方法文章

利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态

11.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59822

⸱

2019年6月24日

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 2Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

本文内容

摘要

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。

摘要

活细胞成像是一种显微技术，用于研究活细胞中细胞和蛋白质的动态过程。该成像方法无毒性，通常不会干扰细胞生理状态，且实验操作需求极少。较低的技术干扰使研究人员能够观察多个有丝分裂周期，并完整记录减数分裂的全过程。通过使用绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）等荧光标记，研究人员可分析多种在转录、DNA复制、黏连和分离等过程中发挥重要功能的因子。结合使用Fiji（一种免费且经过优化的ImageJ版本）进行数据分析，活细胞成像可提供多种手段来评估蛋白质的运动、定位、稳定性与时间动态，以及细胞核动态和染色体分离情况。然而，与其他显微技术一样，活细胞成像受限于光的固有特性，高倍放大时分辨率受到限制，且在高频率波长照射下易发生光漂白或光毒性。不过，研究人员只要谨慎选择合适的实验条件、菌株和荧光标记物，即可在一定程度上克服这些物理限制，从而实现对有丝分裂和减数分裂事件的恰当可视化观察。

引言

活细胞显微镜技术使研究人员能够在不杀死裂殖酵母细胞的情况下观察细胞核的动态变化，避免了使用具有杀伤性的固定剂和染色剂。该技术可用于观察参与染色体复制、重组和分离等重要事件的荧光标记蛋白的稳定性、运动、定位及出现时间，同时还能观察细胞膜和细胞骨架的运动。通过维持细胞活性并采用无毒信号检测方法，该技术对细胞生理状态的干扰极小。若操作得当，此显微镜方法可减少因长时间技术操作或非特异性化学反应所引起的干扰效应。此外，在实验过程中，研究人员还可实时观察裂殖酵母的营养状态、应激状态、增殖效率以及凋亡状态，这些信息有助于判断成像参数是否合适或是否存在异常的细胞生理状况1,2,3。

有丝分裂和减数分裂的特征是细胞核和细胞的分裂。与有丝分裂不同，在减数分裂中，亲代细胞产生子代细胞时遗传物质减半4。由于活细胞成像除了提供空间关系外，还提供了时间维度，因此可对大量细胞进行实时观察。活细胞显微镜技术使研究人员能够利用组蛋白5、黏连蛋白亚基6、微管7、着丝粒8、动粒9、纺锤极体（SPB）组分10以及染色体乘客复合物（CPC）组分11的荧光标记，来研究核分裂的动态过程。除了染色体分离装置外，活细胞成像还捕捉到了一些对染色体分离必要但并不直接参与该过程的蛋白质的行为。这些蛋白质的功能已被证明会影响DNA复制、染色体重组、细胞核移动以及染色体与微管的连接12,13,14。这些观察结果有助于更好地理解那些无法通过生化或遗传方法研究其功能组分的细胞事件。随着显微镜技术的新进展，分辨率低、光漂白、光毒性以及焦距不稳定等限制将逐渐减少，从而促进对有丝分裂和减数分裂中核动态过程的更佳实时观察1,2,3。减数分裂尤其具有挑战性，因为它是一条终末分化通路，需要对时间进程给予密切注意。

本实验方案旨在介绍一种相对简单的方法，用于实时观察裂殖酵母在有丝分裂和减数分裂过程中的细胞核动态。为实现这一目标，必须使用未暴露于环境胁迫的细胞，制备能够耐受长时间成像的琼脂糖垫，并以适当的细胞密度进行封片，以便于单细胞动态的观察。此外，本方案采用携带荧光标记蛋白的细胞，这些蛋白可作为研究核动力学（Hht1-mRFP 或 Hht1-GFP）、染色体分离（Sad1-DsRed）、细胞骨架动态（Atb2-mRFP）、G1/S 期转录激活（Tos4-GFP）以及减数分裂中黏连蛋白稳定性（Rec8-GFP）的有用标记物。该方法还引入了其他核内和胞质标记物（表 I），可组合使用以探究特定细胞过程的相关问题。此外，本方案还介绍了基本的 Fiji 工具，以帮助研究人员处理活细胞图像并分析各类数据。该方法的优势在于通过实时观察蛋白质的动力学行为、时间进程和稳定性，来描述那些对有丝分裂和减数分裂正常进行至关重要的生物学过程。

方案

1. 培养基制备15,16

  1. 储备溶液
    1. 通过将52.5 g MgCl2·6H2O、0.735 g CaCl2·2H2O、50 g KCl 和 2 g Na2SO4 加入含有1 L蒸馏水的瓶中，配制50倍盐储备液。充分混匀溶液，并通过过滤除菌。长期储存时置于4 °C保存。
    2. 将1 g泛酸、10 g烟酸、10 g肌醇和10 mg生物素加入含有1 L蒸馏水的瓶中，混合均匀，配制1,000倍维生素储备液。充分混匀后通过过滤除菌。长期储存时置于4 °C保存。
    3. 通过将5 g硼酸、4 g MnSO4、4 g ZnSO4·7H2O、2 g FeCl2·6H2O、1 g KI、0.4 g钼酸、0.4 g CuSO4·5H2O 和10 g柠檬酸加入含有1 L蒸馏水的瓶中，配制10,000倍矿物储备液。充分混匀溶液，并通过过滤除菌。长期储存时置于4 °C保存。
    4. 将7.5 g腺嘌呤、亮氨酸、组氨酸或赖氨酸分别溶于1 L蒸馏水中，配制各自的营养储备液；配制尿嘧啶溶液时使用3.75 g。通过高压灭菌对溶液进行灭菌。
      注意：尿嘧啶在储存过程中可能从溶液中析出沉淀。若需重新溶解，可将溶液在微波炉中以60%功率每次加热10秒，或置于55 °C水浴中20分钟。轻轻摇动温热的溶液，直至所有尿嘧啶团块完全消失。
  2. 酵母提取物加补充物培养基（YES）
    1. 在2 L锥形瓶中加入1 L蒸馏水、5 g酵母提取物基础成分、30 g葡萄糖，以及各225 mg的腺嘌呤、尿嘧啶、L-组氨酸、L-亮氨酸和L-赖氨酸。加入20 g琼脂以制备固体培养基。
    2. 使用磁力搅拌子将各成分完全溶解于溶液中。琼脂将在高压灭菌后熔化。
      注意：为方便起见，市售已有即用型YES粉末。
  3. 爱丁堡最小培养基（EMM）和裂殖酵母谷氨酸培养基（PMG）
    1. 在2 L锥形瓶中，将1 L蒸馏水与3 g邻苯二甲酸氢钾、2.2 g Na2HPO4、5 g NH4Cl、20 g葡萄糖、20 mL盐储备液、1 mL维生素储备液和0.1 mL矿物储备液混合。若配制PMG，则用2.2 g L-谷氨酸单钠盐替代NH4Cl。加入20 g琼脂以制备固体培养基。
    2. 使用磁力搅拌子充分溶解各成分。琼脂将在高压灭菌后熔化。使用前根据需要添加营养储备液。每1 L培养基中加入腺嘌呤、亮氨酸、组氨酸和赖氨酸储备液各15 mL；尿嘧啶储备液需加入30 mL，因其浓度低于其他营养储备液。
      注意：为方便起见，市售已有即用型EMM和PMG粉末。
  4. 麦芽提取物培养基（ME）
    1. 在2 L锥形瓶中，将1 L蒸馏水与30 g麦芽提取物及各225 mg的腺嘌呤、尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸混合。调节pH至5.5。加入20 g琼脂以制备固体培养基。
    2. 使用磁力搅拌子将各组分溶解于溶液中。琼脂将在高压灭菌后熔化。
  5. 孢子形成琼脂加补充物培养基（SPAS）
    1. 在2 L锥形瓶中加入1 L蒸馏水、10 g葡萄糖、1 g KH2PO4、1 mL维生素储备液，以及各45 mg的腺嘌呤、尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和盐酸赖氨酸。加入20 g琼脂以制备固体培养基。
    2. 使用磁力搅拌子充分混合各成分。琼脂将在高压灭菌后熔化。

