本文介绍了一种用于识别特定患者不同样本中克隆性和亚克隆性改变的方法。尽管此处描述的实验集中于某一特定肿瘤类型，但该方法可广泛适用于其他实体瘤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
评估肿瘤内异质性（ITH）对于预测靶向治疗的失败并据此设计有效的抗肿瘤策略至关重要。尽管由于样本处理方法和测序深度的差异常引发关注，但通过对实体瘤进行下一代测序，已揭示不同肿瘤类型中ITH程度存在高度变异性。通过识别克隆性和亚克隆性细胞群，明确原发灶与转移灶之间的遗传相关性，对于晚期疾病治疗方案的设计尤为关键。本文报道了一种可用于比较不同病灶的分析方法，能够识别同一患者不同样本中的克隆性和亚克隆性细胞群。该实验方法整合了三种成熟的技术：组织学分析、高覆盖度多病灶测序以及免疫表型分析。为最大限度减少不当样本处理对亚克隆事件检测的影响，我们对组织样本进行了细致的病理学检查，并富集了肿瘤细胞。随后，对经质量控制的肿瘤病灶及正常组织DNA进行高覆盖度测序，靶向409个与癌症相关的重要基因的编码区。尽管该方法仅检测有限的基因组区域，但仍可评估特定患者不同病灶间体细胞变异（单核苷酸突变和拷贝数变异）的异质性程度。通过测序数据的比较分析，我们能够区分克隆性与亚克隆性变异。大多数ITH通常归因于乘客突变；因此，我们还采用免疫组织化学方法预测突变的功能性后果。尽管本方案已应用于特定类型的肿瘤，但我们预期该方法可广泛适用于其他类型的实体瘤。
引言
下一代测序（NGS）技术的出现彻底改变了癌症的诊断与治疗方式1。NGS 结合多区域测序揭示了实体瘤中高度的肿瘤内异质性（ITH）2，这在一定程度上解释了靶向治疗失败的原因，即由于存在具有不同药物敏感性的亚克隆2。全基因组测序研究带来的重要挑战之一，是在个体癌症中区分乘客（即中性）突变与驱动突变的必要性3。已有若干研究表明，在某些肿瘤中，乘客突变构成了ITH的主体，而驱动改变则倾向于在同一患者的各个病灶之间保持保守4。还需注意的是，较高的突变负荷（如在肺癌和黑色素瘤中所见）并不一定意味着较高的亚克隆突变负荷2。因此，在突变负荷较低的肿瘤中也可能存在高度的ITH。
转移灶导致了全球超过90%的癌症相关死亡5；因此，捕获原发灶与转移灶之间驱动基因的突变异质性，对于设计治疗晚期疾病的有效疗法至关重要。临床测序通常使用固定组织提取的核酸进行，由于DNA质量较差，这使得全基因组范围的探索变得困难。另一方面，临床测序的目的是识别可靶向的突变和/或可能预测患者对特定治疗方案响应性或无响应性的突变。目前，为及时....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究中使用的材料是根据特定方案收集的，该方案已获得当地伦理委员会的批准。所有患者均提供了书面知情同意书。
1. 组织标本的组织学和免疫表型复查
注意：以下所述活动由专业病理学家负责。
- 根据公认的诊断标准对所选病例进行组织病理学复核。
- 使用切片机从代表性的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块上切下 4−5 µm 厚的组织切片，并将切片贴附于标准组织学载玻片上。
- 使用自动组织切片染色仪对每张切片进行苏木精-伊红染色（材料表）。
- 根据世界卫生组织（WHO）诊断标准复核所选肿瘤病例的组织病理学诊断。
注：在此阶段，病理学家可能在同一组织切片中识别出形态学上不同的肿瘤区域。可对这些区域分别取材（见第 2 节）。SPN 肿瘤细胞与正常细胞的组织学相似性见图 2。 - 对已知标志物进行免疫组织化学染色，以补充组织学分析并评估免疫表型异质性。
注：病理学家可能在同一组织切片中识别出免疫表型不同的肿瘤区域。可对这些区域分别取材（见第 2 节）。
- 评估肿瘤组织切片中的肿瘤细胞含量，并据此规划手工显微切割。
注：此为病理学家对肿瘤细胞含量的估计值....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
研究工作流程如图所示 图1. 对5例SPN病例的多病灶（n = 13）进行靶向409个癌症相关基因编码序列的测序，共鉴定出8个基因中的27个体细胞突变（CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1，以及 FGFR3）。当某一患者的全部病灶中均存在相同突变时，定义为奠基性/克隆性突变；当突变仅存在于同一患者的某些而非全部病灶中时，定义为进展性/亚克隆性突变（图5A，B）。总体而言，该队列中鉴定出的大多数点突变均为克隆性事件，包括以下基因的突变： CTNNB1, KDM6A, TET1 和 FLT1. 一致地，对β-catenin（其基因编码的蛋白质产物）进行免疫组织化学染色显示 CTNNB1）而KDM6A在具有相应.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方法通过整合单个患者不同病灶的纵向数据（即形态学、DNA测序和免疫组织化学），能够识别实体瘤进展过程中涉及的分子改变。我们已证实该方法可在一种突变沉默型肿瘤（即胰腺实性假乳头状瘤，SPN）中检测克隆性和亚克隆性事件，检测范围涵盖409个与癌症相关基因的编码序列8。本研究采用基于扩增子的靶向测序策略，其优势在于测序覆盖的均一性：在典型的平均测序深度达1000x的情况下，90%的目标碱基覆盖深度达到100x，95%达到20x，覆盖区域共计15,992个。高测序深度结合显微切割对肿瘤细胞的富集，确保了对低等位基因频率事件的高灵敏度检测。正如我们先前所证实9，该靶向测序方法可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织来源的DNA样本中检测到低至2%等位基因频率的突变。例如，在本研究中，我们成功识别出一个转移性样本中等位基因频率为4%的TP53错义突变作为亚克隆事件（图5），并通过免疫组织化学验证了该结果（图6）。本方案设计包含配对的肿.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由意大利癌症基因组计划（资助号：FIRB RBAP10AHJB）、意大利癌症研究协会（AIRC；资助号：12182 至 AS，18178 至 VC）以及欧盟第七框架计划资助（Cam-Pac 项目编号 602783 至 AS）提供支持。资助机构在数据的收集、分析与解释以及论文撰写过程中未发挥任何作用。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2100 Bioanalyzer 仪器 | Agilent Technologies | G2939BA | 自动化电泳工具 |
| Agencourt AMPure XP 试剂盒 | Fisher Scientific | NC9959336 | 用于纯化 PCR 产物的磁珠技术；基于磁珠的纯化试剂 |
| Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4627 | 文库定量 |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | 抗体 |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | 抗体 |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | 抗体 |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | 抗体 |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | 抗体 |
