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方法文章

利用电梯垂直运动和摩天轮旋转评估大鼠被动运动的自主神经与行为效应

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DOI：

10.3791/59837

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2020年2月7日

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1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, University of Sydney, 2Department of Physics, City University of Hong Kong, 3Department of Nautical Injury Prevention, Faculty of Navy Medicine, Second Military Medical University, 4State Key Laboratory of Marine Pollution (SKLMP), City University of Hong Kong, 5Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine and Life Sciences, City University of Hong Kong, 6Department of Materials Science and Engineering, City University of Hong Kong

本文内容

摘要

本文介绍了利用升降机垂直运动和摩天轮旋转来评估被动运动对啮齿类动物自主神经功能和行为影响的实验方案。

摘要

本研究的总体目标是利用升降式垂直运动装置和摩天轮旋转装置，评估被动运动对啮齿类动物自主神经功能及行为的影响。这些检测方法有助于确认自主神经系统的完整性和正常功能，其评估指标包括排便计数、旷场实验和平衡木穿越等定量行为测量。这些检测方法的优点在于操作简单、可重复性强，并能提供定量的行为学数据。其局限性在于，所观察到的自主神经反应可能是非前庭系统疾病引起的继发现象，且要求动物具备正常功能的前庭系统。这些检测方法的详细操作流程将为晕动病等疾病的机制研究提供重要帮助。

引言

由于异常的视觉-前庭刺激导致的运动病（MS）会引发自主神经反应，产生上腹部不适、恶心和/或呕吐等症状1。根据当前理论，运动病可能由感觉冲突或神经元不匹配引起，即接收到的整合运动信息与环境中预期的内部模型不一致2,3，也可能由于姿势不稳定所致，例如在偏航摇晃的船上所发生的情况4,5。尽管在运动病及前庭自主神经功能研究领域已取得显著进展6,7,8,9,10,11,12，未来的研究仍可得益于标准化评估方案的建立。评估标准被动运动对自主神经的影响，将极大促进对运动病病因及预防机制的探究。本研究的总体目标是评估被动运动对啮齿类动物自主神经功能及行为的影响。动物模型（如啮齿类动物）便于进行实验操作（例如被动运动和药物干预）以及行为学评估，可用于研究运动病的发病机制。本文介绍了一套详细的测试方案，用于检测被动运动的影响以及前庭功能的完整性。

本研究详细描述了两种可诱导被动运动下自主神经反应的实验方法：电梯式垂直运动（EVM）和摩天轮式旋转（FWR）。这些实验方法结合了三种定量行为学检测指标：平衡木实验（已在小鼠13和大鼠14,15,16,17中应用）、旷场实验以及排便计数。EVM（类似于船舶遭遇波浪时的俯仰和横滚运动）通过刺激编码线性加速度的耳石感觉器官来评估前庭功能（即对垂直平面运动产生反应的球囊）18。FWR（离心旋转或正弦运动）装置则通过线性加速度刺激耳石器官，并通过角加速度刺激半规管19,20。该摩天轮/离心旋转装置在自主神经功能评估方面具有独特性。迄今为止，文献中唯一类似的设备是离轴旋转（OVAR）转台，其主要用于研究前庭-眼反射（VOR）18,21,22、条件性回避反应23,24以及超重状态的影响25,26,27。EVM实验和FWR装置实验均可诱发前庭刺激，从而引起自主神经反应。我们将EVM和FWR与平衡木测试、排便计数和旷场分析等定量测量方法相结合28,29,30，以确保结果的稳健性和可重复性。与先前在小鼠13和大鼠14,15,16,17中描述的方法类似，平衡木实验采用一根长1.0 m的横梁，两端固定于两个木制凳子之间，离地高度为0.75 m，并在目标端（终点）进行简单的黑箱改装。平衡木实验已被用于评估焦虑（通过设置不透明黑箱）14,17、创伤性损伤15,16,17，以及本研究中影响平衡的自主神经反应。我们此前已在运动病模型中采用排便计数来评估自主神经反应，该方法是一种可靠且易于操作、结果明确的定量检测手段6,8,9,11。旷场分析采用一个简单的黑色敞箱环境，结合Ethovision28、Bonsai30或Matlab中的简易视频分析软件29，对运动等行为进行量化。在本实验方案中，我们使用总移动距离作为指标，但需指出尚存在多种其他分析范式（例如伸长效应、活动区域、速度等）28,29,30。总体而言，这些方法构成了一套简短的行为检测组合，可用于检查和评估被动运动引起的自主神经反应，例如在运动病研究中的应用6,7,8,9,10,11。当前的实验方法可适用于多种动物模型。