2. 裂殖酵母培养15,16

  1. 使用 YES 固体培养基从低温保存状态复苏裂殖酵母菌株。根据每种菌株的温度需求，在 25 °C 或 32 °C 下培养 3–5 天。
  2. 当可见菌落形成后，制备起始液体培养物。挑取单个菌落中的细胞，接种至含有 3 mL YES 液体培养基的试管中，在适宜温度下培养至对数中期或对数后期。
    注意： 为保证充分通气，所用试管或烧瓶的容积应至少为液体培养物体积的 5 倍。常规培养时，摇床转速通常为 150–220 rpm。
  3. 将 250–500 µL 起始培养物转移至含有 9.5–9.75 mL YES、EMM 或 PMG 并添加适当补充物的 50 mL 烧瓶中。让细胞生长至所需密度，并在显微镜下检查细胞形态和营养状态。
    注意： 若需将复苏后的菌株保存一个月以内，可用封口膜密封 YES 平板，并置于 4 °C 保存。

3. 样品制备2

  1. 显微镜载玻片制备
    1. 在含有100 mL最低培养基加补充物（用于有丝分裂）或液体SPAS（用于减数分裂）的500 mL烧杯中加入2 g琼脂糖。将琼脂糖溶液在微波炉中以60%功率每次加热10秒，或置于55 °C水浴中10分钟，使其融化。轻轻摇动溶液以确保充分熔化。准备琼脂糖载玻片制备装置（图1A），以便快速制备琼脂糖垫并防止熔融琼脂糖过早凝固。
    2. 将熔融琼脂糖在室温下冷却1分钟，使用宽口移液器吸头在显微镜载玻片上滴加50–100 µL液滴。在琼脂糖冷却前，将另一张载玻片盖在液滴上，形成直径约1.5–2 cm的琼脂糖垫（Figure 1B-C）。琼脂糖垫的厚度通常与成像时间长度成正比，即较厚的垫可支持更长时间的成像。
    3. 使用碳氢化合物混合物作为密封剂，以确保厚琼脂糖垫的载玻片覆盖严密，并防止盖玻片边缘溶剂暴露导致细胞死亡。在500 mL烧杯中按等质量比例（w/w）混合凡士林、羊毛脂和石蜡。在加热板上于120 °C加热5分钟。当各组分熔化后，小心摇动熔融溶液以确保充分混合。
  2. 样品制备
    1. 为观察有丝分裂事件，将起始培养物的细胞在液体EMM或PMG加补充物中培养至对数中期（OD595约为0.4）。取1 mL细胞悬液，在1,375 × g条件下离心1分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于加补充物的最低培养基中，最终体积为100 µL。
    2. 为观察减数分裂事件，将起始培养物的细胞在加补充物的最低培养基中培养至对数后期（OD595为0.7–1.0）。取等体积的相反交配型细胞（h- 和 h+）混合于1 mL细胞悬液中。在1,375 × g条件下离心1分钟，弃去上清液后将沉淀重悬于液体ME培养基中。重复此步骤三次，以确保充分去除营养物质。
    3. 最后一次ME洗涤后，将细胞重悬于1 mL ME培养基中，并转移至含有9 mL ME的50 mL锥形瓶中。在22–25 °C、最低转速（50–100 RPM）条件下振荡培养12–16小时。大量细胞絮凝现象表明形成了许多圆形裂殖酵母聚集体，提示交配效率良好。
    4. 取1 mL交配培养物，于1,375 × g离心1分钟。弃去上清液，但保留250 µL液体于管中以重悬细胞。在将细胞置于琼脂糖垫前，剧烈涡旋振荡5秒以打散聚集体。
      注意：用于重悬细胞的剩余250 µL ME培养基中含有促进细胞进入减数分裂的交配因子。
    5. 取20 µL有丝分裂或减数分裂细胞悬液置于2%琼脂糖垫上。将载玻片倒置，放在无绒纸巾上2–3秒，以去除多余培养基（图1D）。将载玻片垫面朝上放置，轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡（图1F）。
      注意：使用纸巾去除多余培养基比依靠重力自然吸收更节省时间，这在减数分裂实验中尤为关键。
    6. 为形成单层细胞，用食指顺时针旋转盖玻片一圈（有丝分裂）或两圈（减数分裂）（图1F）。确保细胞均匀分散在琼脂糖垫上，以利于单个细胞或子囊更好地分离。借助小木棒，沿盖玻片边缘滴加熔融密封剂，密封每个琼脂糖垫（图1G）。
    7. 琼脂糖垫密封后，将其置于显微镜载物台上，在适当的成像条件（如温度）下平衡10–15分钟（图1H），使气泡消散，并允许琼脂糖在最后阶段完成微小位移。待载玻片充分平衡后开始成像，并在数据采集结束前勿将其从载物台上移开。
      注意：温度与湿度的控制取决于所使用的显微镜系统及具体实验需求。若设备具备温湿度控制功能，应在所有成像实验中启用；若无此功能，研究人员需自行设计方法防止温度波动，尤其是在减数分裂实验中。

