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方法文章

通过靶向测序方法进行比较性病变分析

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DOI：

10.3791/59844

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2019年11月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ARC-Net Research Centre, University and Hospital Trust of Verona, 2Department of Diagnostics and Public Health, Section of Pathology, University and Hospital Trust of Verona, 3Department of Medicine (DIMED), Surgical Pathology and Cytopathology Unit, University of Padua

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于识别特定患者不同样本中克隆性和亚克隆性改变的方法。尽管此处描述的实验集中于某一特定肿瘤类型，但该方法可广泛适用于其他实体瘤。

摘要

评估肿瘤内异质性（ITH）对于预测靶向治疗的失败并据此设计有效的抗肿瘤策略至关重要。尽管由于样本处理方法和测序深度的差异常引发关注，但通过对实体瘤进行下一代测序，已揭示不同肿瘤类型中ITH程度存在高度变异性。通过识别克隆性和亚克隆性细胞群，明确原发灶与转移灶之间的遗传相关性，对于晚期疾病治疗方案的设计尤为关键。本文报道了一种可用于比较不同病灶的分析方法，能够识别同一患者不同样本中的克隆性和亚克隆性细胞群。该实验方法整合了三种成熟的技术：组织学分析、高覆盖度多病灶测序以及免疫表型分析。为最大限度减少不当样本处理对亚克隆事件检测的影响，我们对组织样本进行了细致的病理学检查，并富集了肿瘤细胞。随后，对经质量控制的肿瘤病灶及正常组织DNA进行高覆盖度测序，靶向409个与癌症相关的重要基因的编码区。尽管该方法仅检测有限的基因组区域，但仍可评估特定患者不同病灶间体细胞变异（单核苷酸突变和拷贝数变异）的异质性程度。通过测序数据的比较分析，我们能够区分克隆性与亚克隆性变异。大多数ITH通常归因于乘客突变；因此，我们还采用免疫组织化学方法预测突变的功能性后果。尽管本方案已应用于特定类型的肿瘤，但我们预期该方法可广泛适用于其他类型的实体瘤。

引言

下一代测序（NGS）技术的出现彻底改变了癌症的诊断与治疗方式1。NGS 结合多区域测序揭示了实体瘤中高度的肿瘤内异质性（ITH）2，这在一定程度上解释了靶向治疗失败的原因，即由于存在具有不同药物敏感性的亚克隆2。全基因组测序研究带来的重要挑战之一，是在个体癌症中区分乘客（即中性）突变与驱动突变的必要性3。已有若干研究表明，在某些肿瘤中，乘客突变构成了ITH的主体，而驱动改变则倾向于在同一患者的各个病灶之间保持保守4。还需注意的是，较高的突变负荷（如在肺癌和黑色素瘤中所见）并不一定意味着较高的亚克隆突变负荷2。因此，在突变负荷较低的肿瘤中也可能存在高度的ITH。

转移灶导致了全球超过90%的癌症相关死亡5；因此，捕获原发灶与转移灶之间驱动基因的突变异质性，对于设计治疗晚期疾病的有效疗法至关重要。临床测序通常使用固定组织提取的核酸进行，由于DNA质量较差，这使得全基因组范围的探索变得困难。另一方面，临床测序的目的是识别可靶向的突变和/或可能预测患者对特定治疗方案响应性或无响应性的突变。目前，为及时获取临床相关的信息，测序可局限于基因组中较小的一部分区域。从低通量DNA分析（例如Sanger测序）向高通量测序（NGS）的转变，使得能够以高覆盖深度分析数百个与癌症相关的基因，从而检测出亚克隆事件。本文报道了一种比较病灶分析方法，可在同一患者的不同样本中识别克隆性和亚克隆性细胞群。此处描述的方法整合了三种成熟的技术手段（组织学分析、高覆盖度多病灶测序以及免疫表型分析），以预测所发现变异的功能性后果。该方法的流程示意图见图1，并已应用于5例胰腺实性假乳头状瘤（SPN）转移病例的研究。尽管本文描述的是甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织样本的处理与分析过程，但相同流程也可用于新鲜冷冻组织来源的遗传物质。

