用于评估小鼠生殖道自发性的方法和用于数据分析的基于 MATLAB 的 Uterus 运动跟踪算法

作为主要的女性器官，子宫对生殖至关重要，对胎儿的滋养^{至关重要。}子宫由三层组成:围膜、肌膜和子宫内膜。子宫是子宫的主要收缩层，在胎儿分娩中起着关键作用。子宫内膜是子宫腔内层，是胚胎植入所必需的。在育龄非怀孕女性中，子宫内膜层在月经周期开始时每月脱落。肌膜通过维持从^子宫1清除坏死子宫内膜组织所需的自发肌膜收缩，帮助这个脱落过程。

不幸的是，增加肌膜收缩性可能导致负面的副作用，如月经失调，或月经痉挛疼痛。这一点在年轻女性和无义女性2中尤为见义勇为。然而，月畸症是不同的每个妇女，并取决于其肌膜收缩的强度;更强的收缩通常与严重痉挛^{的感觉3。}子宫收缩性可以用子宫超声可视化，通常被认为是子宫内膜波。在经子宫内膜脱脂的子宫内，月经4期间前列腺素的增强释放被认为有助于增加肌膜超收缩能力，导致子宫肌肉缺血和缺氧，从而增加疼痛³.

严重的月经失调会妨碍一些妇女的日常活动，3%至33%的妇女有非常剧烈的疼痛，这可能导致妇女卧床1至3天，每个月经周期5。不分年龄、国籍、^{经济地位，}发育迟症是育龄妇女妇科发病的主要原因。在5^岁妇女中，月食症的发病率估计很高，而且变化很大，从45%到93%不等。 与肌痛有关的疼痛对女性的日常生活有影响，并可能导致青少年学习成绩差、睡眠质量降低、日常活动受限和情绪变化5。

许多患有严重肌痛的妇女使用非处方药来缓解疼痛。这种非处方药含有环氧酶（COX）抑制剂，可防止前列腺^素6的形成。然而，COX抑制剂与不良心血管事件有关，约18%的患有心内病的妇女对这些^抑制剂7没有反应。因此，需要新的药物来减少月经痉挛。由于子宫过度收缩有助于肌张力障碍的发病机制，一个可能的策略可能是使用子宫松弛剂。

在自然发生的自发性宫外波样收缩模型中，量化潜在松弛药物的影响是有益的。然而，到目前为止，还没有有效的外体方法测试肌肉松弛药物在完整的子宫。目前，等轴测张力测量用于评估松弛药物效果。在此类测量期间，子宫肌肉条在组织浴中的预负荷下保持恒定长度，而子宫肌肉收缩的力在存在或不存在松弛药物的情况下，在催产素刺激之前和之后被记录。虽然这种方法非常有用，但它需要昂贵的设备。此外，等轴测收缩与自然发生在完整子宫中的自发肌膜波状收缩不相像。无独有偶，当整个生殖道（卵巢、输卵管、子宫和阴道）保持在缓冲溶液中时，啮齿动物的子宫肌膜波可以形象化为子宫角运动。在这里，我们提出了一个前体方法，用于监测放置在含有含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中的完整小鼠子宫的自发性。我们还介绍了利用 MATLAB 运动跟踪器的运动量化算法。这种新方法提供了一种简单和更便宜的替代方法，以测试自然存在的补救措施和合成化合物的松弛潜力。

印第安纳大学医学院（印第安纳波利斯，IN）机构动物护理和使用委员会批准了所有动物程序。该研究使用了2-5个月大的F2-129S-C57BL/6性成熟雌性小鼠。

警告:在使用动物和生物危险材料时，应佩戴实验室外套、面罩和手套，确保安全。

1. 解决方案准备

1. 准备克雷布斯缓冲液，其中包含:130 mM NaCl， 5 mM KCl， 2mM CaCl 2， 1.2m NaH₂PO₄， 0.56 mM MgCl_2，25 mM NaHCO_3，和 5 mM 葡萄糖， pH 7.4.用含有 5% CO₂和 95% O₂的压缩气体混合物连续给 Krebs 缓冲液进行氧制，同时使用循环水浴将缓冲温度保持在 37°C。
2. 准备Dulbeco的磷酸盐缓冲盐（DPBS），其中包含:2.68 mM KCl，1.47 mM KH₂PO_4，136.89 mM NaCl， 和 8.1mM Na₂HPO₄， pH 7.4.

