本文介绍了一种对脐带血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞进行免疫表型鉴定以及细胞因子诱导其向四种髓系谱系分化的实验方案。该方案可用于研究髓系疾病相关突变或小分子化合物对CD34+细胞髓系分化的影响。
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本文内容
摘要
摘要
人造血干细胞的离体分化是研究造血过程的常用模型。本文所述方案旨在通过细胞因子诱导，将CD34+造血干/祖细胞分化为四种髓系谱系细胞。CD34+细胞来源于人脐带血，与MS-5基质细胞共培养，并在细胞因子存在条件下进行诱导。文中描述了干细胞、祖细胞以及分化后髓系细胞的免疫表型鉴定方法。利用该方案，可将CD34+细胞与小分子化合物共同孵育，或通过慢病毒转导以表达髓系疾病相关突变，从而研究这些突变对髓系分化的影响。
引言
造血干细胞（HSCs）的正常分化对于维持所有血细胞谱系的生理水平至关重要。在分化过程中，HSCs会协调响应包括生长因子和细胞因子在内的细胞外信号，首先产生具有淋系-髓系潜能的多能祖细胞（MPP）1,2,3,4（图1）。MPP进一步分化为谱系受限的共同髓系祖细胞（CMPs）和共同淋系祖细胞（CLPs）。CLPs分化为包括B细胞、T细胞和自然杀伤细胞在内的淋系细胞。CMPs则通过两种更特化的祖细胞群体——巨核细胞-红系祖细胞（MEPs）和粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）——生成髓系细胞。MEPs产生巨核细胞和红细胞，而GMPs产生粒细胞和单核细胞。除了通过CMPs产生外，已有研究报道巨核细胞还可通过非经典途径直接由HSCs或早期MPPs产生5,6。
造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的特征是表达表面标志物 CD34，且不表达谱系特异性标志物（Lin-）。其他常用于区分造血干细胞（HSCs）和髓系祖细胞群体的表面标志物包括 CD38....
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方案
用于实验的人类脐带血由健康个体在知情同意后捐赠给凤凰城的马里科帕综合健康系统（Maricopa Integrated Health Systems, MIHS）。这些去标识化的样本单元通过MIHS与亚利桑那大学之间的材料转移协议获得。
1. 试剂与缓冲液
注意：所有试剂和缓冲液均须在生物安全柜内无菌条件下配制。
- 通过将7.2 mL无菌35%牛血清白蛋白（BSA；使用无菌组织培养级35% BSA）和5 mL无菌0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）加入487.8 mL无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，制备无菌PBS-BSA-EDTA（PBE）缓冲液。在生物安全柜中将滤器连接至真空泵，至少抽气2小时以实现过滤除菌和脱气。将脱气后的缓冲液分装成较小体积（250 mL），并于4 °C保存。
- 制备1x汉克斯平衡盐溶液（1x HBSS）。将100 mL 10x HBSS储备液加入900 mL无菌蒸馏水中，配制成1 L的1x HBSS，并调节pH至7.2。使用前经滤膜除菌。
- 通过将2 mL冰醋酸加入98 mL蒸馏水中，制备2%乙酸溶液。
- 在1x PBS中配制20 ng/mL重组人纤维连接蛋白片段溶液。每块48孔板制备10 mL。
- 制备2% BSA溶液。向100 mL 1x PBS中加入2克BSA第五组....
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结果
采用上述方案可从约 100 mL 的脐带血单位中获得 5.6 (± 0.5) × 108 个单个核细胞（MNCs）和 1 (± 0.3) × 106 个 CD34+ 细胞。总 CD34+ 细胞的比例在 80–90% 之间（图 2A,B）。根据 Manz 等人5 描述的免疫表型分析方案显示，CD34+ 细胞通常包含约 20% 的造血干细胞（HSCs）和约 72% 的多能祖细胞（MPPs），其表型分别为 Lin-/CD34+/CD38- 和 Lin-/CD34+/CD38+（图 1 和 图 2A）。在 MPP 群.......