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方案

本研究中使用的材料是根据特定方案收集的，该方案已获得当地伦理委员会的批准。所有患者均提供了书面知情同意书。

1. 组织标本的组织学和免疫表型复查

注意：以下所述活动由专业病理学家负责。

  1. 根据公认的诊断标准对所选病例进行组织病理学复核。
    1. 使用切片机从代表性的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块上切下 4−5 µm 厚的组织切片，并将切片贴附于标准组织学载玻片上。
    2. 使用自动组织切片染色仪对每张切片进行苏木精-伊红染色（材料表）。
    3. 根据世界卫生组织（WHO）诊断标准复核所选肿瘤病例的组织病理学诊断。
      注：在此阶段，病理学家可能在同一组织切片中识别出形态学上不同的肿瘤区域。可对这些区域分别取材（见第 2 节）。SPN 肿瘤细胞与正常细胞的组织学相似性见图 2。
    4. 对已知标志物进行免疫组织化学染色，以补充组织学分析并评估免疫表型异质性。
      注：病理学家可能在同一组织切片中识别出免疫表型不同的肿瘤区域。可对这些区域分别取材（见第 2 节）。
  2. 评估肿瘤组织切片中的肿瘤细胞含量，并据此规划手工显微切割。
    注：此为病理学家对肿瘤细胞含量的估计值。
    1. 若组织切片中肿瘤细胞含量高于 70%，则无需进行手工显微切割；直接进入步骤 3.1。
      注：设定 70% 的肿瘤细胞含量为目标值，以（i）确保突变等位基因频率估算的足够敏感性，以及（ii）可能通过敏感性较低的方法（如毛细管测序）验证克隆性突变。
    2. 若组织切片中肿瘤细胞含量低于 70%，则必须进行显微切割，并进入步骤 2。
  3. 评估已采集非肿瘤组织的 FFPE 组织块的切片。该组织将作为胚系 DNA 的来源。
    注：血液是胚系 DNA 的替代来源。在此情况下，请按照步骤 4.1 注释中推荐的方法进行 DNA 提取。
    1. 若组织切片中仅可见非肿瘤组织（图 2D），则无需手工显微切割；直接进入步骤 3.1。
    2. 若组织切片中存在大量肿瘤细胞污染，则必须进行手工显微切割；进入第 2 节。

2. 手动显微解剖

注意：该方法适用于多种实体瘤类型，旨在提高组织样本中肿瘤细胞的含量。此外，该方法也可用于获取同一组织切片中形态学和/或免疫表型不同的区域。

  1. 使用切片机切割最多十片4−6 μm厚的FFPE肿瘤组织切片，并将其贴附于未带电荷的载玻片上。
    注意：如果标本中仅可见一个1 mm2的癌细胞巢，则应切割10张组织切片并进行手工显微切割，以获得目标量的DNA（40 ng）；此估算基于1 mm2细胞簇包含700至1000个肿瘤细胞核的假设。
  2. 将载玻片在60 °C下孵育10分钟。
  3. 将载玻片放入染色架中，依次进行以下洗涤步骤：二甲苯中浸泡20分钟，100%乙醇中10分钟，80%乙醇中10分钟，70%乙醇中10分钟，蒸馏水中1分钟，苏木精复染10秒，自来水冲洗1分钟。
  4. 在标准倒置显微镜下，使用连接在注射器上的27 G针头作为显微切割工具，收集具有代表性的肿瘤细胞簇。至少收集十个1 mm2的细胞簇，以确保获得足量用于测序的DNA。
    注意：若需将形态学上不同的区域视为独立样本进行分析，则应使用显微切割工具分别收集这些区域。
  5. 将收集的细胞簇放入已预先加入20 μL蛋白酶K和180 μL裂解缓冲液（材料表，均包含在DNA提取试剂盒中）的1.5 mL离心管（材料表）中，通过涡旋震荡充分混匀。