4. 活细胞成像2 与图像处理

  1. 使用40倍物镜找到合适的视野进行成像。切换至60倍物镜开始数据采集。根据所使用的显微镜系统，每个时间点对样品的后续重新对焦和光学切片可通过手动操作，或通过显微镜或软件自动完成。
    注意：本方案中展示的图像使用配备Sedat、RFP和GFP滤光片组、纳米运动载物台、60倍NA 1.4物镜以及12位CCD相机的去卷积荧光显微镜采集。内置机械快门和电动滤光轮可减少激发光暴露，降低样品的光漂白。
  2. 使用适当的软件进行图像采集与处理。为去卷积图像，应采用制造商提供的光学传递函数。
    注意：有关本方案中使用的显微镜设备和软件的详细信息，请参见材料表。
  3. 若使用常规荧光显微镜采集活细胞图像，需确保显微镜具备数字数据采集功能，配备数值孔径（NA）大于1.2的40倍或60倍物镜，并能够执行光学切片。
    注意：若不满足上述条件，图像分辨率将降低，影响显微测量结果的准确性和定性观察的质量。
  4. 使用免费插件程序（例如Fiji）以最小化图像采集过程中因对比度损失引起的系统性模糊误差17,18,19,20，并确保对荧光强度及其他细胞内时间动态事件进行正确的定量分析。
    注意：其他可用的商业去卷积程序见材料表。
  5. 选择最匹配所观察荧光染料的显微镜滤光片组。确保激发和发射滤光片具有合适的通带，以实现对荧光蛋白的特异性检测。例如，检测CFP信号时，激发和发射通带应分别为430/25和470/30，而该设置不适用于RFP荧光检测。
  6. 对裂殖酵母进行多时间点成像时，采用最小有效设置法（MESA）。即避免长时间使用激发光，采用最低的激发光强度和曝光时间，以获得可接受、可量化且可重复的成像数据。
  7. 在有丝分裂或减数分裂的长时间成像过程中，时间点之间的采集间隔应控制在5–10分钟。尽管2%琼脂糖垫可支持12至16小时的成像，但琼脂糖蒸发可能导致细胞位移。因此，建议分别在4–6小时或8–10小时内完成完整的有丝分裂或减数分裂实验。
  8. 采集持续4–8小时的成像数据，分别包含至少24–48个时间点，每个时间点针对一种荧光蛋白，并在每个荧光通道采集由13个层面组成、层间距为0.5 µm的z轴堆栈图像，使用60倍物镜。此过程至少需要0.5–1 GB的硬盘存储空间。因此，除避免光漂白和细胞位移外，还需建立考虑计算能力的工作流程1,2,3。
    注意：这些采集参数通常在控制显微镜功能、采集和处理图像的软件中进行设置和调整。
  9. 为更详细地观察特定的核内过程，可在发射信号在频繁激发后未显著下降的前提下，每5–10秒进行一次图像采集。应对不同时间段进行初步的荧光强度分析，以确定数据准确性不再可靠的临界点1,3。
  10. 在图像采集和图像处理软件中，对图像z轴堆栈使用最大强度投影，以在二维平面上观察所有高荧光密度结构，而不论其垂直位置如何1,2,3。这有助于快速检查在不同体素中发生的核过程。同时采集一个中焦平面的明场图像，作为所观察细胞的参考图像。

