樽海鞘类动物，包括Dolioletta gegenbauri这一物种，是全球大陆架边缘富营养海域中具有重要生态意义的小型胶质海洋浮游动物。由于这类生物结构脆弱，难以在人工条件下培养，因而限制了对其开展深入研究。本研究描述了针对樽海鞘Dolioletta gegenbauri的采集、饲养和长期维持的培养方法。
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摘要
摘要
胶状浮游动物在海洋生态系统中发挥着至关重要的作用。然而，由于方法学上的挑战，特别是难以对其进行培养，导致其生理学、生长、繁殖力及营养相互作用的研究普遍困难。这一问题在樽海鞘类动物中尤为突出。 多列尔氏水母。D. gegenbauri 在全球范围内，常见于生产力较高的亚热带大陆架生态系统中，常以水华浓度出现，可消耗每日初级生产量的很大一部分。在本研究中，我们描述了收集、培养和维持 D. gegenbauri 旨在开展基于实验室的研究。 D. gegenbauri 以及其他樽海鞘物种可通过从漂流船只上斜向拖曳锥形202 µm孔径的浮游生物网捕获活体样本。当水温低于21 °C时，最可靠地建立培养体系，起始材料应为未成熟生殖体、成熟营养体以及大型 nurse 个体。培养物可置于圆形培养容器中，在缓慢旋转的浮游生物轮上维持，并以天然海水中的培养藻类作为食物，可连续维持多代。除了能够建立实验室培养体系外 D. gegenbauri我们证明了采集条件、藻类浓度、温度以及暴露于自然条件化海水等因素均对培养建立、生长、存活和繁殖至关重要 D. gegenbauri.
引言
浮游动物构成了海洋中最大的动物生物量，是海洋食物网的关键组成部分，并在海洋生物地球化学循环中发挥着重要作用1,2。尽管浮游动物包含极为多样的生物类群，但总体上可分为两类：胶质型和非胶质型，中间类型较少3,4。与非胶质型浮游动物相比，胶质型浮游动物因其复杂的生活史5，以及在采集和操作过程中其脆弱组织极易受损，因而特别难以研究。因此，胶质型浮游动物种类在实验室中培养极为困难，总体上比非胶质型种类研究得更少6。
在胶质浮游动物类群中，全球海洋中数量丰富且具有重要生态意义的一类是樽海鞘纲（Thaliaceans）。樽海鞘纲是一类远洋被囊动物，包括樽海鞘目（Salpida）、火体虫目（Pyrosomida）和纽鳃樽目（Doliolida）7。纽鳃樽目生物统称为纽鳃樽，是一类体型较小、呈桶状、自由游泳的远洋生物，可在亚热带海洋富营养的近岸水域中达到极高的丰度。纽鳃樽是所有浮游动物类群中丰度最高的类群之一4,8。作为滤食性生物，纽鳃樽通过产生滤水水流，并利用黏液网从水体中捕获食物颗粒9。在分类学上，纽鳃樽属于尾索动物门（Urochordata）10。作为脊索动物的祖先类群，樽海鞘纲不仅在海洋远洋生态系统中具有重要的生态地位，而且对于理解群体生活方式的起源10,11以及脊索动物的演化过程5,7,10,12,13,14具有重要意义。
樽海鞘类的生活史十分复杂，这增加了在其整个生命周期中进行培养和维持的难度。关于樽海鞘类生活史和解剖结构的综述可参见Godeaux等人15。樽海鞘类的生活史涉及有性与无性生活史阶段之间的必需交替，如图1所示。卵子和精子由雌雄同体的生殖体（gonozooids）产生，后者是生活史中唯一的独立生活阶段。生殖体将精子释放到水体中，而卵子在体内受精后被释放并发育为幼虫。幼虫孵化后经历变态发育成为初级个体（oozooids），其体长可达1–2 mm。在适宜的环境条件和营养供给下，初级个体在20 °C条件下1–2天内即可转变为早期护理个体（nurse），并由此启动生活史的群体阶段。初级个体通过无性方式在其腹侧匍匐茎上产生芽体。这些芽体脱离匍匐茎后迁移至背部的幼体柄（cadophore），并排列成三对行列。中间的两列发育为携带体（phorozooids），外侧的两列则发育为营养体（trophozooids）。