3. 无需预先显微切割的组织处理

注意：此步骤适用于仅包含非肿瘤细胞（体细胞DNA来源）的组织块，或包含至少70%形态学上均一的癌细胞的组织块。

  1. 使用切片机从选定的FFPE组织块中切下最多六片厚度为4−5 µm的组织切片。按照步骤2.5所述，将组织卷放入1.5 mL离心管中。

4. 从正常和肿瘤细胞中提取DNA

  1. 使用DNA FFPE组织提取试剂盒（材料表），按照制造商说明书从正常和肿瘤组织中纯化DNA。
    注意：当使用血液作为生殖系核酸来源时，应使用DNA血液提取试剂盒（材料表）纯化DNA。
  2. DNA定量与质量检测
    1. 为定量双链DNA（dsDNA）的含量，取DNA样品等分试样加入含有荧光核酸染料的溶液中（材料表），使用台式荧光计（材料表）测量发射的荧光强度。
      注意：该检测通过测定与dsDNA结合的荧光染料所发出的荧光信号强度，并利用标准曲线确定DNA含量。
    2. 使用微量分光光度计（材料表）测定样品的260/280和260/230比值以评估DNA纯度。“纯”DNA的260/280比值应为1.8，260/230比值应在1.8−2.2范围内。
      注意：分光光度法评估旨在检测可能影响后续反应的化学污染物（如苯酚）的存在。若因化学试剂导致污染，应使用基于离心柱的试剂盒进行纯化处理。

5. 文库构建与定量

注意：文库构建与定量步骤的示意图流程图见图3。

  1. DNA文库制备（每个样本设置4个引物池）
    注意：这4个引物池属于材料表中列出的癌症检测面板。每个池包含为409个基因的多重靶向选择而设计的引物对。NGS面板所含基因列表的链接见材料表。
    1. 为每个样本准备四个DNA靶向扩增反应，每个引物池对应一个反应。对于每个引物池（材料表），在0.2 mL离心管（材料表）中加入：4 μL主混合液（材料表，包含在文库试剂盒中）、10 μL高保真引物池混合液（材料表，包含在癌症面板文库中）和6 μL DNA（总量10 ng）。
    2. 在四个1.5 mL离心管中分别对每个引物池的靶区域进行扩增，运行以下程序：99 °C保持2 min（激活热启动聚合酶），进行16个循环（99 °C变性15 s，60 °C退火并延伸8 min），4 °C保持。
      注意：可暂停步骤。靶向扩增反应可于4 °C过夜保存，或于-20 °C长期保存。
    3. 扩增子末端的部分消化
      注意：NGS试剂盒制造商提供的说明书建议将每个样本的不同扩增反应在部分消化前合并。请避免此步骤，应保持每个扩增反应单独处理。
      1. 向每个样本的每个扩增池中加入2 μL特异性消化混合液（材料表，包含在文库试剂盒中）（每个0.2 mL离心管总体积为22 μL）。充分涡旋振荡，并短暂离心以收集液滴。
      2. 将离心管放入热循环仪，运行以下程序：50 °C 10 min，55 °C 10 min，60 °C 20 min，10 °C保持（最长1 h）。
        注意：可暂停步骤。可将板置于-20 °C长期保存。
    4. 将接头连接至扩增子并进行纯化。
      注意：当在单个芯片上对多个文库进行测序时，每个样本应使用不同的条形码接头。同一样本的四个扩增反应必须使用相同的条形码。
      1. 准备接头（材料表，条形码接头试剂盒）。对于每个条形码X，将P1接头和特异性条形码接头（材料表）按1:4的终浓度稀释比例混合。将4 µL水与2 µL P1接头和2 µL特异性条形码接头混合。下游步骤中使用2 µL该条形码接头混合液。
      2. 按以下顺序向每个样本的每个扩增池中添加试剂以进行连接反应：4 μL转换溶液（材料表，包含在文库试剂盒中）、2 µL条形码接头混合液和2 µL DNA连接酶（材料表，包含在文库试剂盒中）（总体积 = 30 µL）。
      3. 充分涡旋振荡，并短暂离心以收集液滴。
      4. 将每个离心管放入热循环仪，运行以下程序：22 °C 30 min，68 °C 5 min，72 °C 5 min，4 °C保持（最长24 h）。
        注意：可暂停步骤。可将板置于-20 °C长期保存。
    5. 文库纯化与扩增
      1. 离心每个离心管，然后将每个带条形码的样本转移至1.5 mL离心管中。向每个样本的每个池中加入45 µL基于磁珠的纯化试剂（材料表）。上下吹打5次，使磁珠悬浮液与DNA充分混合。
      2. 室温（RT）孵育5 min，然后将每个离心管置于磁力架上孵育2 min。小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀。
      3. 向每个离心管中加入150 μL新鲜的70%乙醇。通过在磁铁两个位置之间左右移动离心管来清洗磁珠。弃去上清液，并注意不要扰动沉淀。
      4. 重复步骤5.1.5.3所述操作，然后将离心管保留在磁力架上，在室温下空气干燥磁珠5 min。
      5. 将每个引物池的纯化文库离心管从磁力架上取下，向每个管的磁珠沉淀中加入50 μL高保真PCR混合液（材料表）和2 μL文库扩增引物混合液（材料表，包含在文库试剂盒中）。
      6. 涡旋振荡每个1.5 mL离心管，并短暂离心以收集液滴。
      7. 将1.5 mL离心管置于磁力架上2 min，小心地将每个管中的上清液（约50 μL）转移至新的0.2 mL离心管中，避免扰动沉淀。
      8. 对每个引物池的文库进行扩增，运行以下程序：98 °C保持2 min以激活酶，进行5个循环（98 °C变性15 s，64 °C退火并延伸1 min），4 °C保持。样本储存于-20 °C。
    6. 扩增后文库的纯化
      1. 离心每个离心管以使内容物沉降至管底，并将每个扩增后的文库样本转移至1.5 mL离心管中。
      2. 加入25 μL基于磁珠的纯化试剂。上下吹打5次以使磁珠悬浮液与DNA混合。
      3. 室温孵育5 min，然后将离心管置于磁力架上5 min。
      4. 小心地将每个管中的上清液（含有扩增子）转移至新离心管中，避免扰动沉淀。
      5. 向每个管的上清液中加入60 μL基于磁珠的纯化试剂，并上下吹打以混合磁珠悬浮液与DNA。
      6. 室温孵育5 min，然后将离心管置于磁力架上3 min。
      7. 弃去每个管中的上清液，并注意不要扰动沉淀。
        注意：扩增子已结合至磁珠上。
      8. 向每个离心管中加入150 μL新鲜的70%乙醇。通过在磁铁两个位置之间左右移动离心管来清洗磁珠。弃去上清液，并注意不要扰动沉淀。
      9. 重复步骤5.1.6.8中的操作，在室温下空气干燥磁珠3 min。避免磁珠过度干燥。
      10. 将离心管从磁力架上取下，向沉淀中加入50 μL低TE缓冲液（Tris EDTA）（材料表，包含在文库试剂盒中）以分散磁珠。
      11. 上下吹打混合液数次，在室温下孵育2 min。
      12. 将离心管置于磁力架上至少2 min，小心地将含有扩增子的上清液转移至新离心管中，避免扰动磁珠。
  2. 文库定量
    1. 使用片段分析仪（材料表）按照高灵敏度DNA试剂盒的操作流程运行DNA芯片。

