本文介绍了能够生长的基于多肽的小单层囊泡的制备方案。为促进 在体外 这些囊泡配备了转录-翻译系统和编码该肽的质粒，用于膜肽的合成。
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本文内容
摘要
摘要
生化反应的区室化是合成细胞的核心特征之一。为此，基于肽的反应区室可作为脂质体或脂肪酸囊泡的一种理想替代方案。肽可在囊泡外部或内部轻松表达，并简化膜前体的合成。本文提供了一种利用玻璃珠脱水-再水化法制备直径约200 nm的囊泡的方案，该囊泡基于两亲性弹性蛋白样多肽（ELP）。同时提供了通过逆向温度循环实现细菌中ELP表达与纯化的方案，以及将其与荧光染料进行共价功能化的方案。此外，本报告还描述了一种在ELP囊泡内转录RNA适配体dBroccoli的方案，作为生化反应的简化示例。最后，提供了一种可在囊泡内（in vesiculo）表达荧光蛋白和膜肽的方案，其中后者的合成可导致囊泡生长。
引言
合成生命细胞系统的研究通常从两个不同方向展开。在自上而下的方法中，细菌的基因组被逐步削减至其必需组分，最终形成最小细胞。而在自下而上的方法中，人工细胞则从分子组分或细胞亚系统从头组装，这些组分需要被功能整合为一个协调一致的类细胞系统。
在从头合成方法中，通常使用由磷脂或脂肪酸构成的膜来实现必要生化组分的区室化1,2,3,4。这是因为"现代"细胞膜主要由磷脂组成，而脂肪酸则被认为是前生命时期膜结构的合理候选物质5,6。为了形成新的膜或促进膜的生长，两亲性结构单元必须从外部提供7，或者理想情况下通过膜包被区室内部相应的合成代谢过程在内部生成4,8。
尽管脂质合成是一个相对复杂的代谢过程，但利用无细胞基因表达反应可以较为容易地合成多肽9
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方案
1. 弹性蛋白样多肽的表达
- 第1天：肽表达用起始培养物及试剂的准备
- 准备并高压灭菌表达培养瓶（4个2.5 L）和3 L LB培养基。每1 L LB培养基，将25 g LB粉末加入1 L超纯水中。
- 准备100 mL LB培养基，加入50 µL经0.22 µm滤器过滤除菌的氯霉素溶液（25 mg/mL，溶于乙醇）和50 µL经0.22 µm滤器过滤除菌的羧苄青霉素溶液（100 mg/mL，溶于50%乙醇和50%超纯水），配制起始培养液。
- 从含有目的菌株的预存细菌菌种中取少量划线接种 E. coli 表达多肽序列 MGHGVGVP((GEGVP) 的 pET20b(+) 表达载体转化的大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 菌株4(GVGVP)4((GFGVP)4(GVGVP)3(GFGVP)4将GWP（缩写为EF）加入预热的100 mL起始培养物中，在摇床培养箱中于37 °C、250 rpm条件下孵育16 h（E. coli 菌株和载体可应要求提供。
- 提前将表达培养瓶和LB培养基在37 °C预热过夜，以便为次日实验做好准备。
- 第2天：蛋白表达
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结果
囊泡制备
图1展示了使用不同溶胀溶液及玻璃珠法制备的囊泡的透射电子显微镜（TEM）图像（另见Vogele等人的研究11）。在图1A的样品中，仅使用PBS作为溶胀溶液，以验证囊泡的形成并测定其尺寸。当使用TX-TL作为溶胀溶液时（图1B），同样形成了囊泡。通过动态光散射（DLS）测量，验证了玻璃珠法对囊泡形成的影响。图2展示了在PBS中未使用玻璃珠制备的EF样品（蓝色）以及使用玻璃珠法并以PBS作为溶胀溶液制备的EF样品（红色）的实测强度自相关曲线。根据累积量拟合25计算出的尺寸显示，未使用玻璃珠法制备的囊泡直径为134 nm，多分散性为25%；而使用玻璃珠时，累积量拟合结果为直径168 nm，多分散性为21%。
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讨论
薄膜水化是制备小单层囊泡的常用方法。实验失败的主要原因是操作过程中对所用材料的处理不当。
最初，ELP 由大肠杆菌（E. coli）细胞表达产生。ELP 纯化后的得率在很大程度上取决于关键步骤中实验操作的严谨程度，这些关键步骤包括逆向温度循环（ITC）以及 ELP 沉淀后的重悬过程。在纯化过程中，我们通过添加磷酸诱导肽链发生疏水塌陷，使溶液 pH 变为酸性，从而导致亲水区段中谷氨酸侧链的质子化。经过此步骤后，在室温下两个区段均呈现疏水性。建议使用其盐形式已存在于溶液中的酸，以保持离子强度恒定，但也可使用盐酸等其他酸。为了提高 ELP 的产率，可额外添加盐以增强共凝聚过程，因为盐能够降低相变温度 Tt，使 ELP 更加疏水。通常使用氯化钠，但 kosmotropic 盐（如硫酸钠）效果更佳，且盐浓度可接近其溶解度极限。此外，使用水浴进行额外加热可进一步提高产率。
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们衷心感谢德国研究基金会（DFG TRR 235，生命起源项目P15）、欧洲研究理事会（资助协议号694410 AEDNA）以及慕尼黑工业大学国际科学与工程研究生院（IGSSE，项目号9.05）提供的经费支持。感谢E. Falgenhauer在样品制备方面的帮助。感谢A. Dupin和M. Schwarz-Schilling在TX-TL系统方面的协助以及有益的讨论。感谢N. B. Holland参与的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2xYT | MP生物医学 | 3012-032 | |
| 3-磷酸甘油酸（3-PGA） | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock Gel™ 管 | VWR | 733-2478 | |
