无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

摘要

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。

摘要

从人多能干细胞（PSCs）中获得具有功能的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）一直是实现治疗血液系统疾病和恶性疾病自体移植的难点。生血性内皮（HE）是一种可用于通过转录因子生成功能性HSPCs，或高效诱导淋巴细胞的可行平台。然而，目前获得HE的方法要么成本高昂，要么产量不稳定。在本方案中，我们建立了一种经济高效且精确的方法，可在无饲养层、无异源成分的明确条件下，于4天内获得HE。所获得的HE经历了内皮向造血转变过程，并产生了CD34⁺CD45⁺克隆形成性造血祖细胞。该平台在生成功能性HSPCs方面的潜力，将在疾病建模及治疗化合物筛选中具有广泛的应用前景。

引言

由于缺乏基于患者多能干细胞（PSCs）来源的自体造血干细胞（HSCs）进行疾病建模和高通量药物筛选的稳健平台，血液系统和免疫系统疾病新疗法的开发一直受到阻碍。诱导性多能干细胞（iPSC）技术的突破为利用患者细胞建立疾病模型带来了希望，但从患者iPSCs中获得具有功能的HSCs仍极具挑战。为了从人PSCs中获得HSCs，关键在于正确诱导胚胎模式形成及相关转录程序^{1,2,3,4,5,6,7,8}。近年来在造血发育领域的进展揭示了生血性内皮（HE）在HSC发育中的关键作用⁹。HE可由PSCs诱导产生，并适用于基因转导等下游干预操作^10,11,12,13。以HE为平台，联合表达5种转录因子（ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1）已成功诱导出具有长期植入能力并可分化为多种谱系的功能性HSCs¹⁴。然而，PSCs向HE的诱导效率不稳定且偏低，限制了对造血发育过程中细胞的系统性操控与分析，也阻碍了临床应用所需即用型及大规模造血细胞的生产。

本文介绍了一种经济高效且精确的方法，可在4天内于无饲养层和无异源成分的确定性条件下诱导产生定型内胚层细胞。该方法中，PSC细胞在iMarix-511基质上形成球状体并自发重新铺展成单层，从而确保PSC克隆密度的一致性，这对于高效诱导定型内胚层细胞至关重要。

方案

1. 试剂

1. 细胞系（人多能干细胞）：获取人胚胎干细胞（ESC）或iPSC细胞系409B2、201B7(317-9)和CBA11。
2. 试剂配制
   1. 多能干细胞接种培养基：将多能干细胞维持培养基与10 µM Y-27632混合，4 °C保存。
   2. 多能干细胞球状体铺板培养基：使用前，将多能干细胞维持培养基与625–1,250 ng/mL人重组层粘连蛋白-511 E8片段（LM511-E8）（根据细胞系确定浓度）混合。
      注意：LM511-E8可直接加入培养基中¹⁵。其他基质（如全长层粘连蛋白-511）需预先包被，即使如此，在分化过程中也无法有效维持中胚层类器官的贴附。
   3. 第0天分化培养基：将中胚层基础培养基与2 µM CHIR99021、80 ng/mL 骨形态发生蛋白4（BMP4）和80 ng/mL 血管内皮生长因子（VEGF）混合。
   4. 第2天分化培养基：将造血前体基础培养基与1 µM SB431542、80 ng/mL VEGF和100 ng/mL 干细胞因子（SCF）混合。
   5. 配制不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）（见材料表）。
   6. 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液：将1 mL 0.5 M EDTA加入500 mL PBS中。
   7. EHT培养基：将造血基础培养基与50 ng/mL SCF、20 ng/mL 血小板生成素（TPO）、50 ng/mL Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt-3L）、20 ng/mL 白细胞介素-6/白细胞介素-6受体α（IL-6/IL-6Rα）、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺、L-谷氨酰胺以及青霉素/链霉素/两性霉素B混合。
   8. FACS缓冲液：将PBS与2%胎牛血清和1 mM EDTA混合。
   9. 配制磁珠分选缓冲液（见材料表）。
   10. 配制甲基纤维素基础培养基（见材料表）。