5. 图像分析20,21

注意：本方案中的图像分析使用 Fiji 软件进行。有关其他分析软件及 Fiji 插件，请参见材料表。

  1. 通过在 Plugins 菜单下选择 Bio-Formats Importer 功能上传去卷积图像。在弹出的 Import Options 窗口中，选择 Hyperstack、Default color mode，并勾选 Autoscale，然后点击 OK 按钮。
  2. 通过滚动底部相应的滑块，确认显示窗口中荧光通道和时间帧的数量正确。将其保存为 Tiff 文件，该格式不压缩数据，可防止信息丢失。
  3. 打开一幅由显微镜软件在数据处理过程中生成的比例尺图像。使用直线工具绘制一条与比例尺长度相近的平行线，然后从 Analyze 菜单中选择 Measure，以确定比例尺的像素长度。通过从 Analyze 菜单中选择 Set Scale，设置图像的像素与微米比例，从而添加比例尺。
    1. 在弹出的 Set Scale 窗口中，输入计算得到的 Distance in pixels 和 Known distance in µm，将 Pixel aspect ratio 设为 1.0，将 Unit of length 设为 micron，并勾选 Global 复选框，然后点击 OK 按钮。
  4. 在 Analyze 菜单中使用 Set Measurements 选项，选择在执行 Measure 时需要量化的不同参数。本实验方案中，请选择以下指标：Area、Perimeter、Mean gray value、Median、Min & max gray value、Integrated density、Stack position 和 Display label。
  5. 根据所采集数据的精度，将 Decimal places 选项设置为大于 1 的数值，必要时勾选 Scientific notation 复选框。执行 Measure 命令后，将弹出 Results 窗口，显示每个相关参数的数值。将结果保存为 .csv 文件，以便后续在统计分析软件中进行分析。
    注意：在测量长度时，通常无需将图像拆分为各个荧光通道，除非不同颜色之间存在信号干扰；若存在干扰，请执行下述步骤。
  6. 若存在信号干扰，请从 Image 菜单中选择 Color and Channels Tool，并分别分析每种颜色。对于非线性结构的长度测量，右键点击 Line Tool，使用 Segmented Line 或 Freehand Line 选项勾勒目标对象。
    1. 对于线性结构或两点间距离的测量，使用 Straight Line 工具，并从 Analyze 菜单中选择 Measure。以 µm 为单位的长度值将自动添加到先前在 Set Measurements 选项中选定的参数中。
  7. 为测量信号大小和荧光强度的变化，首先创建一个感兴趣区域（ROI）库，以提高量化准确性，并加快在图像堆栈中的测量速度。从 Image 菜单中选择 Color 和 Channels Tool。
  8. 在弹出的 Channels 窗口中，勾选将用于测量强度或面积的颜色通道。从 Image 菜单中选择 Adjust 和 Threshold 功能。勾选 Dark background 复选框，选择 Default 方法（除非所采集数据有其他要求），并将 Red 作为覆盖感兴趣信号的颜色。
    注意：蛋白质稳定性、运动和定位的测量高度依赖于创建 ROI 库时所使用的颜色阈值。为待观察的荧光标记信号选择正确的阈值方法至关重要17,18。
  9. 使用 Wand tool 选中每个感兴趣结构，然后按键盘上的 T 键，将选定的 ROI 添加到弹出的 ROI manager 窗口中。对图像堆栈中的每一层（时间帧）重复此过程，并点击 More 按钮后选择 Save，以保存所有 ROI。
  10. 打开压缩的 ROI folder 以加载 ROI manager，然后点击左侧面板中的每个 ROI identifier。从 Analyze 菜单中选择 Measure，并对每个 ROI 标识符重复此命令，以量化图像堆栈所有切片中的感兴趣对象。
  11. 若细胞未发生位移，且堆栈中所有切片的焦平面保持一致，可在 ROI manager 中点击 Multi measure。在弹出窗口中，选择 Measure all slices 而非 One row per slice，以在图像堆栈中迭代测量。将结果保存为 csv 文件，并在统计分析软件中进行分析。
  12. 对于构成感兴趣结构的多个核信号，使用 Wand tool 选择对象时按住 Shift 键，以创建单个 ROI。或者，使用 Oval tool 创建一个固定大小的 ROI，以包含所有感兴趣的信号。
    注意：当荧光信号随时间在大小和强度上发生变化时，采用椭圆方法可能是必要的，以便在特定区域内测量和描述信号行为。此时，信号强度是指给定区域内的平均信号密度。
  13. 通过观察两个荧光信号重叠区域的颜色变化，可定性判断其共定位情况。然而，当共定位区域变窄时，信号重叠更难区分。此时，请执行下述步骤。
  14. 使用 Channels Tool（如步骤 5.6 所述），在每个待分析信号上绘制一条直线，然后从 Analyze 菜单中选择 Plot Profile 命令。
    1. 使用同一条绘制的直线，对所有待分析颜色重复此步骤。
    2. 每次执行剖面分析后，会弹出 Plot of sample 窗口，点击 List 按钮以调出 Plot Values 窗口，并将每个信号的测量值保存为 csv 文件。
    3. 在统计分析软件中，绘制每种信号的 Gray Value 与其沿直线位置（单位：µm）的关系图。若信号剖面图之间无重叠，通常表明不存在共定位。
      注意：使用 Plot Profile 工具分析投影图像以检查信号共定位。但该方法仅在图像 z 堆栈中也观察到相应重叠时才可靠。
  15. 为监测荧光蛋白随时间的动态行为，请使用 Analyze 菜单下的 Multi Kymograph 工具。生成的图像通过 z 堆栈中每一层的一系列压缩快照，显示荧光信号的移动，每一层代表一个独立的时间点。
    1. 如步骤 5.6 所述，使用 Channels Tool 在正确通道中分离出感兴趣对象。确保所选对象或结构在 z 堆栈中未发生显著位移。在对象上放置一条直线或矩形，从 Analyze 菜单中选择 Multi Kymograph 工具，并输入覆盖对象的线条宽度。
  16. 使用 Channels Tool（如步骤 5.6 所述）并从 Image 菜单中选择 Stacks 和 Make Montage 工具，创建显示特定时间窗口内核动态的图像面板。在弹出的 Make Montage 窗口中，输入所需的列数和行数，设置 Scale Factor 为 1.0，选择 First 和 Last 切片（时间帧），并将 Border width 至少设为 5，然后点击 OK。通过调整 Increments，可选择堆栈中要显示的图像序列。
    1. 为生成视频，请上传所需的超堆栈，从 File 菜单中选择 Save 为 avi 文件，Compression 选择 none，并设置 Frame rate 为 2-8 fps。在选择 Make Montage 命令时，于 Channels Tool 中选择 Composite，以合并或分离图像中的所有颜色。
      注意：本实验方案中提供了两个 avi 文件（Movie 1-2）。可在 Fiji 中使用它们尝试步骤 5 中强调的不同功能。
    2. 为展示单个代表性细胞，从 Image 菜单中使用 Transform 和 Rotate，并输入旋转角度。负数表示向左旋转，正数表示向右旋转。待细胞处于合适方向后，在 z 堆栈中或感兴趣时间帧内绘制一个包含整个细胞的矩形，然后从 Image 菜单中选择 Crop。随后按照步骤 5.16 和 5.16.1 的方法生成图像面板或视频。
  17. 通过从 Analyze 菜单中选择 Tools 和 Scale bar，为图像面板或视频添加比例尺。在弹出的 Scale Bar 窗口中，单个细胞的比例尺宽度输入 5-15 µm，整个视野输入 100-250 µm，选择白色或黑色作为 Color，并选择合适的位置放置比例尺。
    1. 对于视频，显示核事件过程中的时间进展非常有用。为显示帧间的时间变化，请选择 Image，点击 Stacks，使用 Time Stamper 工具，标明时间序列的起始帧，并选择合适的位置显示时间。

结果

无论使用活细胞成像技术研究有丝分裂还是减数分裂，进行任何观察之前都必须采用健康的裂殖酵母细胞。实验数据的质量在很大程度上依赖于起始材料的状态。如果细胞因营养限制或过度生长而处于饥饿状态，将表现出过多的液泡和细胞体积减小（饥饿状态，图2A）。在进行有丝分裂实验时，应避免使用表现出细胞应激的细胞（饥饿状态，图2A），否则实验结果将不一致且不可重复。为避免这一局限，应选择合适的野生型对照，并熟悉目标突变体的各种表型。例如，饥饿12小时的有丝分裂细胞将停止DNA的主动复制。由于Tos4-GFP的表达与G1/S期活性相关22,23，携带该标记以及核分裂标记（Sad1-DsRed10）的对数生长期细胞会表现出全核的Tos4-GFP表达、Sad1-DsRed焦点的分离以及持续的隔膜形成（提示正在进行DNA复制和细胞分裂）（对数期，图2A），而饥饿细胞则无此类活动（饥饿状态，图2A）。该结果与营养限制在裂殖酵母中的作用一致：营养限制会降低G1期的转录活性，激活G1/S期细胞周期检查点，并促进细胞进入G0期5。在进行减数分裂实验时，细胞需生长至高密度，但不能进入静止期。随后，将两种交配型的细胞混合，并在低氮培养基中共同孵育。若细胞未充分经历氮饥饿，则无法成功交配，从而阻碍其进入减数分裂（交配效率低下，图2B）。交配细胞悬液中出现明显的絮状聚集，表明细胞间相互作用增强，提示交配成功并实现了高效的减数分裂诱导（交配高效，图2B）。

