离体评估小鼠生殖道自发性运动的方法及基于MATLAB的子宫运动追踪算法用于数据分析

摘要

子宫收缩对女性健康至关重要。然而，病理性增强的收缩力可能导致痛经，尤其是在年轻女性中。本文介绍一种简单的离体实验方法，可用于快速评估平滑肌松弛剂治疗痛经的疗效。

摘要

痛经，即疼痛性痉挛，是女性月经期间最常见的症状，其严重程度可能影响女性的日常生活。本文介绍一种简便且经济的方法，可用于测试降低子宫收缩力的新药。该方法利用小鼠整个生殖道在体外培养于含氧 Krebs 缓冲液的培养皿中时可自发产生运动的独特特性。这种自发性运动类似于人类子宫肌层的波浪状活动，称为子宫内膜波。为验证该方法的有效性，我们使用了一种已知的子宫松弛药物——肾上腺素。结果表明，在该培养皿模型中，1 µM 肾上腺素可快速且可逆地抑制小鼠整个生殖道的自发性运动。记录子宫运动变化可通过普通智能手机或高精度数码相机轻松完成。我们开发了一种基于 MATLAB 的算法，通过测量子宫角运动频率来实现运动追踪，从而定量分析子宫自发性运动的变化。该体外方法的主要优势在于整个实验过程中生殖道保持完整，保留了所有固有的子宫内细胞相互作用。该方法的主要局限性在于，多达 10–20% 的子宫可能不表现出自发性运动。迄今为止，这是首个在培养皿模型中定量评估子宫自发性运动的 ex vivo 方法。

引言

作为女性的主要器官之一，子宫对生殖至关重要，并在胎儿发育过程中起着关键的营养供给作用¹。子宫由三层结构组成：外膜层（perimetrium）、肌层（myometrium）和内膜层（endometrium）。肌层是子宫的主要收缩层，在胎儿娩出过程中发挥关键作用。内膜层是衬于子宫腔内的最内层结构，对胚胎着床至关重要。在未怀孕的育龄期女性中，内膜层每月于月经周期开始时脱落。肌层通过维持自发性收缩，协助完成这一脱落过程，从而将坏死的内膜组织从子宫中清除¹。

遗憾的是，子宫肌层收缩力增强可能导致痛经等不良反应，即经期疼痛性痉挛。这种情况在年轻女性和未产妇中尤为常见²。然而，每位女性的痛经表现各不相同，其严重程度取决于子宫肌层收缩的强度；较强的收缩通常与剧烈痉挛感相关³。子宫肌层收缩力可通过子宫超声进行观察，常表现为子宫内膜波动。在子宫内膜脱落过程中，月经期前列腺素释放增加⁴，被认为会加剧子宫肌层的过度收缩，导致子宫肌肉缺血和缺氧，从而加重疼痛³。

严重的痛经可能影响部分女性的日常生活，有3%至33%的女性经历非常剧烈的疼痛，导致每次月经周期中有1至....

方案

所有涉及动物的实验程序均已获得印第安纳大学医学院（印第安纳波利斯，印第安纳州）机构动物护理和使用委员会的批准。研究中使用了2至5月龄的F2-129S-C57BL/6性成熟雌性小鼠。

注意：在处理动物和生物危害性材料时，为确保安全，必须穿戴实验服、口罩和手套。

1. 溶液配制

1. 配制含有以下成分的 Krebs 缓冲液：  130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄、0.56 mM MgCl₂、25 mM NaHCO₃ 和 5 mM 葡萄糖，pH 值为 7.4。使用含 5% CO₂ 和 95% O₂ 的压缩气体混合物持续对 Krebs 缓冲液进行氧合，并通过循环水浴将缓冲液温度维持在 37 °C。
2. 配制 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS），其成分为：： 2.68 mM KCl、1.47 mM KH₂PO₄、136.89 mM NaCl 和 8.1 mM Na₂HPO₄，pH 值为 7.4。

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结果

图1展示了本实验方案中所述整个生殖道分离过程的代表性图像。为避免毛发污染缓冲液而降低视频质量，我们使用70%乙醇润湿小鼠尸体。本方案解剖步骤的主要标志是找到膀胱。子宫和阴道位于膀胱的下方。

为了验证该方案，我们使用肾上腺素处理整个生殖道。肾上腺素是一种已知可引起子宫平滑肌松弛的物质。该激素由肾上腺髓质内源性产生，在哺乳动物中作为应激激素发挥作用。在实验中，我们使用了1 µM的肾上腺素，这是一个已知可产生最大反应的饱和浓度¹²。共进行了四组实验。在所有试验中，1 µM肾上腺素可逆性地抑制了子宫的自发性运动活性（图2）。

为了量化生殖道的自发性运动，我们设计了一种算法，用于评估小鼠生殖道上两个选定位置之间欧氏距离的平均变化速率。点位的追踪通过 MATLAB 软件的运动追踪模块实现。用于计算欧氏距离的相应 MATLAB 脚本已在在线补充材料

讨论

本文介绍了一种评估整个啮齿类动物生殖道自发收缩功能的方法，该生殖道包括卵巢、输卵管、子宫角和阴道。我们曾采用类似方法证明了去氧肾上腺素对子宫自发运动的舒张作用¹³，但过去无法对数据进行定量分析。在本研究中，我们开发了一种基于MATLAB运动追踪模块的定量运动数据分析算法。该技术可用于检测调控子宫收缩功能的新药，无论这些药物是松弛还是收缩子宫平滑肌。该模型的主要优势在于生殖道结构保持完整，从而保留了所有固有的子宫内细胞相互作用。值得注意的是，本实验方案无需任何特殊设备。子宫的分离操作可通过简单的放大镜完成，且无需复杂的视频记录设备。若无高分辨率数码相机用于成像，也可使用个人手机摄像头作为替代。

评估生殖道运动功能方案中最关键的步骤是获取有活性的子宫组织。子宫角内的子宫肌层是生殖道中具有运动功能的部分。因此，在分离过程中应避免过度拉伸或挤压子宫角。在整个实验过程中，还需确保子宫组织充分供氧，以维持其收缩活性。防止子宫角受损的最佳方法是在清洗子宫或移动生殖道时，仅接触其周围的结缔组织。由于阴道在实验过程中不会自发收缩，因此在将生殖道从一个培.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸肾上腺素	Sigma-Aldrich	E4642
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）	Fisher Scientific	17-512Q
200 proof 乙醇	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
异氟烷，USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
解剖用超细尖精密镊子	Fisher Scientific	13-812-42
弯曲硬化精细虹膜剪	Fine Science Tools	14091-09
高性能模块化解剖体视显微镜	Leica	MZ6
带主动冷却系统的500万像素彩色数字显微相机	Leica	DFC425 C
Stereomaster 显微镜光纤光源	Fisher Scientific	12-562-21
称量皿	Fisher Scientific	WB30304
Convertors Astound 标准外科手术服	Cardinal Health	9515	小号、中号或大号
手套	McKesson Corporation	20-1080	小号、中号或大号；无粉无菌乳胶或丁腈外科手套
培养皿	Corning Falcon	351029	100 mm
培养皿	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2-5% CO2 气体混合物	Praxair	MM OXCD5-K
耳挂式口罩	Valumax International	5430E-PP
2420万像素单反相机	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	版本 2019 或更高