6. 文库合并与测序运行

  1. 用无核酸酶水将每个文库稀释至 100 pM。将单次运行所需每个 100 pM 文库各取 10 μL 混合于同一管中。通过移液混匀合并后的文库，随后进行模板制备和测序。
  2. 运行计划创建
    注意：典型的运行包含四个样本，可根据实验室可用的测序仪（Ion Proton 系统或 GeneStudio S5 系统，参见材料表）加载到两种不同类型的半导体芯片上（Ion PI 芯片或 Ion 540 芯片）。这些系统每次运行通常可产生 8000 万条读长。
    1. 在连接测序系统的计算机上打开 Torrent 浏览器（例如 Ion Chef 系统），使用所选应用的通用模板（AmpliSeqDNA）规划新运行。
    2. 切换到计划中的试剂盒选项卡。根据所使用的测序系统，在仪器下拉列表中选择Ion Proton 系统或Ion GeneStudio S5 系统。
    3. 根据测序系统，从芯片类型下拉列表中选择合适的芯片（Ion Proton 系统使用 PI 芯片；Ion GeneStudio S5 系统使用 540 芯片）。
    4. 从文库试剂盒下拉列表中选择Ion AmpliSeq 2.0 文库试剂盒。
    5. 在模板试剂盒处选择Ion Chef按钮，然后从模板试剂盒下拉列表中选择合适的Chef 试剂盒（PI 芯片使用 Ion PI Hi-Q Chef 试剂盒，540 芯片使用 Ion 540 Kit-Chef）。
    6. 从测序试剂盒下拉列表中选择合适的测序试剂盒（PI 芯片使用 Ion PI Hi-Q Sequencing 200 试剂盒，540 芯片使用 Ion S5 Sequencing 试剂盒），然后从条形码集下拉列表中选择IonXpress。
    7. 切换到插件选项卡，并选择覆盖度分析插件。
    8. 切换到计划选项卡。从参考基因组库下拉列表中选择 GRCh37/hg19 基因组。从目标区域下拉列表中选择待测序的相应面板。
    9. 在相应字段中设置待测序的条形码数量及文库样本管的标签。
    10. 为每个文库设置条形码名称和样本名称。
  3. 样本文库稀释与上样。
    1. 用无核酸酶水将文库原液稀释至 PI 芯片为 25 pM，540 芯片为 32 pM。
    2. 将每种稀释后的文库各 50 μL 移入相应文库样本管底部。
    3. 打开测序系统，并按照屏幕提示加载所有必需试剂并导入运行计划。
    4. 加载含有混合文库的样本管，并启动克隆扩增程序。
      注意：Ion Chef 系统每次运行需准备两块芯片。
  4. 在 Ion Proton 或 Ion GeneStudio S5 上进行测序。
    1. 打开测序系统，并按照屏幕提示初始化测序并导入运行计划。
    2. 从测序系统中取出测序芯片后，将其加载至系统。
      注意：在拿取芯片前应确保接地，以避免因静电放电造成芯片损坏。芯片的操作/定位方法以及成功/失败加载的示例见图 4。
    3. 关闭芯片仓盖，等待芯片状态图标显示为"就绪"。
    4. 首次运行完成后清空废液容器，随后尽快对剩余芯片进行测序。