琼脂糖凝胶垫以及细胞团块的物理性分散可确保单个细胞或子囊（Log，图2A；Efficient，图2B）的清晰观察。凝胶垫必须提供一个坚固但保持湿润的平台，使细胞在固定位置的同时免受干燥影响。此外，凝胶垫需具备足够的厚度，以抵抗因蒸发引起的变化，并提供一个平整的表面，确保在整个图像采集过程中能够准确对焦（图1C）。盖玻片旋转对于分离和铺展交配聚集体内的细胞是必要的（图1F；Efficient，图2B）。若缺少此步骤，则仅能观察到少量子囊，而单倍体细胞数量较多，原因是子囊被困在交配团块的深层无法观察，而单倍体细胞则可自由分布于所有可用的单层区域（图2B）。即使在细胞聚集问题较小的有丝分裂实验中，盖玻片旋转也能使细胞在凝胶垫上分散，形成单层细胞，并在细胞间保留足够空间，以减少拥挤效应并允许细胞增殖（Log，图2A）。

Atb2 是一种 α-微管蛋白组分，参与裂殖酵母有丝分裂和减数分裂过程中的染色体分离7,14。当使用荧光标记时，该细胞骨架组分可用于观察有丝分裂中核分离的各个阶段。在前期（0’-20’，图 3A）阶段，纺锤体极体（SPBs）的核侧开始成核形成有丝分裂纺锤体，这一过程通过 Atb2-mRFP 纤维在 Htt1-GFP5 全核背景下的信号得以显现。在中期-后期转换阶段（20’-40’，图 3A），有丝分裂纺锤体向外延伸，细胞核分裂为两个。当细胞进入末期（60’-80’，图 3A）时，Atb2-mRFP 双向扩展，直至染色体完全分离。此后，Atb2-mRFP 纤维重新聚集并扩散至子细胞表面，恢复为间期形态。胞质分裂（>120’，图 3A）仅在隔膜形成并通过分裂将细胞一分为二后发生。通过追踪一个有丝分裂周期中 Hht1-GFP 荧光强度的变化，可揭示核动态的三个关键步骤：中期-后期（中等强度，DNA 压缩：20’-40’，图 3A-B）、末期（低强度，DNA 分离：60’-80’，图 3A-B）以及 G1 期（强度上升，DNA 复制：100’-120’，图 3A-B）。类似地，使用仅携带 Hht1-mRFP 的细胞，并在 Fiji 中应用多线扫描工具（见步骤 5.15），可观察从中期到末期的有丝分裂过程，并评估姐妹染色单体正常分离过程中的核运动（正常，图 3C）。异常分离的线扫描图像显示在两条主要核路径之间出现信号活动，提示可能存在因染色体断裂或染色单体分离异常导致的分离错误（滞后，图 3C）。

如前所述，在芽殖酵母和裂殖酵母中，Tos4 在 G1 期转录，并在 S 期 DNA 复制过程中发挥作用22,23在Kymograph中可以观察到，Tos4-GFP在细胞核中的表达在Sad1-DsRed之后增加10 焦点向相反方向移动（表明核分裂），但在隔膜形成之前（隔膜形成先于胞质分裂）（39’） 图3D; 36’, 图3E）。Tos4-GFP 高活性阶段始于 M-G1/S 转换期末期（45’， 图3E）并结束于G2（>60’, 图3E)，细胞分裂结束后立即出现。Tos4-GFP信号在G1期广泛弥散，而在后期之后至S期信号强度逐渐增强，并与分离的Sad1-DsRed焦点共定位（45’-60’） 图3E)。该结果揭示了裂殖酵母的分裂期，此时子细胞的基因组复制已开始（G1/S期），但胞质分裂尚未发生。

Hht1 是裂殖酵母中的组蛋白 H3，通常被标记荧光标签以可视化细胞核 DNA5,14。在有丝分裂过程中，当细胞从中期过渡到末期（20’–120’，图 3A）时，可观察到细胞核质量的两个明显变化。第一个变化是中期时细胞核体积收缩（20’，图 3A），第二个变化是后期时细胞核分裂（40’，图 3A）。除了与有丝分裂细胞共享这些变化外，减数分裂细胞还在同源重组期间表现出细胞核振荡（即“马尾”现象）（-100’ 至 -50’，图 4A–B），并在后期 II 结束时进一步减小细胞核体积（70’–90’，图 4A）。Hht1-mRFP 用于检测染色体错分离表型，例如滞后或断裂的染色体（滞后，图 3C）。该标记也用于观察和描述减数分裂各阶段的细胞核动态（图 4A–B）。在大部分“马尾”阶段（HT：-100’ 至 -50’，图 4A–B），细胞核质量较大且体积波动明显。当细胞进入中期（MT：-40’ 至 0’，图 4A–B）时，细胞核体积和振荡幅度减小，这与该阶段染色质凝聚活性增强一致。减数分裂后期 I（MI：10’–60’，图 4A–B）和后期 II（MII：70’–90’，图 4A–B）的开始均伴随着细胞核进一步缩小且无明显移动，这与减数分裂 I 和 II（MI 与 MII）所特有的两次细胞核分裂过程高度相关。因此，减数分裂过程中，当同源染色体配对并发生重组时伴随细胞核体积波动，而在经历两次染色体分离后则出现细胞核体积的逐步缩小。影响这些细胞核动态的等位基因很可能参与调控减数分裂中的基因组稳定性12,13。