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方案

本研究及实验程序已获得第二军医大学（中国上海）动物实验伦理委员会批准，符合《实验动物护理和使用指南》（美国国家研究委员会，1996年）的规定。

1. 动物

  1. 使用两个月大（200–250 g）的Sprague-Dawley（SD）大鼠。每次行为学检测均需使用独立的大鼠组别。对照组与实验组始终应分开使用。
    注：本研究包含两项自主神经功能检测：EVM 和 FWR。EVM 包含对照组在内的四个组别（= 4），每个组别进行三项行为学检测（平衡木、排便计数和旷场实验 = 3），每组8只大鼠，共计96只大鼠（4 × 3 × 8）。FWR 包含对照组在内共两个组别（= 2），每个组别进行三项行为学检测（平衡木、排便计数和旷场实验 = 3），每组8只大鼠，共计48只大鼠（2 × 3 × 8）。总计报告使用144只大鼠。
  2. 将啮齿类动物饲养于恒定25 °C温度、60%–70%湿度的环境中。
  3. 将啮齿类动物置于12 h光照/12 h黑暗的循环条件下，并可自由获取食物和饮水。
    注：由于以下实验均为行为学实验，操作大鼠时应轻柔。应以双手抓握，支撑其身体和后肢，避免引发焦虑。
  4. 在黑暗环境中进行实验（EVM 和 FWR）及评估检测（平衡木和旷场实验评估），以尽量减少视觉线索的干扰。

2. 电梯垂直运动装置

  1. 在完全黑暗的环境中进行升降机垂直运动操作，以尽量减少视觉提示。
  2. 将啮齿类动物放入聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）盒中（22.5 cm × 26 cm × 20 cm）。该聚甲基丙烯酸甲酯盒可容纳四只啮齿类动物（定制装置）。
  3. 确保盒子已牢固关闭，防止动物掉落。将聚甲基丙烯酸甲酯盒放置在升降机垂直运动装置的升降平台垫上（定制装置）。
  4. 启动升降机垂直运动装置，并调至最低设置以进行适应性训练。
  5. 设定振幅为从中性位置向上22 cm、向下22 cm。按以下方式逐步调整升降机垂直运动参数：
    1. 初始周期设定为：2500 ms 持续5分钟，2000 ms 持续5分钟，1500 ms 持续5分钟。
    2. 测试周期使用1000 ms，持续2小时。
    3. 反向逐步减慢设备，依次使用1500 ms 持续5分钟、2000 ms 持续5分钟、2500 ms 持续5分钟。

3. 摩天轮旋转装置

  1. 摩天轮旋转装置设置
    1. 将有机玻璃容器（22.5 cm × 26 cm × 20 cm）放置在木制工作台（定制装置）上。
    2. 将啮齿类动物放入有机玻璃容器中，使其身体长轴与摩天轮的水平旋转杆垂直（定制装置）。
      注：将身体长轴垂直于水平杆放置，可确保在旋转过程中刺激耳石器官（前后方向和垂直方向）。
    3. 牢固关闭有机玻璃箱。
    4. 将另一组啮齿类动物放置在摩天轮旋转装置第二臂的有机玻璃容器中，其身体长轴同样垂直于水平旋转杆。使用质量相近的另一组啮齿类动物以平衡摩天轮。
    5. 牢固关闭有机玻璃箱，并将其安装到摩天轮旋转装置上。
  2. 摩天轮旋转操作流程
    1. 在完全黑暗的环境中进行摩天轮旋转操作，以尽量减少视觉线索的干扰。
    2. 启动摩天轮，以16°/s2的加速度顺时针旋转，直至角速度达到120°/s，随后以48°/s2的减速度减速至0°/s。暂停1秒后，容器以相同方式逆时针继续旋转（以16°/s2加速度达到120°/s角速度，再以48°/s2减速度减速至0°/s）。顺时针—暂停—逆时针循环约需10秒回到初始位置。
    3. 每次实验持续进行顺时针—逆时针旋转2小时，共计约720次旋转。

4. EVM 和 FWR 的评估

注意：摩天轮旋转装置和电梯垂直运动的评估通过以下三个步骤进行：平衡木测试、排便计数和开放旷场实验。评估电梯垂直运动时采用相同的步骤。这些评估步骤应在摩天轮旋转或电梯垂直运动结束后尽快进行。