后者为护理个体和携带体提供营养16,17。随着营养体不断为护理个体提供营养，护理个体自身的内部器官逐渐退化。随着营养体数量的增加，护理个体在实验室条件下体长可达到15 mm。随着携带体的生长，它们摄食浮游生物猎物的能力不断增强，并在释放为独立个体前生长至约1.5 mm大小17。单个护理个体在其生命周期中可释放>100个携带体18。携带体从幼体柄释放后继续生长，构成生活史中的第二个群体阶段。当其体长达到约5 mm时，每个携带体的腹侧柄上会发育出一群生殖体。这些生殖体在长度达到约1 mm时即可摄食颗粒物。当生殖体生长至约2–3 mm大小时，便会从携带体上释放，成为生活史中唯一的独立生活阶段。当生殖体体长达到约6 mm时，即发育为性成熟个体17。生殖体体长可达9 mm或更长。生殖体为雌雄同体，精子呈间歇性释放，而卵子在体内受精16,17。当生殖体体长≥6 mm时，可释放多达6个已受精的卵。成功的培养需要满足上述各个独特生活史阶段的特定需求。
由于包括樽海鞘在内的樽形动物在生态学和进化上具有重要意义，因此有必要发展其培养方法，以增进对这类生物独特生物学、生理学、生态学及进化历史的理解19。樽海鞘在发育生物学和功能基因组学中具有相当大的潜力，可作为实验模式生物，因其身体透明且可能具有简化的基因组20,21。然而，目前缺乏可靠的培养方法，限制了其作为实验室模式生物的应用。尽管少数实验室已发表基于人工培养樽海鞘的研究成果，但据我们所知，此前尚未有系统的培养方法和详细操作方案被公开。基于多年经验以及反复试验的培养尝试，本研究旨在总结相关经验，并分享樽海鞘——特别是物种 Dolioletta gegenbauri——的采集与培养方案。
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方案
1. 准备培养设施以饲养D. gegenbauri
注意：所需的所有材料和设备均列在材料表中。
- 配制 1 M 氢氧化钠 (NaOH) 和 0.06 M 高锰酸钾 (KMnO4) 溶液。配制方法：将 400 g NaOH 溶解于 10 L 去离子水中，再加入 100 g KMnO4，充分混匀。
- 通过将 100 g 亚硫酸氢钠 (NaHSO3) 溶解于 10 L 去离子水中，配制 0.1 M 亚硫酸氢钠 (NaHSO3) 溶液，并充分混匀。
警告：这些试剂具有刺激性，吸入后可能引起呼吸系统问题。操作时应置于通风良好的环境（如通风橱）中，避免皮肤接触。处理时需佩戴防护手套、防护服、护目镜和面部防护装备。 - 在实验室建立和培养樽海鞘类动物（doliolid）培养物之前，需对培养瓶进行清洗和灭菌。
- 用去离子水至少冲洗 1.9 L 和 3.8 L 的培养瓶 3 次。将螺旋盖取出晾干，因后续清洗步骤不包括瓶盖。
- 将 1.9 L 和 3.8 L 玻璃培养瓶浸入 NaOH/KMnO4 溶液中进行清洗和灭菌，浸泡过夜。
- 将培养瓶从 NaOH/KMnO4 溶液中取出后，浸入亚硫酸氢钠 (NaHSO3) 溶液中，继续浸泡过夜。
- 将培养瓶从 NaHSO3 溶液中取出，用去离子水彻底冲洗，并使其自然晾干。
- 将浮游生物转轮装置（图 2）放置于温度可控的空间（环境培养室）中，将温度平衡至 20 °C。有关定制浮游生物转轮的更详细描述，请参见 补充图 1。
2. 浮游植物培养
- 从海洋藻类与微生物保藏中心（NCMA）或其他来源获取藻类培养物，用作食物 D. gegenbauri两种鞭毛虫物种的混合物，包括 Isochrysis galbana （CCMP 1323）， Rhodomonas sp（CCMP 740）以及一种小型硅藻， Thalassiosira weissflogii （CCMP 1051）购自NCMA，此前已在实验室研究中成功用于培育樽海鞘。17.