Rec8 是裂殖酵母减数分裂黏连蛋白中的 α-黏连素亚基。它在 DNA 复制后（减数分裂 S 期，mei-S）加载到染色质上，并将姐妹染色单体相互连接，直至减数第二次分裂后期。在第一次分裂中期之后，染色体臂上的 Rec8 被分离酶（separase）切除，而着丝粒区域的 Rec8 则由 Sgo1-PP2A 复合物保护。在同源染色体分离结束时，着丝粒处的 Rec8 也被清除，从而允许姐妹染色单体分离（图 5A）6,24。Rec8-GFP 与染色体分离标记物（如 Sad1-DsRed 或 Hht1-mRFP）联合使用，可实现对减数分裂过程中黏连动态的可视化观察。Rec8-GFP 信号在减数分裂 S 期（<<-90’，图 5A-B）、第一次减数分裂前期（-90’ 至 -50’，图 5A-B）以及第一次减数分裂中期（-40’ 至 0’，图 5A-B）呈全核分布。该现象表明 Rec8-GFP 沿染色体轴结合，且其加载紧随 DNA 复制之后。当细胞进入第一次分裂后期（10’，图 5A-B）时，核内 Rec8-GFP 荧光强度整体下降，但在着丝粒区域仍保持较强信号，并在每个核团中形成一个焦点（20’-70’，图 5A-B）。这一结果与 Rec8-GFP 在染色体臂上降解而不在着丝粒区域降解的现象一致，该过程发生在同源染色体分离之后。在第二次分裂后期之前，Rec8 焦点消失，使姐妹染色单体得以在 MII 期分离（70’-80’，图 5A-B）。因此，Rec8-GFP 标记物可用于研究破坏减数分裂黏连建立、去除及整体稳定性的各种条件。结合核分裂标记物（如 Hht1-mRFP5,13），Rec8-GFP 可用于探究减数分裂前后黏连的时间调控和稳定性如何影响染色体的正确分离12,13。本实验方案未涉及主要在细胞质中动态变化的蛋白质。然而，表 I 列出了几种常用于研究细胞骨架和膜相关过程（如内吞作用、外排作用及胞质分裂等）的细胞质蛋白。

静态平衡色谱装置示意图；玻璃载片、滴管、吸收研究。
图1：活细胞成像用琼脂糖垫的制备。（A）使用移液器吸头架、实验室胶带和显微镜载玻片组装的载片制备装置。将载玻片相互垂直放置，形成一个琼脂糖垫成型的凹槽。在两侧添加胶带碎片可调节琼脂糖垫的宽度以满足所需规格。（B）熔融的琼脂糖需冷却后再置于显微镜载玻片上制备成垫状。此步骤中，必须缓慢加入琼脂糖液体，以避免产生气泡。（C）将上层载玻片盖在已点样的琼脂糖液滴上，形成表面平整、边缘均匀且无可见裂纹的圆形垫片。（D）在琼脂糖垫上放置细胞悬液样品后，将载玻片翻转并置于无尘纸巾上，以去除多余的液体培养基。（E）小心地将盖玻片放置在琼脂糖垫上，确保不夹入气泡，并检查焦平面是否平坦，以避免细胞移位和聚焦问题。（F）缓慢而谨慎地顺时针旋转盖玻片，以打散细胞团块，形成允许细胞扩展并利于观察的单层细胞。（G、H）使用加热的碳氢化合物混合物密封琼脂糖垫，并使其平衡至成像所需的温度。请点击此处查看该图的放大版本。

酵母细胞荧光显微镜图像；Tos4-GFP 和 Sad1-DsRed 标记，交配效率分析。
图 2：选择合适的细胞。（A）上图显示裂殖酵母细胞在 EMM 培养基加补充物中饥饿培养 72 小时，下图显示处于对数生长期的细胞。在饥饿处理的细胞中，可见较小的细胞形态。红色空心箭头指示饥饿特征性的液泡颗粒。在对数培养物中，大量细胞呈现伸长形态和隔膜（红色箭头），表明活跃的细胞周期动态。右侧图显示在饥饿和增殖过程中表达 Tos4-GFP 和 Sad1-DsRed 信号的细胞。在活跃增殖期间可见全核的 Tos4-GFP 表达以及定位于细胞两极的 Sad1-DsRed 信号，而在饥饿状态下则无此现象。（B）上图显示相同交配型（h+）的细胞交配效率低下。红色空心箭头指示一对正在进行核融合的液泡细胞。这在 h+ 细胞培养物中并不罕见，其中约 10% 的细胞可转换交配型为 h-。下图显示高效交配后形成的子囊孢子。合子子囊呈现多种形态，包括锯齿状（红色箭头）和香蕉状细胞形态（红色空心箭头）。比例尺 = 5 µm。 请点击此处查看本图的放大版本。

有丝分裂过程、细胞分割；明场、Atb2-mRFP、Hht1-GFP；示意图、显微镜延时分析。
图3：有丝分裂期间细胞核的动态变化。（A）在一个有丝分裂周期（120 分钟）中追踪组蛋白 H3（Hht1-GFP）和微管蛋白（Atb2-mRFP）的信号。Hht1-GFP 和 Atb2-mRFP 的独立信号分别显示在黑白图中，而明场合并图像则以各自的颜色呈现。（B）有丝分裂周期中 Hht1-mGFP 荧光强度的定量分析。Hht1 水平的变化反映了有丝分裂过程中的核分裂以及 G1 期的 DNA 复制。（C）线扫描图（kymograph）显示有丝分裂中正常或异常的染色体分离情况，其中产生的细胞核运动轨迹或呈分叉并保持 DNA 完整性，或发生偏离并分别导致染色体断裂或姐妹染色单体过早分离。（D、E）线扫描图与显微图像显示通过 Sad1-DsRed 的分离以及细胞核内 Tos4-GFP 信号的出现所揭示的 M 期到 G1/S 期的持续时间。请注意 E 中间图使用 Fiji 软件中的 FIRE 查找表（LUT）生成，以创建强度梯度的热图，有助于识别 Tos4-GFP 高表达区域；在此例中，信号定位于细胞核内，并与 Sad1-DsRed 信号共定位，符合预期。比例尺长度 = 5 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

