ø 10 cm 培养皿中接种 HEK-293（人胚胎肾）细胞，加入 10 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），并添加 10% 胎牛血清。在 5% CO₂、37 °C 条件下培养 3 至 5 天，直至细胞融合度达到约 90%。
2. 使用 Collagen R 处理 Ø 10 cm 培养皿，以增强细胞在塑料培养皿表面的黏附性。
   1. 在 Ø 10 cm 培养皿中加入 5 mL Collagen R 溶液（用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释 200 倍），并将液体均匀覆盖整个培养皿表面。
   2. 在生物安全柜内室温孵育至少 1 小时。
   3. 移除胶原溶液并弃去。加入 5 mL PBS，使其覆盖整个培养皿表面，随后移除并弃去。重复该洗涤步骤一次。
   4. 加入 8 mL 添加了 10% 胎牛血清的 DMEM。将处理好的培养皿保留在生物安全柜内。
3. 在生物安全柜内取出步骤 1.1 中的 HEK-293 培养皿。移除培养基，并将其弃入专用的含氯消毒废液容器中。加入 2 mL 添加了血清的 DMEM，使用 1 mL 微量移液器的液流轻轻冲洗细胞，使其脱离培养皿表面，注意避免产生气泡。

结果

LIMK2-1 蛋白的合成
数据库中提到了 LIMK2-1，但迄今为止仅有一篇论文证实了其 mRNA 的存在¹⁸。与另外两个同源蛋白 LIMK2a 和 LIMK2b 相比，LIMK2-1 多出一个位于 C 末端的结构域，该结构域被鉴定为蛋白磷酸酶 1 抑制结构域（PP1i）。我们设计了一种抗体，靶向该结构域中的一个肽段（氨基酸 671–684）（图 1A）。
针对人类蛋白质数据库进行的 BLAST 分析显示，仅有一种蛋白 PHI-1（蛋白磷酸酶全酶抑制因子 1）与该 12 个氨基酸序列具有较高的序列相似性。然而，PHI-1 在 SDS-PAGE 凝胶上的迁移分子量约为 23 kDa，远低于 LIMK2-1 预期的迁移位置（约 75 kDa），因此两者不应发生交叉干扰。我们首先在转染了 LIMK2-1、LIMK2a 或 LIMK2b 的 HEK-293 细胞中对该抗体进行了验证，结果显示抗 PP1i 抗体能够识别转染的.......

讨论

本文中，我们利用可靠的生化工具在分子水平上表征了一种新的蛋白质LIMK2-1，该蛋白质根据其序列及其同源蛋白LIMK2a和LIMK2b²⁰，被认为是一种激酶。

首先，我们利用特异性抗体通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平上证实了LIMK2-1的存在。随后，我们评估了其与上游激酶ROCK1的相互作用，ROCK1已知可调控LIMK2-1的同源蛋白LIMK2a和LIMK2b。最后，我们通过体外γ[³²P] ATP标记实验以及使用特异性磷酸化抗体的细胞内蛋白质印迹法，评估了LIMK2-1潜在的激酶活性。

裂解缓冲液组成
在研究蛋白质并对其进行 Western Blot 分析时，需特别注意裂解缓冲液的组成。需要考虑多个参数：（i）去垢剂的类型和浓度²¹，以及（ii）蛋白酶抑制剂。

裂解缓冲液的组成必须根据目标蛋白进行调整，以促进其尽可能完全地.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗肌动蛋白抗体	Sigma-Aldrich	A1978	用于蛋白质印迹
抗c-Myc抗体	Invitrogen	MA1-21316	用于蛋白质印迹
抗cofilin抗体	Cell signaling Technology	3312/5175	用于蛋白质印迹
抗GFP抗体	Santa Cruz	sc-9996	用于蛋白质印迹
抗HA抗体	Roche Applied Science	11687423001	用于蛋白质印迹
抗磷酸化cofilin抗体	Cell signaling Technology	3313	用于蛋白质印迹
抗PP1i抗体	Eurogentec	本研究特异性设计	用于蛋白质印迹
抑肽酶	Euromedex	A-162B	用于裂解缓冲液
ATP	Invitrogen	PV3227	用于γ[32P]标记
γ[32P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	用于γ[32P]标记
BES缓冲盐溶液	Sigma-Aldrich	14280	用于转染
β-甘油磷酸钠	Sigma-Aldrich	G9422	用于裂解缓冲液和激酶缓冲液
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148	用于Laemmli缓冲液
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A3059	用于封闭缓冲液
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126	用于Laemmli缓冲液
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	用于转染
离心机	Sigma	111-541
胶原酶R	Pan Biotech	P06-20166	用于转染
对照siRNA	Ambion	AM4611	用于验证PP1i抗体特异性
Coomassie PageBlue蛋白质染色液	Thermo-Fisher	24620	用于凝胶染色
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	用于裂解缓冲液
电泳装置	Biorad	Mini-Protean	用于蛋白质印迹
EZview Red抗HA亲和凝胶	Sigma-Aldrich	E6779	用于免疫共沉淀
GeneSys软件	Ozyme		用于蛋白质印迹图像采集
GeneTolls软件	Ozyme		用于蛋白质印迹定量分析
GFP-trap微珠	Chromtek		用于免疫共沉淀
甘氨酸	Euromedex	26-128-6405	用于转膜缓冲液
GST-cofilin	Upstate Cell signaling	12-556	用于γ[32P]标记
Hamilton 100 mL注射器	Hamilton	710	用于小心移除微珠上清液而不吸走微珠
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	用于激酶缓冲液
ImageQuant TL软件	GE Healthcare		用于放射性信号采集与定量
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	用于验证PP1i抗体特异性
亮抑蛋白酶肽	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	用于裂解缓冲液和激酶缓冲液
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	用于γ[32P]标记
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	用于激酶缓冲液
MnCl2	Sigma-Aldrich	244589	用于激酶缓冲液
NaCl	Euromedex	1112	用于裂解缓冲液和激酶缓冲液
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	用于裂解缓冲液和激酶缓冲液
冈田酸	Euromedex	0-2220	用于裂解缓冲液
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	用于裂解缓冲液和激酶缓冲液
对硝基苯磷酸盐	Euromedex	1026	用于裂解缓冲液
PVDF膜 Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 孔径 0.45 mm	用于蛋白质印迹
旋转摇床	Labinco		用于微珠孵育
安全锁Eppendorf管	Eppendorf	0030120.086	用于激酶活性检测
SDS	Sigma-Aldrich	5030	用于Laemmli缓冲液和电泳缓冲液
正钒酸钠	LC Laboratories	S8507	用于裂解缓冲液和激酶缓冲液
焦磷酸钠	Fluka	71501	用于裂解缓冲液
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	用于蛋白质印迹
Syngene Pxi	Ozyme		用于蛋白质印迹
组织提取物	Biochain	P1234035 脑组织 P12345152 肺组织 P1234149 肝组织 P1234188 胰腺组织 P1234260 睾丸组织	用于蛋白质印迹分析
转膜装置	Biorad	Mini-Trans-Blot	用于蛋白质印迹
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	用于裂解缓冲液
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	用于封闭缓冲液
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		用于读取放射自显影图像
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		用于读取放射自显影图像
Whatman滤纸	GE Healthcare	3030-672	用于蛋白质印迹