- 制备 L1 和 L1-Si 生长培养基22 如NCMA所建议的。
- 按照供应商提供的说明启动新的藻类培养。
- 为维持储备培养物，采用严格的无菌培养技术，将0.5 mL陈旧衰老的培养物转移至25 mL新鲜培养基中 每两周更换一次无菌55 mL玻璃培养管。
注意：无法在不定期转接的情况下长期保存活体藻类培养物。若藻类培养物在较长时间内不会使用，且无法在停用期间维持培养，则建议从原始来源（如 NCMA）重新获取这些常见藻类培养物。 - 在洁净的500 mL塑料组织培养瓶中加入200 mL培养基，制备较大量用于喂养海樽的浮游植物。
- 从无菌藻种中接种4 mL至200 mL培养基中（1:50稀释）。
- 在20 °C条件下，于65–85 µE/m的冷白光照射下，以12小时光照:12小时黑暗的光周期进行培养2将培养瓶平放以最大化光照。每天轻轻摇晃培养物。
- 使用颗粒计数器或显微镜测定细胞浓度，以监测培养物的生长情况。
注意：接种后 7–10 天，鞭毛虫培养物中将含有约 105-106 细胞/mL，且硅藻培养物将含有约104-105 细胞/毫升。这些浓度足以维持樽海鞘类动物的培养。 - 每两周至少启动一次新的藻类培养物，以提供充足的藻类生物量来支持所有培养活动。
3. 采集野生樽海鞘及海水用于培养
注意：采集与培养方法的概述如下所述 图3. 本文提供了关于专用采集浮游生物网及网底管的描述 图4.
- 通过浮游生物网或原位成像系统检测樽海鞘23.
注意：由于樽海鞘很少出现在表层水域，且无法通过遥感技术检测到，因此需依据先验知识判断适合樽海鞘生存的环境条件（参见 讨论），在采样前必须确定樽海鞘的存在。 - 在采集活体海樽类动物以启动实验之前，先收集富含颗粒物的海水 D. gegenbauri 培养
- 使用安装在CTD采水器或同等设备上的Niskin采水瓶，从樽海鞘所在位置及其叶绿素浓度估计值最高的水层采集水样 a 通过原位荧光测定法估算的浓度。
注意：叶绿素 a 浓度被用作颗粒物浓度的指示指标。在南大西洋湾（SAB）大陆架中部的次表层叶绿素 a 最大值通常接近底部，但在其他位置可能并非如此。
- 使用安装在CTD采水器或同等设备上的Niskin采水瓶，从樽海鞘所在位置及其叶绿素浓度估计值最高的水层采集水样 a 通过原位荧光测定法估算的浓度。
- 一旦发现樽海鞘，使用专用的浮游生物网和网底管回收完好的樽海鞘个体。在布放网具前，先将网底管中注入海水。
- 从漂浮的船只上，以约15–25°的倾斜拖曳角度，将网具在水体剖面中下放和提升，垂直布放和回收速度不得超过15 m/min。
- 网具回收至船上后，轻柔地将网尾部分的样品转移并分装至3个5加仑（约20升）的塑料桶中，每个桶内预先加入约10升从采样现场采集的表层海水。
注意：用于采集活体樽海鞘的新塑料桶应在使用前数天加入海水进行预处理，目的是减少塑料中化学物质的析出。若无海水，可使用不含毒性污染物的纯化水（如 Milli Q 水）或自来水进行预处理。 - 从其他浮游生物中分离樽海鞘个体。
- 以小批量（约 2 L）将网具拖拽物中的混合浮游生物（现置于 20 L 塑料桶中）转移至 2 L 玻璃烧杯中。
- 使用宽口玻璃移液管（内径8 mm，长38 cm），小心虹吸正在活跃游动的樽海鞘营养体，从烧杯转移至洁净的玻璃培养罐中，培养罐内盛有使用Niskin采水器从樽海鞘所在水域采集的富含颗粒物的海水。
- 轻轻将樽海鞘群体的个员释放到海水表面以下。
注意：采集生殖体、带有附着发育中生殖体的游走体，以及带有附着营养体的护理体阶段图1).