  1. 平衡木实验
    1. 平衡木装置设置
      1. 在实验区域内放置两张木凳（高度约为 0.75 m），间距约 110 cm，以搭建平衡木装置10,11,12。
      2. 在终点木凳上放置一个黑色塑料盒（15 cm × 15 cm × 8 cm）。
      3. 将一根窄木条（2.5 cm × 130 cm）架在两张木凳之间，使凳边之间的距离为 100 cm，从起点凳延伸至终点凳。
        注：黑色塑料盒的入口应位于 100 cm 距离的终点线上。
      4. 在起点木凳处放置一盏灯，并打开光源。
      5. 关闭室内灯光，确保房间尽可能黑暗。这可促使啮齿类动物从明亮区域沿平衡木向阴暗区域移动。
    2. 平衡木实验步骤
      注：通过测量动物穿越架高木条所需时间，评估其运动协调能力。
      1. 在正式检测前，连续 3 天每天对每只啮齿类动物进行训练，以使其在平衡木上的表现趋于稳定10。训练时将大鼠置于光源处的角落，引导其穿越木条，最终大鼠会自主完成穿越。本实验方案中大鼠的平均穿越时间为 3.6 ± 0.9 秒。
        注：部分啮齿类动物在训练期间无法达到稳定表现，应予以剔除。有些动物不执行任务，或缺乏穿越木条的动机。稳定表现定义为连续两次测试的穿越时间均少于 4 秒。若大鼠在训练或评估过程中掉落，应记录为“跌落”，并停止进一步测试。
      2. 正式实验时，将训练好的动物置于靠近光源的起点木凳上，同时启动秒表。动物应迅速穿越平衡木并进入终点木凳上的黑色盒子中。
      3. 当动物就位后启动秒表，当其鼻尖进入终点木凳的暗盒时停止计时。穿越时间指从起点木凳到终点木凳的总耗时。
        注：动物完成训练后，可在评估前实施干预或处理（如诱发运动病）。也可利用最后一次训练的穿越时间获取基线数据，用于后续比较。
  2. 排便计数
    1. 在旋转轮测试结束后，将装有四只啮齿类动物的有机玻璃容器放置于实验台上。
    2. 取出动物，并分别放入独立的旷场箱（见下文）。
    3. 统计每只动物在有机玻璃箱内排出的粪便颗粒数量。
      注：可通过在电梯垂直运动前统计粪便颗粒数量，获得基线值，以便与运动后的评估结果进行比较。
  3. 旷场实验
    1. 将啮齿类动物放入旷场箱（40 cm × 40 cm × 45 cm）中。
    2. 使用红外视频摄像机记录动物 3 分钟内的旷场行为28,29,30。
    3. 计算动物的总移动距离。
      注：在电梯垂直运动前，切勿将动物提前放入旷场箱。环境对动物而言必须是全新的，因此不应为旷场实验采集基线数据。

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结果

图2展示了穿越平衡木所需时间的代表性结果。大鼠连续训练3天，以在平衡木任务中达到稳定的表现10。次日对大鼠的平衡木表现进行评估。图中纵轴显示了为演示目的而设置的旋转轮组、电梯垂直运动组和对照组大鼠穿越平衡木所需的秒数。

图3展示了典型的排便次数实验结果。在电梯垂直运动实验中，大鼠被分为三组，分别接受0.8 Hz、0.4 Hz和0.2 Hz的垂直运动刺激，另设一组不施加运动刺激的对照组，称为静止组。对应的运动周期换算如下：频率 = 0.8 Hz = 1/0.8 = 0.1250 s = 1250 ms，频率 = 0.4 Hz = 1/0.4 = 0.2500 s = 2500 ms，频率 = 0.2 Hz = 1/0.2 = 0.5000 s = 5000 ms。电梯垂直运动（EVM）显著增加了排便次数（单因素方差分析，F(3,31) = 20.2306，p < 0.00001）。在不同频率的垂...

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讨论

本研究描述了利用电梯式垂直运动和摩天轮旋转来评估啮齿类动物对被动运动的自主神经反应。这些设备和操作方法可轻松应用于其他啮齿类动物，且已存在多种检测方案的改良形式，可用于在不同条件下验证前庭功能，例如在药物干预或外科手术期间。由前庭刺激引发的运动病（MS）相关研究提出了感觉冲突或神经元不匹配理论，即当接收到的视觉信息与环境中预期的内部模型不一致时2,3，会引发自主神经反应，导致上腹部不适、恶心和/或呕吐等症状1。其他理论进一步指出，姿势不稳定（例如在偏航摇晃的船上所发生的情况）4,5也会诱发自主神经反应。尽管已有显著进展，但仍存在诸多未解问题，而电梯式垂直运动和摩天轮旋转等评估方案有助于推动这些问题的研究。

平衡木实验的关键步骤是训练。大鼠必须具有足够的动机并有信心通过横梁；否则，在评估期间无法准确测量其...

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披露

作者声明不存在任何财务或非财务利益冲突。FWR 设备在中国拥有专利：ZL201120231912.1。

致谢

本工作部分由香港研究资助局早期职业计划资助，项目编号 #21201217，授予 C. L。FWR 装置已在中国获得专利：ZL201120231912.1。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
电梯垂直运动装置Custom根据所需规格定制的电梯垂直运动装置
EthovisionNoldus Information Technology视频追踪软件
摩天轮旋转装置Custom根据所需规格定制的摩天轮旋转装置
乳胶、聚氯乙烯或丁腈手套AMMEX使用无粉8密耳手套
旷场实验箱Custom配备红外摄像机的暗色有机玻璃箱
大鼠或小鼠JAX labs任何小型啮齿类动物
小型啮齿类动物笼具Tecniplast1284L
木制横梁和凳子Custom按指定规格定制的木制横梁和凳子

参考文献

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