2. 动物准备

1. 使用吸入胶质对小鼠进行麻醉（3%）用废气清理。通过评估戒断反射，确保充足的麻醉。捏住后脚趾，确认没有引起任何运动，表明反射反应的丧失。在深度麻醉后，通过斩首使动物安乐死。
   注:肌胶质可能导致平滑肌肉扩张。因此，在开始活体实验之前，应在克雷布斯缓冲液中广泛清洗和孵育至少15-30分钟。当肌胶与皮肤接触时，可能导致刺激和不适，因此请小心操作。
2. 将尸体放在一艘用纸巾衬里的大称重船上。
   注:怀孕的雌性实验室人员不应参与肌胶的实验，因为它可以减少胎儿体重，减少胎儿骨骼增白，增加自然流产^{的风险8，9。}_CO2吸入可作为小鼠安乐死的替代物。

3. 确定最小循环阶段

1. 用小钳子，抬起，进入阴道，并缓慢地将含有10μL DPBS 的微移液器尖端插入阴道。
   1. 确保微移液器尖端以 10 - 30° 的角度插入骨器，以避免刺穿阴道壁。插入后，液体在尖端仍可见。如果液体不可见，尖端插入阴道太远，阴道的副颈椎区域可能已被穿孔。
   2. 用微移液器的尖端轻轻拉下阴道骨质肌肉，让空气从阴道流出。
2. 用 10 μL DPBS 上下移液 2-3 次，缓慢冲洗阴道腔，并将绘制的细胞悬浮液放在玻璃幻灯片上。
3. 使用倒置相位对比显微镜通过细胞学分析确定最经济周期阶段。该过程如其他部分10、11所述完成。在进行细胞学分析之前，确保细胞悬浮液不会变干。如有必要，可用新鲜的 DPBS 稀释悬架。

4. 小鼠生殖道分科

1. 将鼠标排列在上摆位置，并展开其四肢以暴露腹腔位。
2. 用70%乙醇喷雾润湿和消毒腹腔。
3. 使用钳子，小心地抬起位于优越的皮肤。对下腹部区域的横向进行小横向切口，至上肢以暴露腹膜（图1A）。在此过程中，将形成外部活门。随着小切口的不断制造，活门的大小会增大。
4. 小心地穿过围肠，露出胃肠道 （图1B）。需要注意的是，子宫角通常可以直接位于围肠下，因此小心切口，不要接触角，因为这会影响子宫运动。
5. 使用钳子，去除覆盖胃肠道的筋膜和脂肪组织。从腹腔中取出以下胃肠道段:十二指肠、麻黄体、、上升和横结肠（图 1C ）。
6. 要定位生殖器官，首先识别膀胱（图1C，"4"），由于安乐死后空隙，膀胱可能出现消减。阴道将正好在膀胱下面。
7. 在阴骨（胆度到膀胱）的汇合处定位阴囊。
8. 使用剪刀，通过体间纤维素组织小心地在其侧侧进行切口，从而去除阴唇，以获得阴道提取的途径并提供途径（图1D）。
9. 穿过和下部的阴膜。
10. 使用钳子，抬起阴道，慢慢切除直肠。
11. 识别两个子宫角，分叉，罗斯到阴道。在每个喇叭末端找到一个卷曲的输卵管和卵巢，这可能隐藏在剩余的胃肠道段下。使用小型解剖剪刀去除任何连接和支撑腹腔内角、输卵管和卵巢的韧带。
12. 从腹腔中取出生殖道，包括阴道、子宫、输卵管和卵巢。
13. 将孤立的生殖道（图1E）转移到一个100毫米培养皿中，里面装满了10mL的DPBS。不要压缩子宫角，以免损坏子宫。
14. 使用钳子和手术剪刀去除子宫角和阴道周围的任何结缔和脂肪组织，以及阴区任何可能妨碍图像质量的毛皮。去除宽韧带，使子宫角活动。
15. 用新鲜的DPBS清洗分离的生殖道两次，并将其转移到一个35毫米的培养皿中，里面装满了3mL的含氧克雷布斯溶液。

5. 组织成像

1. 将含有生殖道的培养皿置于含氧克雷布斯缓冲液的黑表面上。将盘子保持在室温下。
   注:可以使用红外加热垫将组织保持在37°C。
2. 允许15-30分钟开始自发收缩。使用任何类型的数字视频设备，从轴向平面记录 10 分钟的自发子宫运动。
3. 将制剂转移到含有含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中，并辅以测试化合物。使用任何类型的数字视频设备，从轴向平面记录大约 10 分钟的自发子宫运动。
4. 用10mL的DPBS洗净整个生殖道，用10mL的DPBS评估治疗的可逆性。
5. 将制剂转移到带有新鲜含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中。使用任何类型的数字视频设备，从轴向平面记录大约 10 分钟的自发子宫运动。
6. 将制剂转移到另一个35毫米培养皿中，里面装满了含氧Krebs缓冲液，并辅以车辆作为测试化合物，以确保自发子宫运动没有机械引起的变化。这是一个重要的控制。
7. 将视频素材传输到计算机硬盘驱动器。