- 加入樽海鞘后，添加 Rhodomonas sp. 培养物至终浓度约 ~ 5 x 103 – 104 细胞/mL（约50 mL培养液，含约5 × 10⁶）4 – 1 × 105 细胞/mL，置于3.8 L的容器中）。目的是判断樽海鞘是否正在进行主动摄食。当樽海鞘摄入 Rhodomonas sp.其消化道会呈现红色。移除未显示摄食迹象的个虫。
- 为防止樽海鞘被困在气液界面，应使用未过滤的富含颗粒物的海水完全充满培养罐，避免罐内留有顶空，并在罐口覆盖一块89 mm宽的塑料封口膜。
- 避免产生可能伤害动物的气泡。将瓶盖小心拧紧至容器上，然后轻轻倒置容器以检查是否存在气泡。若发现气泡，应将其去除。
- 罐子装满后，擦去罐子外表面多余的水分。
- 将每个罐子安装到浮游生物轮上（图2将罐子放置在覆盖有橡胶管的垂直金属杆上，并置于不锈钢软管夹之间。
- 确保罐子的背面紧贴橡胶管作为缓冲。通过调节螺丝拧紧环绕罐子的软管夹。
- 检查罐子牢固固定后是否不再移动。让罐子以0.3 rpm的速度旋转，以保持樽海鞘悬浮状态。
注意：切勿过度拧紧罐子，以免罐体破裂。
- 在船上，将培养容器置于浮游生物转轮上，在20 °C弱光条件下维持培养，直至可转移至实验室培养设施。
- 返回实验室后，将装有樽海鞘的容器转移至已准备好的培养设施中。将容器固定在浮游生物轮上（参见步骤3.8），并使其以0.3 rpm持续旋转。
注意：本研究中所有樽海鞘的培养均在 20 °C 下进行。
4. 维持 D. gegenbauri 培养物
- 从采样船到实验室，将动物保留在原始容器中，使其在实验室条件下适应3天。
- 在适应期间，每天使用宽口玻璃移液管更换10%的水，加入来自采集地点的未过滤、富含颗粒物的海水，持续3天。
- 在容器中保留若干桡足类动物，但移除所有其他浮游动物、大型粪粒以及可能堵塞樽海鞘滤食结构（黏液网）的大型聚集体。若培养物为早期 nurse 阶段个体，则在容器中保留一个大型 gonozooid （≥ 6 mm）。
注：培养物中包含的桡足类物种种类并不重要，但在本实验中，使用了与樽海鞘共同捕获时最丰富的物种。
- 适应期结束后，将樽海鞘个体和桡足类从原始容器转移至洁净的培养容器中，新容器内含80%经玻璃纤维滤膜（GF/F）过滤的海水和20%原始容器中的海水。制备过滤海水时，使用标称孔径为0.7 µm的GF/F滤膜对海水进行过滤。
- 每隔3天更换10%的GF/F过滤海水，并清除聚集体和粪粒，以维持新培养体系。每周按照步骤4.2所述方法将动物转移至新的容器中。
- 通过维持培养容器中浮游植物浓度在40 – 95 µg C/L之间来喂养樽海鞘。
注：该浓度范围模拟了已知可支持 D. gegenbauri17 种群暴发的环境条件。藻类混合物的组成根据生命阶段及每容器中个体数量而变化。在早期生命阶段，仅添加等碳含量（1:1）的隐鞭藻类（Isochrysis galbana 和 Rhodomonas sp.）。较大的饵料物种容易堵塞小型 nurse 和发育中 trophozooid 的摄食结构。当喂养较大 nurse、phorozooid 和 gonozooid 时，将硅藻 Thalassiosira weissflogii 以等碳含量加入藻类混合物中。- 在喂食前后监测藻类浓度，以指导添加藻类的频率和数量。应使用颗粒计数器测定藻类浓度，因为培养容器中的藻类浓度相对较低。
- 移除足够数量的个体，以维持藻类浓度在40 – 95 µg C/L之间，确保剩余樽海鞘有充足食物生长。