7. 突变与拷贝数变异（CNVs）分析

注意：在方案中设置后（步骤 6.2.8），测序数据将自动比对至 GRCh37/hg19 人类参考基因组。

  1. 使用覆盖度分析插件（材料表）的输出结果，验证测序深度和覆盖均匀性。
  2. 使用Torrent变异检测插件（材料表）进行变异检测，根据需要选择生殖系或体细胞分析流程。
  3. 下载经过过滤的变异位点文件（VCF格式）。使用Variant Effect Predictor（VEP）软件6和NCBI RefSeq数据库对变异进行注释。
  4. 通过Ion Reporter上传插件将测序数据载入Ion Reporter软件，并使用全面癌症检测面板肿瘤-正常配对分析流程分析数据，以评估拷贝数变异（CNV）。
  5. 根据软件评分手动筛选突变和拷贝数变异，并使用整合基因组浏览器（IGV）进行可视化验证7。
    1. 目视检查比对结果中是否存在异常读段（例如由于引物错配、过度扩增或读段软剪切等）可能导致假阳性变异检出。
    2. 通过检查特定基因所有扩增子的标准化覆盖度与基线标准化覆盖度的比较，验证拷贝数变异。
      注意：此步骤有助于纠正因分割软件导致的误判；分割软件有时会基于某个基因末端和相邻基因起始处少数扩增子对称性异常覆盖而错误地报告拷贝数变异。
  6. 体细胞突变的索引分类
    1. 针对每个病例，对正常组织/血液、原发肿瘤和转移灶的测序结果中的突变进行索引。
    2. 将生殖系DNA测序数据中同样存在的突变标记为生殖系突变并予以剔除。
    3. 将同一患者所有病灶中均存在的突变标记为克隆性/奠基性突变。
    4. 将仅在部分而非全部病灶中检测到的突变标记为亚克隆性/进展性突变。