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讨论
本文所述方案适用于将脐带血来源的CD34+造血干细胞/祖细胞（HSPCs）在体外分化为四种髓系细胞谱系。首先使用包含SCF、TPO、Flt3L和IL3的细胞因子混合物进行初始培养，以激活CD34+细胞。随后，通过添加含有SCF、IL3、Flt3L、EPO和TPO的混合因子诱导其分化。在此混合体系中，SCF、IL3和Flt3L对CD34+造血干细胞的存活与增殖至关重要；EPO和TPO分别促进向红细胞和巨核细胞的分化，而IL3则促进早期粒细胞-单核细胞前体及成熟细胞的分化13,17,18。该方法的一个局限性在于分化细胞比例存在观察到的变异，这可能是由于来自不同供体的CD34+ HSPCs在生成特定谱系细胞能力方面存在差异所致。
MS-5 细胞层对于 CD34+ HSPC 的高效分化至关重要。根.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Maricopa 综合卫生系统（Maricopa Integrated Health Systems）的 Wendy Barrett、Rachel Caballero 和 Gabriella Ruiz 提供去标识化并捐赠的脐带血样本，感谢 Mrinalini Kala 在流式细胞术方面的协助，以及感谢 Gay Crooks 和 Christopher Seet 在体外髓系分化方面的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，资助号：R21CA170786 和 R01GM127464）和美国癌症协会（American Cancer Society，机构研究资助号：74-001-34-IRG）对 S.S. 的经费支持。本内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 台盼蓝溶液 | 赛默飞世尔科技 | 15250-061 | 将工作液用无菌1×PBS稀释至0.2% |
| 0.5 M UltraPure 乙二胺四乙酸，pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10倍浓度Hanks平衡盐溶液（HBSS） | Invitrogen | 14185052 | 用无菌蒸馏水稀释至1倍浓度 &且将pH调至7.2 |
| 2.5% 胰蛋白酶，无酚红 | 赛默飞世尔科技 | 15090046 | 用无菌的1x PBS将工作液稀释至1x |
| 30 µm 预分离滤器 | 美天旎生物技术 | 130-041-407 | |
| 35% 无菌牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | 用作活/死细胞染色，以在FACS分析中排除死细胞 |
| 抗人CD10-FITC抗体（克隆HI10a） | Biolegend | 312207 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人CD11b-FITC（活化）抗体（克隆CBRM1/5） | Biolegend | 301403 | 使用1:5稀释度 |
| 抗人 CD123-APC 抗体（克隆 6H6） | Biolegend | 306012 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人 CD14-PE 抗体（克隆 M5E2） | Biolegend | 301806 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人CD19-FITC抗体（克隆4G7） | BD 生物科学 | 347543 | 使用1:5稀释度 |
| 抗人CD235a-APC抗体（克隆GA-R2（HIR2）） | BD 生物科学 | 551336 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人CD235a-FITC抗体（克隆HIR2） | Biolegend | 306609 | 使用1:50稀释度 |
| 抗人CD34-APC-Cy7抗体（克隆581） | Biolegend | 343514 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人CD38-PE抗体（克隆HIT2） | Biolegend | 303506 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人CD3-FITC抗体（克隆UCHT1） | Biolegend | 300405 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人CD41a-PerCP-Cy5.5抗体（克隆号HIP8） | Biolegend | 303720 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人 CD45Ra-PE-Cy7 抗体（克隆株 HI100） | Biolegend | 304126 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人 CD66b-PE-Cy7 抗体（克隆 G10F5） | Biolegend | 305116 | 使用1:20稀释度 |
| 抗人CD7-FITC抗体（克隆CD7-6B7） | Biolegend | 343103 | 使用1:20稀释度 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Fisher Scientific | BP231-100 | 使用前过滤除菌 |
| 杜尔贝科’含L-谷氨酰胺的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）粉末 | Gibco | 12100046 | 将1袋溶解，配制成1 L的DMEM培养基 碳酸氢钠，10% 胎牛血清 & 1% 青霉素 & 链霉素 |
| 胎牛血清，澳洲来源，经热灭活 | Omega Scientific | FB-22 批号 #609716 | |
| 人CD34微珠试剂盒 | 美天旎生物技术 | 130-046-702 | |
| 人血小板生成素（TPO），研究级 | 美天旎生物技术 | 130-094-011 | 制备100的储备液 µg/mL，溶于1×PBS + 0.1% BSA中。髓系分化时使用浓度为50 ng/mL。 &刺激培养基 |
| L-谷氨酰胺 | Omega Scientific | GS-60 | 刺激培养基中的2 mM浓度 |
| LS 柱 | 美天旎生物技术 | 130-042-401 | |
| MACS 多功能支架 | 美天旎生物技术 | 130-042-303 | |
| MidiMACS 磁力分离器 | 美天旎生物技术 | 130-042-302 | |
| 单个核细胞分层液（Ficol-Paque PLUS） | GE Healthcare 生物科学 | 17-1440-03 | |
| MS-5 细胞 | 加州大学洛杉矶分校 Gay Crooks 实验室惠赠 | ||
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 在化学通风橱中，将800 mL 1x PBS加入玻璃烧杯，置于搅拌器上加热至约65 ℃ °C. 加入10 g多聚甲醛粉末。为完全溶解多聚甲醛，逐滴加入1 N NaOH以提高pH值。冷却后过滤溶液，并用1x PBS定容至1 L。调节pH至7.2。 |
| 青霉素 && 链霉素 | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P2636 | 在1×PBS中配制10 mg/mL的储存液 |
| 重组人促红细胞生成素-α（rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | 在1× PBS + 0.1% BSA中配制2,000单位/mL的储存液。髓系分化使用浓度为4单位/mL。 |
| 重组人纤连蛋白片段（RetroNectin） | Takara | T100B | 使用20 µg/mL，用无菌1×PBS稀释，用于刺激CD34前包被孔板+ HSCs |
| 重组人 Flt-3 配体（rHu Flt-3L） | BioBasic | RC214-16 | 制备100的储备液 µg/mL，溶于1× PBS + 0.1% BSA。髓系分化使用5 ng/mL。 & 50 ng/mL 刺激培养基中 |
| 重组人白细胞介素-3（rHu IL-3） | BioBasic | RC212-14 | 配制100的储备液 µg/mL，溶于1× PBS + 0.1% BSA。髓系分化使用5 ng/mL & 20 ng/mL 刺激培养基中 |
| 重组人干细胞因子（rHu SCF） | BioBasic | RC213-12 | 制备100的储备液 µg/mL，溶于1× PBS + 0.1% BSA。髓系分化使用5 ng/mL &以及刺激培养基中的50 ng/mL |
| 无血清培养基（X-Vivo-15） | Lonza | 04-418Q | |
| 碳酸氢钠 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| 改良的瑞氏-吉姆萨染色 | Sigma-Aldrich | WG16-500 | 按照制造商说明使用 |
| <强>仪器设备 | |||
| BD LSR II 流式细胞仪 | BD 生物科学 | ||
| 离心 | Sorvall Legend RT | ||
| 光学显微镜 | Olympus |
参考文献
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L.
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