注：在实验室条件下最难成功维持的生命阶段是发育中的幼体和 oozooid（早期 nurse）。在此培养阶段，除若干桡足类外，还需在含有发育中幼体和 oozooid（约每3.8 L容器20个）的容器中保留一个大型 gonozooid（≥ 6 mm）。 - 当 nurse 个体的茎部（cadophore）上可见至少8个 trophozooid 时，应将至少4个 nurse 转移至新的培养容器中（图1B）。
注：在20 °C条件下，trophozooid 数量每1–2天翻倍。trophozooid 体积足够大，肉眼可见。- 当 nurse 发育出20个 trophozooid 时，移除其中两个 nurse。
- 当 nurse 的茎部上发育出>30个 trophozooid 时，移除一个 nurse，保留剩余的一个 nurse 以继续在其茎部发育 phorozooid。
- 当 nurse 释放出最多30个 phorozooid 后，将其移除。
- 当 phorozooid 长至3 mm时，开始减少容器中个体数量。
- 当 phorozooid 长大（>5 mm）并发育出 gonozooid 簇时，仅保留四个 phorozooid，其余移除。
- 当 gonozooid 簇数量增多且开始摄食时，将培养体系缩减至两个 phorozooid。
- 当 phorozooid 释放出最多30个 gonozooid 后，将其移除。
- 将每个容器中的 gonozooid 数量从30个减少至2个。允许受精卵释放到容器中。
- 当 oozooid 发育后，移除一个 gonozooid，仅在容器中保留单个 gonozooid。
注：废弃的 nurse、phorozooid 和 gonozooid 可用于建立额外的培养体系或开展进一步实验。
- 当 oozooid 发育后，移除一个 gonozooid，仅在容器中保留单个 gonozooid。
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结果
按照图3中所述的程序采集和培养樽海鞘D. gegenbauri，即可在整个复杂的生命周期中维持D. gegenbauri的培养（图1），并使其持续繁殖多代。尽管本文描述的是D. gegenbauri的培养方法，但这些操作步骤也适用于其他樽海鞘物种的培养。
采集健康且无损伤的樽海鞘个体需要使用专门的网具和拖曳方法（图4）。由于这类生物体结构脆弱，无任何坚硬组织，因此应尽量避免可能导致其物理损伤的操作。可能造成损伤的因素包括湍流、压力以及与网具、空气和气泡等表面的接触。然而，尽管其结构脆弱，仍可使用锥形浮游生物网成功采集无损伤的樽海鞘个体，该网具的开口直径与长度之比为1:5，并配备相对较大的带重物的非过滤性网底。常规操作中，我们使用的是202 µm网孔、2.5 m（长度）的浮游生物网，其开口直径为0.5 m，安装在旋转吊架上，并配备4 L带重物的非过滤性网...
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讨论
过去几十年中，樽海鞘类动物的培养技术已逐步建立，并被用于支持多个研究领域的科研工作。我们实验室开展的实验研究已支持发表了至少15项科学成果，研究内容涵盖樽海鞘的摄食与生长18,26、繁殖18,28、食性6,29、生理学30、生态学31以及生态模型构建27等方面。
尽管目前培养这些脆弱动物的过程仍然费力且耗时，但樽海鞘的养殖是可行的；若能得到更广泛科研群体的参与，将有助于推动对这一在生态学和进化上具有重要意义的动物类群的深入理解。本研究的目的是描述当前用于采集、饲养和维持D. gegen...