8. 免疫表型分析：相关蛋白表达的免疫组织化学

注意：免疫组织化学用于验证肿瘤抑制基因失活突变的功能后果。

  1. 使用切片机切割3−4 μm厚的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，并将其贴附于带电荷的载玻片上，在60 °C下孵育10分钟。
  2. 将载玻片放入染色架中，依次进行以下步骤：二甲苯处理10分钟，二甲苯再处理10分钟，95%乙醇处理4分钟，95%乙醇再处理4分钟，70%乙醇处理4分钟，70%乙醇再处理4分钟，蒸馏水处理4分钟。
  3. 根据抗体生产商的说明进行抗原修复（材料表）。
    1. 将载玻片放入装有特定抗原修复液的染色架中，并置于接近沸点温度的水浴中浸没处理。
    2. 从水浴中取出载玻片，用流水冷却10分钟。
  4. 将载玻片放入新的染色架中，加入含3% H2O2的1x Tris缓冲盐水（TBS）溶液，在室温下孵育20分钟，以灭活内源性过氧化物酶。
  5. 将载玻片放入新的染色架中，用TBS含0.1% Tween 20（TBST）溶液洗涤3次。
  6. 使用PAP笔（材料表）在载玻片上的组织周围画出疏水性圈。
  7. 将载玻片置于湿盒中，加入含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST封闭液，在室温下封闭1小时。
  8. 在湿盒中加入一抗（材料表），于4 °C孵育过夜。按照推荐比例用封闭液稀释一抗。
  9. 将载玻片放入新的染色架中，用TBST溶液洗涤3次。
  10. 在湿盒中加入特异性二抗（抗小鼠或抗兔）（每张载玻片4−5滴），室温孵育30分钟。
  11. 将载玻片放入新的染色架中，先用TBST洗涤3次，再用蒸馏水冲洗。
  12. 配制3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液：将1滴DAB原液加入1 mL稀释缓冲液中（材料表）。将载玻片孵育最多5分钟，并在显微镜下观察显色情况。
  13. 使用阳性对照，在显微镜下观察反应显色过程，以确定最佳孵育时间。
    注：每种抗体需要特定的孵育时间。
  14. 将载玻片浸入蒸馏水中，终止DAB反应（停止显色剂沉淀）。
  15. 将载玻片放入新的染色架中，用苏木精染色10秒，随后用流水冲洗。
  16. 将载玻片放入染色架中，依次进行以下步骤：70%乙醇处理4分钟，70%乙醇再处理4分钟，95%乙醇处理4分钟，95%乙醇再处理4分钟，二甲苯处理10分钟，二甲苯再处理10分钟。
  17. 在每张组织切片上滴加数滴封片介质（材料表），加盖盖玻片进行封片。
  18. 轻压盖玻片，使多余的封片介质和气泡从组织区域排出，并自然晾干。
  19. 在倒置显微镜下由经验丰富的病理学家评估并评分染色结果。
    注：评分系统将取决于具体的抗原，相关文献中可能已有相应评分方法。若文献中无相关信息，可参考该抗原在正常组织中的表达情况建立评分系统。

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结果

研究工作流程如图所示 图1. 对5例SPN病例的多病灶（n = 13）进行靶向409个癌症相关基因编码序列的测序，共鉴定出8个基因中的27个体细胞突变（CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1，以及 FGFR3）。当某一患者的全部病灶中均存在相同突变时，定义为奠基性/克隆性突变；当突变仅存在于同一患者的某些而非全部病灶中时，定义为进展性/亚克隆性突变（图5A，B）。总体而言，该队列中鉴定出的大多数点突变均为克隆性事件，包括以下基因的突变： CTNNB1, KDM6A, TET1 和 FLT1. 一致地，对β-catenin（其基因编码的蛋白质产物）进行免疫组织化学染色显示 CTNNB1）而KDM6A在具有相应...