2. 多能干细胞集落形成

1. 将hPSCs在0.5 µg cm的培养皿中培养至70–80%汇合度^-2 在37 °C、5% CO₂培养箱中，将LM511-E8包被的6孔板置于mTeSR1培养基中₂.
2. PSC 解离（第 -4 天）
   1. 吸弃培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。用消化液冲洗细胞。37 °C 孵育 15 分钟（在此期间细胞不会干燥）。
   2. 将细胞悬浮于PSC维持培养基中，转移至适当大小的离心管，于200 x g条件下离心细胞 g 孵育3分钟。吸除上清液，将细胞重悬于PSC贴壁培养基中。
3. 以每平方厘米48,000 – 70,000个细胞的密度接种PSC悬液^-2 （根据细胞系的不同）接种至微加工塑料容器中，于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜₂.
   注意： 我们推荐每孔使用 100 μL^-1 在96孔微加工塑料容器中加入细胞悬液。通常每孔接种20,000个细胞^-1 在96孔板中培养，以获得约100个球状体。
4. PSC类球体的铺展 LM511-E8 （第 -3 天）
   1. 使用P1000移液器将PSC类球体轻轻转移至15 mL锥形管中，室温静置2 min，使其依靠重力沉降。吸除上清液。
   2. 在非包被的6孔培养板中，用类球体铺板培养基重悬，以每平方厘米4个类球体的密度接种悬浮液^-2 并在37 °C、5% CO₂培养箱中培养₂ 三天。

3. 造血诱导（第0天）

1. 吸去培养基，加入第0天分化培养基，并在37 °C、5% O₂ 和 5% CO₂ 的培养箱（低氧培养箱）中培养。
2. 在第0天分化培养基中培养两天后，吸去培养基，然后加入第2天分化培养基，并在低氧培养箱中继续培养。

4. 造血内皮细胞的分离（第4天）

1. 两天后，吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。用解离溶液冲洗细胞。在含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
2. 用 1 mM EDTA 轻柔重悬细胞，使其解离至单细胞水平，将细胞悬液转移至 50 mL 圆底离心管中，在 200 × g 条件下离心 3 分钟。吸除上清液，用 300 µL 磁性分离缓冲液重悬细胞沉淀。
3. 加入 100 µL CD34⁺ 磁珠，轻柔吹打混匀。室温孵育 30 分钟。每 100 μL CD34⁺ 磁珠最多可处理 2000 万个细胞。
4. 用 40 µm 细胞滤网过滤细胞悬液。
5. 使用磁性分离器分离 CD34⁺ 细胞。

5. 诱导内皮细胞向造血细胞转变（EHT）

1. 纤连蛋白包被
   1. 通过将1 mg/mL的纤连蛋白用PBS稀释，配制所需体积的5 µg/mL纤连蛋白包被溶液。
   2. 向24孔培养板的每孔中加入0.5 mL包被溶液，在室温下孵育30分钟。
2. 将分选后的CD34⁺细胞以200 x g离心3分钟，弃上清，用1 mL EHT培养基重悬细胞沉淀。
3. 使用细胞计数仪测定活细胞密度，并通过添加EHT培养基将细胞密度调整至200,000 cells mL^-1。
4. 吸除纤连蛋白包被孔中的包被溶液并弃去，向每个包被孔中加入0.5 mL CD34⁺细胞悬液。
5. 在低氧培养箱中孵育一周。

6. 造血细胞的流式细胞术分析

1. 悬浮细胞收集：将培养基转移至15 mL锥形管中，在200 × g 条件下离心3分钟，吸除上清液。
2. 贴壁细胞收集
   1. 用0.5 mL PBS洗涤细胞两次。
   2. 用解离液冲洗细胞，吸除多余液体。
   3. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育5分钟。
   4. 用1 mL FACS缓冲液重悬细胞。
3. 混合悬浮细胞与贴壁细胞。
4. 在200 × g 条件下离心细胞3分钟，吸除上清液，加入50 µL FACS缓冲液重悬细胞。在室温避光条件下，用抗CD34和抗CD45抗体孵育细胞1小时。
5. 用PBS洗涤细胞两次，200 × g 离心3分钟，吸除上清液后加入含0.5 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚的0.5 mL FACS缓冲液重悬细胞。
6. 通过流式细胞仪检测CD34和CD45的表达水平。