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致谢
我们感谢多年来为本项目贡献了大量知识的众多人士，包括最初开发这些方案的 G.-A. Paffenhöfer 和 D. Deibel。M. Köster 和 L. Lamboley 也对这些实验程序的完善做出了重要贡献。 N.B. López-Figueroa 和 Á.E. Rodríguez-Santiago 提供了表1中的樽海鞘丰度估算数据。本研究部分得到了美国国家科学基金会项目 OCE 082599 和 1031263（授予 MEF）、合作项目 OCE 1459293 和 OCE 14595010（分别授予 MEF 和 DMG），以及美国国家海洋和大气管理局项目 NA16SEC4810007（授予 DMG）的资助。我们感谢 R/V Savannah 号科考船勤奋且专业的船员团队。Lee Ann DeLeo 负责绘制插图，Charles Y. Robertson 对稿件进行了校对，James（Jimmy）Williams 制作了浮游生物轮装置。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 藻类培养管（55 mL 无菌一次性玻璃培养管） | 任何 | NA | 用于藻类培养 |
| 高压灭菌 | 任何 | NA | 用于藻类培养中设备和海水的灭菌 |
| 烧杯（2 L 玻璃） | 任何 | NA | 用于分选稀释的浮游生物网拖样品内容物 |
| 桶（5加仑，约20L） | 任何 | NA | 用于稀释浮游生物网收集物的内容物——首次使用前应将海水进行预处理 |
| 大容量试剂瓶（20 L） | 任何 | NA | 用于储存海水 |
| 樽形海樽玻璃培养罐（1.9 L 窄口玻璃罐，带盖） | Qorpak | GLC-01882 | 培养容器 |
| 樽形海樽玻璃培养罐（3.8 L 窄口玻璃罐，带盖） | Qorpak | GLC-01858 | 培养容器 |
| 环境舱（温度控制环境舱） | 任何 | NA | 为容纳浮游生物轮和培养物的维护 |
| 用于47 mm滤膜的过滤装置 | 任何 | NA | 用于过滤海水以进行培养 |
| 玻璃微纤维滤膜，47 mm | Whatman | 1825-047 | 用于过滤海水以进行培养 |
| 玻璃移液管（硼硅酸盐玻璃管，外径10 mm，内径8 mm，壁厚1 mm） | 科学公司 | NC-10894 | 定制切割并抛光边缘 |
| 不锈钢管夹，#104（178 mm） | 任何 | NA | 用于将培养罐固定在浮游生物轮上 |
| Isochrysis galbana CCMP1323 菌株 | 国家海洋藻类与微生物保藏中心（NCMA） | CCMP1323 菌株 | 用于樽海鞘培养物的喂养 |
| L1 培养基套装，50 升 | 国家海洋藻类与微生物保藏中心（NCMA） | MKL150L | 用于培养藻类 |
| 台灯（带可调节灯臂的荧光台灯） | 任何 | NA | 用于照亮烧杯和烧瓶中的樽海鞘 |
| 带照明温控培养箱 | 任何 | NA | 用于藻类培养 |
| 微量移液器和无菌吸头（0-20） µl，20-200 µ升，200-1000 µl) | 任何 | NA | 用于藻类培养 |
| 浮游生物网（202 µm 0.5 m，5:1 长度）带尾端环的 4 L 水族箱网尾 | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | 用于收集活的樽海鞘（见图4） |
| 浮游生物轮 | NA | NA | 定制构建（见图2） |
| 塑料封口膜 | 任何 | NA | 用于覆盖樽海鞘培养罐盖内侧 |
| 高锰酸钾 | Fisher Scientific | P279-500 | 用于清洗罐子和玻璃器皿的试剂 |
| Rhodomonas sp. 菌株 CCMP740 | 国家海洋藻类与微生物保藏中心（NCMA） | CCMP740 菌株 | 用于樽海鞘培养物的喂养 |
| 橡胶管 | NA | NA | 用于将培养罐固定在浮游生物轮上（可使用Tygon软管制作） |
| 亚硫酸氢钠 | Fisher Scientific | S654-500 | 清洗罐子和玻璃器皿的试剂 |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | BP359-212 | 用于清洗罐子和玻璃器皿的试剂 |
| 无菌刻度吸管（1 mL，5 mL，10 mL，25 mL） | 任何 | NA | 用于藻类培养 |
| Thalassiosira weissflogii CCMP1051 菌株 | 国家海洋藻类与微生物保藏中心（NCMA） | CCMP1051 菌株 | 用于樽海鞘培养物的喂养 |
| 组织培养瓶（250 mL） | 任何 | NA | 用于藻类培养 |
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