| 碱性偶联Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| 碱性偶联Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| 苯甲脒（Benzamidin） | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli 菌株 | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA蛋白检测试剂盒 | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| 羧苄青霉素（Carbenicillin） | Carl Roth | 6344.2 | |
| 氯霉素（Chloramphenicol） | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| 氯霉素（Chloramphenicol） | Carl Roth | 3886.3 | |
| 氯仿（Chloroform） | Carl Roth | 4432.1 | |
| 辅酶A（CoA） | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| 乙醇（Ethanol） | Carl Roth | 9065.2 | |
| 亚叶酸（Folinic acid） | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| 玻璃珠，酸洗 | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG（β-异丙基硫代半乳糖苷） | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-谷氨酸盐（K-glutamate） | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB肉汤 | Carl Roth | X968.2 | |
| 溶菌酶（Lysozyme） | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 甲醇（Methanol） | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-谷氨酸盐（Mg-glutamate） | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| 微型Bio-Spin层析柱 | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-叠氮化物连接剂（y-叠氮丁酸羟基琥珀酰亚胺酯） | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH试纸 | Carl Roth | 549.2 | |
| 苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride） | Carl Roth | 6367.2 | |
| 磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline） | VWR | 76180-684 | |
| 磷酸（Phosphoric acid） | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| 聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine） | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| 磷酸氢二钾溶液（Potassium phosphate dibasic solution） | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| 磷酸二氢钾溶液（Potassium phosphate monobasic solution） | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol反应缓冲液 | NEB | B9012 | |
| 小鼠RNase抑制剂（RNase inhibitor murine） | NEB | M0314S | |
| RNaseZap擦拭纸 | ThermoFisher | AM9788 | |
| 核糖核苷三磷酸混合物（rNTP） | NEB | N0466S | |
| Roti-苯酚/氯仿/异戊醇混合液 | Carlroth | A156.1 | |
| RTS氨基酸样品试剂盒 | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer透析盒，10k MWCO（套装） | Thermo-Scientific | 66382 | |
| 氯化钠（Sodium chloride） | Carl Roth | 9265.1 | |
| 氢氧化钠（Sodium hydroxide） | Carl Roth | 8655.1 | |
| 亚精胺（Spermidine） | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| 无菌过滤（0.22 µm滤膜） | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 RNA聚合酶（T7 polymerase） | NEB | M0251S | |
| TBTA（三(苄基三唑基甲基)胺） | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐） | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris碱（Tris base） | Fischer | BP1521 | |
| tRNA（来自E. coli） | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
参考文献
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional ....
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