7. 造血细胞的菌落形成单位（CFU）检测

1. 造血细胞收集：将培养液转移至15 mL圆锥形离心管中。用PBS轻轻冲洗培养孔两次。
2. 以200 x g 离心3分钟。吸去上清液。用1 mL EHT培养基重悬细胞。使用细胞计数仪测定细胞数量。
3. 取相当于10,000个细胞的悬液体积，加入3 mL含抗生素的甲基纤维素培养基中，用16 G或18 G注射器充分吹打混匀5次。
4. 将全部甲基纤维素培养基悬液分装至6孔板的每个孔中。
5. 置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中孵育两周，保持湿润。切勿扰动培养皿，集落对运动敏感。
6. 两周后，在显微镜下计数集落。

结果

PSC 克隆形成的示意图见图1A。PSC 悬浮球体在微加工塑料培养容器中培养一天后形成。以典型结果为例，每96孔微加工塑料培养容器可处理20,000个409B2细胞，尽管其他细胞系可能需要更高的密度（每96孔微加工塑料培养容器30,000–40,000个细胞）。当将这些球体接种至含有LM511-E8的培养皿中时，它们会自发展平，形成接近二维的培养状态。

造血诱导的示意图见图1B。当PSC集落生长至直径750 µm时，通过依次更换培养基以诱导中胚层类器官。在向中胚层类器官分化过程中，随着培养基的逐步更换，PSC集落将逐渐形成类似“单面煎蛋”的结构，直至第4天。在第4天，通过磁珠分选从中胚层类器官中获得生血内皮细胞，并将其接种至含纤维连接蛋白的EHT培养基中。由含有100万个PSC的球状体中，预期可获得500万至1000万个CD34⁺CD45^-细胞（图1C）。

可以观察到，细胞在形态上从内皮细胞转变为造血细胞（补充视频 1）。在第7天使用造血诱导混合因子刺激后，典型的造血祖细胞相差显微图像如图2A所示。培养中出现了造血细胞集落。

代表性流式细胞术图谱见图2B。整个培养物用造血诱导 cocktail 刺激，在第7天通过流式细胞术分析CD34和CD45的表达情况。造血祖细胞表达CD34和CD45。

菌落形成单位（CFU）实验显示，CD34⁺ CD45⁺ 造血祖细胞能够生成粒细胞/巨噬细胞集落（图2C）。每10,000个细胞中估计可形成38个CFU-G/M集落（图2D）

图1：PSC集落的铺板及通过生血内皮细胞进行后续造血分化的示意图。（A）PSC集落形成的示意图。PSC在LM511-E8包被的6孔板中，使用PSC维持培养基进行培养。在第-4天，使用解离液将细胞解离成单细胞水平，随后接种至微加工塑料容器中，并在含有Y-27632的PSC维持培养基中培养过夜以形成球状体。在第-3天，将球状体转移至含有LM511-E8的PSC维持培养基中继续培养三天。到第0天时，球状体自发展平，形成近乎二维的培养状态。比例尺 = 200 µm。（B）在第0天，更换为第0天分化培养基，并在低氧培养箱中培养。在分化的第2天，更换为第2天分化培养基。在生血内皮富集的第4天，通过磁珠分选法分离CD34⁺细胞，并将其接种于纤维连接蛋白包被的12孔板中，在EHT培养基中培养6天。（C） 第4天经CD34分选后细胞的CD45和CD34表达的代表性流式细胞术图。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：造血特性的分析。（A）造血祖细胞在造血诱导混合物刺激第7天后的代表性相差显微图像。比例尺 = 200 µm。（B）造血祖细胞在造血诱导混合物刺激第7天后，全培养物中CD45和CD34表达的代表性流式细胞术图谱。（C）第11天造血祖细胞生成的粒细胞/巨噬细胞克隆的代表性相差显微图像。比例尺 = 500 µm。（D）每10,000个细胞的集落形成单位（CFU）数量。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：EHT 视频。 请单击此处下载此文件。