| 封闭溶液 | 自制 | - | 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBST 溶液 |
| 内源性过氧化物酶灭活溶液 | 自制 | - | 含 3% H2O2 的 1× Tris 缓冲盐水（TBS） |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan 封片介质 |
| 表位修复溶液 1 | Leica Biosystems | AR9961 | 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）表位修复溶液 |
| 表位修复溶液 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA 缓冲液（pH 9.0）表位修复溶液 |
| Eppendorf 0.2 ml PCR 管，透明 | Eppendorf | 951010006 | 管 |
| Eppendorf DNA LoBind 管，1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | 管 |
| 乙醇 | DIAPATH | A0123 | IHC 脱蜡试剂 |
| ImmEdge 笔 疏水 屏障 笔 | Vector Laboratories | H4000 | 疏水笔 |
| ImmPACT DAB 过氧化物酶 | Vector Laboratories | SK4105 | HRP 底物 |
| ImmPRESS Anti兔 Ig 试剂 过氧化物酶 | Vector Laboratories | MP740150 | 二抗 |
| ImmPRESS Anti鼠 Ig 试剂 过氧化物酶 | Vector Laboratories | MP740250 | 二抗 |
| 整合基因组浏览器（IGV） | Broad Institute | - | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq 综合癌症检测面板 | Thermofisher Scientific | 4477685 | 多重靶向选择 409 个与癌症相关的基因。https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq 文库制备试剂盒 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | 使用 Ion AmpliSeq 面板制备扩增子文库 |
| Ion Chef 仪器 | Thermofisher Scientific | 4484177 | 自动化文库制备、模板制备和芯片上样 |
| Ion PI 芯片试剂盒 v3 或 Ion 540 芯片 | Thermofisher Scientific | A26771 或 A27766 | 带条形码的测序芯片 |
| Ion PI Hi-Q Chef 试剂盒或 Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 或 A30011 | 模板制备 |
| Ion PI Hi-Q 测序 200 试剂盒或 Ion S5 测序试剂盒 | Thermofisher Scientific | A26433 或 A30011 | 测序 |
| Ion Proton 或 Ion GeneStudio S5 系统 | Thermofisher Scientific | 4476610 或 A38196 | 测序系统 |
| Ion Reporter 软件 - AmpliSeq 综合癌症检测面板肿瘤-正常配对分析流程 | Thermofisher Scientific | 4487118 | 分析流程 |
| Ion Reporter 软件 - 上传插件 | Thermofisher Scientific | 4487118 | 数据分析工具 |
| Ion Torrent Suite 软件 - 覆盖度分析插件 | Thermofisher Scientific | 4483643 | 描述测序覆盖水平的插件 |
| Ion Torrent Suite 软件 - 变异检测插件 | Thermofisher Scientific | 4483643 | 能够在参考序列基础上识别样本中的单核苷酸多态性（SNPs）、插入和缺失的插件 |
| Ion Xpress 条形码接头 1-96 试剂盒 | Thermofisher Scientific | 4474517 | 唯一性条形码接头 |
| NanoDrop 2000/2000c 分光光度计 | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA 纯度检测 |
| NCBI 参考序列（RefSeq）数据库 | NCBI | - | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix 高保真酶 | Fisher Scientific | 12532-016 或 12532-024 | 用于 PCR 扩增的 SuperMix；高保真 PCR 混合液 |
| QIAamp DNA 血液小型试剂盒 | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA 血液提取试剂盒 |
| QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒 | Quiagen | 56404 | DNA FFPE 组织提取试剂盒 |
| Qubit 2.0 荧光计 | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA 定量 |
| Qubit dsDNA BR 定量试剂盒 | Thermofisher Scientific | Q32850 | 用于 Qubit 2.0 荧光计进行 DNA 定量的试剂盒 |
| TBST | 自制 | - | Tris 缓冲盐水（TBS）含 0.1% Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | 自动化组织切片染色仪 |
| 变异效应预测（VEP）软件 | EMBI-EBI | - | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| 二甲苯，异构体混合物 | Carlo Erba | 492306 | IHC 脱蜡试剂 |
参考文献
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Ce....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