减数分裂核动态；核面积、轴长随时间变化的示意图；合并显微图像。
图 4：减数分裂核动态。 （A）图示系列显示减数分裂过程中细胞核（Hht1-mRFP）的运动、凝缩与分裂。马尾运动（HT）表现为细胞核大幅度的左右振荡，随后进入中期（MT），此时核的侧向运动逐渐减弱，并在第一次减数分裂后期之前完全停止。在减数分裂 I（MI）中，主核物质分裂为两个，而在减数分裂 II（MII）中，随着姐妹染色单体的分离，最终形成四个核。（B）前期、中期、MI 和 MII 期间核面积变化（Hht1-mRFP）的定量分析。在 HT 振荡期间核面积呈动态变化，在 MT 期发生凝缩，并在 MI 和 MII 期间进一步缩小，此时几乎观察不到核运动（长核轴）。测量最长核轴（Long Nuclear Axis）的依据是：当一个圆形被拉伸时，其直径不再恒定，从而形成至少两条主要轴线——长轴与短轴。因此，在监测核变化时，长轴或短轴的变化均可反映核的运动情况。比例尺 = 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

减数分裂黏连蛋白动态；图表；核面积、黏连蛋白水平与减数分裂各阶段（MI、MII）时间的关系。
图 5：减数分裂黏连蛋白动态。 （A）系列图像显示 Rec8-GFP 信号变化与减数分裂核动态的相关性。在 HT 和 MT 期，Rec8-GFP 信号遍布整个细胞核，并随细胞核移动（Hht1-mFRP）而移动。在 MI 期，Rec8-GFP 从细胞核中消散，仅保留一对焦点，这与 Rec8 从染色体臂上移除以及着丝粒处 Sgo1-PP2A 保护机制的建立一致。当细胞进入 MII 期时，Rec8-GFP 焦点开始消失，在 II 期后期开始前已不可见。（B）从 HT 到 MII 期 Rec8-GFP 荧光强度的定量分析。与（A）中观察到的结果相似，GFP 信号在 HT 和 MT 期保持较高水平，在 MI 期显著下降，并在 MII 期完全消失。该模式印证了染色体臂和着丝粒处黏连蛋白的动态变化，后者将姐妹染色单体保持连接状态，直至 MII 期准备分离时才解离。比例尺 = 5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质功能评论标签参考文献
Hht1组蛋白 H3 参与 DNA 包装用于研究染色体动态Hht1-mRFP5,14
Tos4Tos4 的功能在 G1 期发生用于研究G1期时间调控Tos4-GFP22,23
Rad21/Rec8参与复制后维持姐妹染色单体结合的黏连蛋白亚基用于分析有丝分裂（Rad21）和减数分裂分离（Rec8）过程中的黏连稳定性Rad21-GFP/Rec8-GFP6,24
Rad11RPA 活性出现在有丝分裂 DNA 修复、减数分裂重组过程中，并持续至中期结束用于研究有丝分裂中的DNA修复及减数分裂中的重组动态Rad11-YFP5,13
Rad52Rad52 活性发生在有丝分裂 DNA 修复和减数分裂重组过程中用于研究有丝分裂中的DNA修复及减数分裂中的重组动态Rad52-CFP5,13
Cnp1组蛋白 H3 CENP-A 特异性定位于着丝粒用于追踪有丝分裂和减数分裂中的染色体分离动态Cnp1-mCherry13
Swi6参与异染色质形成的HP1同源蛋白用于研究着丝粒和端粒处异染色质的移动Swi6-GFP13
Sad1Sad1 参与将纺锤体极体定位于核膜用于分析有丝分裂和减数分裂中的染色体分离Sad1-mCherry10
细胞质溶胶 & 膜
Atb2微管蛋白α2参与微管细胞骨架的组织用于检测有丝分裂和减数分裂中的染色体分离Atb2-mRFP7,14
Ync13参与囊泡介导运输的胞吐与胞吞作用调节因子用于研究细胞分裂过程中细胞壁的完整性Ync13-mECitrine25
Rlc1参与收缩环收缩的肌球蛋白 II 亚基用于研究隔膜成熟与收缩的动力学过程RIc1-mCherry25
Ccr1内质网、质膜及线粒体外膜中的NADPH-细胞色素P450还原酶用于研究与膜相关的动态过程，如内吞作用、外吐作用和细胞分裂Ccr1N-GFP5
Gef1参与细胞极性建立与维持的 Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子用于研究全局性、微管依赖的细胞极性动态Gef1-mCherry-GBP26
Fus1参与胞质融合过程中肌动蛋白融合焦点组装的甲酰胺用于研究裂殖酵母交配过程中相关的融合动力学Fus1-sfGFP27
Mnn9高尔基体中参与蛋白质N-连接糖基化的甘露糖基转移酶亚基用于研究货物蛋白在高尔基体中随着其转运过程而发生的成熟变化 cis-高尔基体到 转-高尔基体Mnn9-mCherry28
Num1参与尾部摆动过程中驱动蛋白皮层锚定的因子用于研究减数分裂前期 I 核振荡过程中线粒体依赖的驱动蛋白锚定Num1-yEGFP29

表1：细胞核与细胞质动态的标志物。

显示带有DNA标记的细菌细胞的荧光显微镜图像，突出显示基因定位。
视频 1：M期到G1/S期转换过程，显示纺锤体极体（SPB；Sad1-DsRed）分离发生在细胞分裂之前，并伴有Tos4-GFP核信号的积累。 请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

荧光显微镜图像、染色体结构、着丝粒标记、基因定位研究。
视频 2：有丝分裂周期的完成过程，显示微管（Atb2-mRFP）延伸与细胞核（Hht1-GFP）分裂的相关性。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

讨论

在有丝分裂和减数分裂期间进行活细胞成像，可提供观察细胞核动态的机会，同时在数据采集过程中不会显著干扰裂殖酵母的生理状态。然而，必须谨慎操作，以确保细胞在无环境胁迫的条件下生长至所需密度；对于减数分裂实验，还需确保细胞处于终末分化阶段成像，而非过早或过晚。细胞过度拥挤、营养缺乏以及不适宜的培养温度是导致实验结果不可重复的常见因素。此外，在构建菌株时，至关重要的是验证荧光标签是否干扰目标基因的功能或影响细胞的整体适应性。若未能仔细检查携带荧光标记菌株的表型，可能导致相同基因型之间出现不一致且不可比较的结果。