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讨论

本方法通过整合单个患者不同病灶的纵向数据（即形态学、DNA测序和免疫组织化学），能够识别实体瘤进展过程中涉及的分子改变。我们已证实该方法可在一种突变沉默型肿瘤（即胰腺实性假乳头状瘤，SPN）中检测克隆性和亚克隆性事件，检测范围涵盖409个与癌症相关基因的编码序列8。本研究采用基于扩增子的靶向测序策略，其优势在于测序覆盖的均一性：在典型的平均测序深度达1000x的情况下，90%的目标碱基覆盖深度达到100x，95%达到20x，覆盖区域共计15,992个。高测序深度结合显微切割对肿瘤细胞的富集，确保了对低等位基因频率事件的高灵敏度检测。正如我们先前所证实9，该靶向测序方法可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织来源的DNA样本中检测到低至2%等位基因频率的突变。例如，在本研究中，我们成功识别出一个转移性样本中等位基因频率为4%的TP53错义突变作为亚克隆事件（图5），并通过免疫组织化学验证了该结果（图6）。本方案设计包含配对的肿...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由意大利癌症基因组计划（资助号：FIRB RBAP10AHJB）、意大利癌症研究协会（AIRC；资助号：12182 至 AS，18178 至 VC）以及欧盟第七框架计划资助（Cam-Pac 项目编号 602783 至 AS）提供支持。资助机构在数据的收集、分析与解释以及论文撰写过程中未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2100 Bioanalyzer 仪器Agilent TechnologiesG2939BA 自动化电泳工具
Agencourt AMPure XP 试剂盒Fisher ScientificNC9959336用于纯化 PCR 产物的磁珠技术；基于磁珠的纯化试剂
Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒Agilent Technologies5067-4627文库定量
Anti-BAP1Santa Cruz Biotechnologysc-28383抗体
Anti-GLUT1Thermo ScientificRB-9052抗体
Anti-KDM6ACell Signaling#33510抗体
Anti-p53NovocastraNCL-L-p53-DO7抗体
Anti-βcateninSigma-AldrichC7207抗体
封闭溶液自制-含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBST 溶液
内源性过氧化物酶灭活溶液自制-含 3% H2O2 的 1× Tris 缓冲盐水（TBS）
Leica CV ultraLeica70937891Entellan 封片介质
表位修复溶液 1Leica BiosystemsAR9961柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）表位修复溶液
表位修复溶液 2Leica BiosystemsAR9640EDTA 缓冲液（pH 9.0）表位修复溶液
Eppendorf 0.2 ml PCR 管，透明Eppendorf951010006管
Eppendorf DNA LoBind 管，1.5 mLEppendorf22431021管
乙醇DIAPATHA0123IHC 脱蜡试剂
ImmEdge 笔 疏水 屏障 笔Vector LaboratoriesH­4000疏水笔
ImmPACT DAB 过氧化物酶Vector LaboratoriesSK­4105HRP 底物
ImmPRESS Anti­兔 Ig 试剂 过氧化物酶Vector LaboratoriesMP­7401­50二抗
ImmPRESS Anti­鼠 Ig 试剂 过氧化物酶Vector LaboratoriesMP­7402­50二抗
整合基因组浏览器（IGV）Broad Institute-https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq 综合癌症检测面板Thermofisher Scientific4477685多重靶向选择 409 个与癌症相关的基因。https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq 文库制备试剂盒 2.0Thermofisher Scientific4480441使用 Ion AmpliSeq 面板制备扩增子文库
Ion Chef 仪器Thermofisher Scientific4484177自动化文库制备、模板制备和芯片上样
Ion PI 芯片试剂盒 v3 或 Ion 540 芯片Thermofisher ScientificA26771 或 A27766带条形码的测序芯片
Ion PI Hi-Q Chef 试剂盒或 Ion 540 Kit-ChefThermofisher ScientificA27198 或 A30011模板制备
Ion PI Hi-Q 测序 200 试剂盒或 Ion S5 测序试剂盒Thermofisher ScientificA26433 或 A30011测序
Ion Proton 或 Ion GeneStudio S5 系统Thermofisher Scientific4476610 或 A38196测序系统
Ion Reporter 软件 - AmpliSeq 综合癌症检测面板肿瘤-正常配对分析流程Thermofisher Scientific4487118分析流程
Ion Reporter 软件 - 上传插件Thermofisher Scientific4487118数据分析工具
Ion Torrent Suite 软件 - 覆盖度分析插件Thermofisher Scientific4483643描述测序覆盖水平的插件
Ion Torrent Suite 软件 - 变异检测插件Thermofisher Scientific4483643能够在参考序列基础上识别样本中的单核苷酸多态性（SNPs）、插入和缺失的插件
Ion Xpress 条形码接头 1-96 试剂盒Thermofisher Scientific4474517唯一性条形码接头
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计Thermofisher ScientificND-2000DNA 纯度检测
NCBI 参考序列（RefSeq）数据库NCBI-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix 高保真酶Fisher Scientific12532-016 或 12532-024用于 PCR 扩增的 SuperMix；高保真 PCR 混合液
QIAamp DNA 血液小型试剂盒Quiagen51106 0r 51104DNA 血液提取试剂盒
QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒Quiagen56404DNA FFPE 组织提取试剂盒
Qubit 2.0 荧光计Thermofisher ScientificQ32866DNA 定量
Qubit dsDNA BR 定量试剂盒Thermofisher ScientificQ32850用于 Qubit 2.0 荧光计进行 DNA 定量的试剂盒
TBST自制-Tris 缓冲盐水（TBS）含 0.1% Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek FilmSakura Europe6172自动化组织切片染色仪
变异效应预测（VEP）软件EMBI-EBI-http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
二甲苯，异构体混合物Carlo Erba492306IHC 脱蜡试剂

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