讨论

我们所采用的无饲养层且无异源成分的定义明确的诱导方法，提供了一个精确且经济高效的平台，可规模化地诱导生成造血内皮（HE）细胞。在传统方案中，由于无法精确控制多能干细胞（PSC）克隆的密度和大小，影响了基于形态发生素/细胞因子的定向分化效率，从而阻碍了功能完整的造血内皮的形成^{10,11,12,13,14}。我们曾发现，采用传统方案在不同批次间造血内皮诱导效果存在不一致现象。本新方案实现了对PSC克隆密度和大小的严格调控，从而克服了造血内皮诱导过程中的批次间不一致性问题。

我们利用了类球体的均一化形成，并在此基础上建立了一种无饲养层且无异源成分的明确培养条件，可在总共4天内高效生成定型内胚层（HE）。我们通过三个独立的细胞系验证了类球体的形成能够确保HE细胞的稳定生成。作为代表性结果，在三次独立实验中，409B2细胞系产生的CD34⁺细胞效率为12.7%–23.6%。实现PSC类球体形成的关键因子是LM511-E8。根据我们的经验，不建议使用其他基质（如Matrigel或全长层粘连蛋白产品）替代该成分。我们发现，中胚层类器官容易从Matrigel上脱落，并在分化过程中丢失；此外，无论是Matrigel还是全长层粘连蛋白，若未经预先包被，均无法有效锚定细胞。

本方案的潜在局限性在于，我们依赖PSC维持培养基来维持PSC的生长状态。我们已测试过其他培养基，例如StemFit，但发现其对造血诱导产生不利影响。推测原因可能是细胞在较短时间（4天）的诱导方案中难以从多能状态退出。如果研究者使用其他培养基维持PSC，我们建议在进行分化前，先将细胞适应性培养于PSC维持培养基中，并传代数次。该技术平台将有助于对细胞进行系统性操控与分析，并实现造血细胞的即用型生产与大规模诱导，具有潜在的临床应用价值。该系统的长期目标是，在人源化小鼠模型中模拟免疫缺陷疾病，以研究相关的细胞与分子机制，并开展药物筛选。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575	0.5 M EDTA
40 μm 细胞筛	Corning	352340	40μM 细胞筛
6 孔板	Corning	353046	6 孔板
抗生素-抗真菌剂	Thermo Fisher Scientific	15240-112	青霉素/链霉素/两性霉素 B
抗 CD34 抗体	Beckman Coulter	A07776	抗 CD34 抗体
抗 CD45 抗体	Biolegend	304012	抗 CD45 抗体
BMP4	R&D Systems	314-BP-010	BMP4
CD34 磁珠	Miltenyi	130-046-703	CD34 磁珠
CHIR99021	Wako	038-23101	CHIR99021
Essential 6	Thermo Fisher Scientific	A15165-01	造血基础培养基
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A15169-01	中胚层基础培养基
Ezsphere SP 微孔板 96 孔	AGC	4860-900SP	微加工塑料容器
FCS	Biosera	FB-1365/500	FCS
纤维连接蛋白	Millipore	FC010-100MG	纤维连接蛋白
Flt-3L	R&D Systems	308-FK-005	Flt-3L
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-谷氨酰胺
IL-6/IL-6Rα	R&D Systems	8954-SR	IL-6/IL-6Rα
iMatrix-511	Matrixome	892 001	LM511-E8
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056	胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺
MACS 缓冲液	Miltenyi	130-091-221	磁性分离缓冲液
Methocult 4435MethoCult™ H4435 富集培养基	STEMCELL TECHNOLOGIES	04435	甲基纤维素培养基
mTeSR1	STEMCELL TECHNOLOGIES	85850	多能干细胞维持培养基
PBS	nacalai tesque	14249-24	PBS
SB431542	Wako	031-24291	SB431542
SCF	R&D Systems	255-SC-010	SCF
Stemline II 造血干细胞扩增培养基	Sigma Aldrich	S0192-500ML	造血基础培养基
TPO	R&D Systems	288-TPN	TPO
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12604-021	解离溶液
VEGF	R&D Systems	293-VE-010	VEGF
Y-27632	Wako	253-00513	Y-27632