尽管显微镜用琼脂糖垫的制备较为简单，但在获取有价值的成像数据时也可能带来一定困难。制备琼脂糖垫的方法很简单：将三块载玻片平行放置，将熔化的琼脂糖滴加在中间的载玻片上，再用另一块载玻片横跨覆盖在其余载玻片的顶部即可。然而，构建一个可调节宽度的载玻片制备装置，有助于制造出稳定且适用于特定实验条件的琼脂糖垫，更具实用性。一种简单的、可灵活调节垫片宽度的装置包括一个平台（如移液器吸头架或实验台）、两块显微镜载玻片，以及作为调节垫片宽度机制的实验室胶带（图1A）。琼脂糖垫的确切厚度取决于成像时间要求、琼脂糖品牌、温度、盖玻片封固剂、蒸发速率等因素。因此，在数据采集前对成像系统进行校准至关重要，以提高技术上的可重复性，并提升活细胞成像的质量1,2,3。在长时间成像过程中，琼脂糖垫的表面特性、刚性和组成成分均至关重要。琼脂糖具有低背景荧光、易于塑形，并且在适当浓度下能够抵抗因蒸发引起的结构变形。此外，将裂殖酵母培养基与琼脂糖混合不会影响成像质量，可实现对多次有丝分裂和减数分裂周期的长期观察。同时，在延时显微成像中应避免任何气泡的产生。琼脂糖垫内部及样品中的气泡会随时间逐渐膨胀，导致细胞移位并破坏焦平面。只要通过旋转盖玻片使细胞充分分散，研究人员便可连续追踪多个世代的有丝分裂过程以及从核融合到孢子形成的减数分裂事件。制备和选择合适的成像用琼脂糖垫需要一定时间来掌握，但一旦掌握，将有助于获得高度信息丰富的显微观察结果。

与其他方法一样，活细胞显微镜技术也存在一定的技术局限性。使用荧光标记蛋白会为实验带来限制，从而影响可研究问题的范围。光漂白和光毒性是长时间成像过程中常见的问题，可通过避免对细胞过长时间或过于频繁地暴露于短波长光下来减轻。对于涉及GFP、CFP、YFP、mRFP和DsRed（裂殖酵母活细胞成像中常用的典型荧光蛋白）的实验，常规实验通常采用5-15%的激发光强度和100-500毫秒的曝光时间。然而，这些参数需根据研究人员的具体实验需求进行调整。此外，使用60倍物镜获取包含9至13个层面、层间距为0.5 µm的z轴层扫图像，足以分辨裂殖酵母细胞的厚度。同时，必须确认荧光标记不会干扰目标蛋白的正常调控或功能，也不会产生虚假的表型。因此，建议构建包含不同荧光标签和亲和标签的菌株，以通过多种方法验证观察结果。此外，研究人员有责任确保实验参数在不同实验间具有可重复性，并且所收集的数据适用于后续分析1,3。没有任何技术可以取代通过仔细观察和严格检测荧光信号线性响应来细致验证实验系统的久经考验的做法。

最后，以不修改原始图像的格式分析显微镜数据至关重要。Fiji 提供了出色的文档记录工具，可追踪原始数据的测量结果，并允许研究人员在单次操作中检测不同的细胞参数。这些功能，加上其丰富的在线教程和广泛的文献支持，使 Fiji 成为测量、分析和展示裂殖酵母在有丝分裂和减数分裂过程中核动态的活细胞成像数据的重要工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Natalia La Fourcade 和 Mon LaFerte 为本论文的撰写工作带来的愉悦体验。感谢 Forsburg 实验室的各位成员，他们以深刻的见解、实验构思以及精神上的支持，为本研究的完成作出了贡献。本项目得到了 NIGMS R35 GM118109 对 SLF 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
60倍平场复消色差物镜OlympusAMEP4694
腺嘌呤SigmaA-8751
琼脂7558BIB4917-10 kg
琼脂糖SigmaA9539-500g
Belly Dancer旋转仪Stovall美国专利 #4.702.610
生物素SigmaB-4501
硼酸SigmaB-6768-5kg
CaCl2·2H20,SigmaC3306-500G
柠檬酸SigmaC-0759
Convolve 3D 软件插件OptiNav, Inc.n/a
CoolSnap HQ CCD 相机Ropern/a
盖玻片VWR16004-302
CuSO4·5H20,ENDCX-2185-1
DeltaVision 去卷积荧光显微镜GE Healthcare/Applied Precisionn/a
Diffraction PSF 3D 软件插件OptiNav, Inc.n/a
爱丁堡最小培养基（EMM）氮源Sunrise2023;1kg
FeCl2·6H2OENDFX9259-04
葡萄糖SigmaG-7021
加热板BarnsteadThermo Lyne
组氨酸SigmaH8125-100g
Huygens 去卷积软件SVIn/a
Imaris 去卷积软件Bitplanen/a
培养箱Shell lab#3015
肌醇SigmaI-5125
Iterative Deconvolve 3D 软件插件OptiNav, Inc.n/a
KClMallinckrodt6858-04
羊毛脂SigmaL7387-1kg
亮氨酸SigmaL8912-100g
赖氨酸SigmaL5626-500g
麦芽提取物（ME）MP4103-032
MgCl2·6H20AMRESCO0288-500G
MetaMorphMolecular Devicesn/a
显微镜载玻片VWR16004-422
MnSO4,Mallinckrodt6192-02
钼酸SigmaM-0878
Na2S04Mallinckrodt8024-03
烟酸,SigmaN-4126
泛酸SigmaP-5161
石蜡Fishers80119WX
裂殖酵母谷氨酸培养基（PMG）Sunrise2060-250
softWorx v3.3 图像处理软件GE Healthcaren/a
孢子形成培养基粉末Sunrise1821-500
温度控制离心机BeckmanAllwgra 6KR xentrifuge
尿嘧啶AMRESCO0847-500g
凡士林EqualineF79658
酵母提取物EMD1.03753.0500
酵母提取物加补充剂（YES）Sunrise2011-1kg
ZnSO4·7H2OJ.T.Baker4382-04

参考文献

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy–tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  2. Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
  3. Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
  4. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).
  5. Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
  6. Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
  7. Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622(2012).
  8. Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
  9. Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622(2012).
  10. Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
  11. Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
  12. Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
  13. Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
  14. Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
  15. Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
  16. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
  17. Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
  18. Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
  19. Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
  20. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
  23. Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895(2012).
  24. Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
  25. Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
  26. Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).
  27. Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
  28. Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
  29. Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).

重印与许可

标签

Fiji Z
利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。