6. 数据分析

1. 使用包含控制、处理和洗涤剧集的原始视频素材中的任何视频编辑软件制作剪辑。
2. 使用 MATLAB 软件和提供的脚本（请参阅在线补充材料）量化自发子宫运动。
   注:必须安装 MATLAB 的计算机视觉工具箱加载项，脚本才能完全正常运行。
   1. 打开 MATLAB 脚本，转到"编辑器"选项卡，然后单击"运行"。
   2. 选择第一个视频文件，然后单击"打开"。
   3. 在弹出对话框中输入视频文件的标签，然后单击"确定"。
   4. 输入计算喇叭移动速率所需的时间间隔（+ 欧氏距离/μs）。
   5. 使用鼠标光标在视频的第一帧上选择两个点。弹出窗口将要求确认所选点应用于跟踪。单击"开始"以启动将在弹出窗口中显示的实时跟踪过程。或者，单击"重新选择点"以重新选择两个点。
   6. 监视弹出窗口上的跟踪过程的准确性。
   7. 在新的弹出窗口中观察速率与时间散点图和距离与时间散点图。通过选择"文件 |在同一窗口中保存 As 以记录数据。
   8. 在 MATLAB 脚本所在的同一目录中查找名为PointTrackerData的文件夹，该文件夹由 MATLAB 自动创建。在两个单独的工作表选项卡中标识名为label_数据的数据，其中包含从视频收集的数据点。
      注:任何替代运动跟踪软件都可用于量化自发性子宫运动。
3. 使用适当的软件（例如 Excel 或 SigmaPlot 13）执行统计分析。

图1显示了本协议中描述的在整个生殖道隔离过程中拍摄的代表性图像。为了避免用毛皮污染缓冲液，这会降低视频质量，我们用70%的乙醇滋润了小鼠身体。协议解剖部分的主要基准是查找膀胱。子宫和阴道将位于低于膀胱。

为了测试这个方案，我们用肾上腺素治疗了整个生殖道。肾上腺素是众所周知的，导致子宫平滑肌肉放松。这种激素在肾上腺髓素中产生，在哺乳动物中充当应激激素。我们在实验中使用了1μM肾上腺素。这是一个饱和浓度已知导致最大反应12。进行了四个实验的系列。在所有试验中，1 μM肾上腺素可逆地抑制自发性子宫运动（图2）。

为了量化生殖道的自发性，我们设计了一种算法，使我们能够评估小鼠生殖道上两个选定点之间欧几里得距离的平均变化率。使用 MATLAB 软件的运动跟踪模块跟踪点位置。MATLAB 的相应脚本（我们用于计算欧几里得距离）在在线补充材料中提供。点的位置对于成功的运动跟踪过程至关重要。应仔细考虑视频的质量，因为来自培养皿墙壁的光反射可能会分散运动跟踪器的注意力，并且可能会停止跟踪喇叭运动，同时将点重新分配给其中一个光思考。我们选择在喇叭中间放置其中一个点，以确保它离培养皿壁反射足够远。第二点通常是在阴道上选择的，因为它没有表现出自发性运动。图 3提供了数据分析示例，补充图 1显示了在运动跟踪过程中获取的代表性图像。

图 1:整个生殖道隔离的步骤。（A） 在皮肤中切开，腹膜球区暴露在腹膜 （1） 之上。（B） 膜缓慢打开以暴露胃肠道 （2）。（C） 胃肠道已被移动以暴露子宫角 （3）。膀胱 （4） 可在喇叭连接附近可视化。（D） 子宫角已被释放，阴唇 （5） 的侧侧已切开，以暴露阴道 （6）。（E） 去除孤立的生殖道并放入DPBS溶液中。任何多余的毛皮或结缔组织被移除。（F） 切除直肠后（左，7），在阴道（右）上可以看到深深的缩进。（G） 周围的结缔组织被移除.数码相机和应用套件软件（3.7.0 版）用于在解剖过程中获取实时图像（相机设置:色调 20/饱和度 80）。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:显示了整个孤立生殖道的代表性实验。这些图像在 （A） 期间和 （C） 应用 1 μM 肾上腺素之前拍摄 15 s。在没有肾上腺素的情况下，生殖道制剂在A组和C组表现出高运动性，但在B面板中，它处于静止状态，存在1μM肾上腺素。未经编辑的视频片段作为补充视频 1-3提供。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3: 所述前体实验中的数据分析图 2.（A） 显示了欧几里得距离变化率的时间过程.在自发子宫运动期间确定距离的参考点在内动中显示为绿点。这些点选择在阴道的近端部分和子宫角的中间部分，如所示。蓝色填充圆圈在添加肾上腺素之前显示自发运动速率值，红色圆圈在 1 μM 肾上腺素存在时显示自发运动速率，绿色填充圆圈显示冲洗后的自发运动速率。（B） 在添加肾上腺素（蓝色条形）之前，在存在 1 μM 肾上腺素（红色条形）时，在洗涤后（绿色条）中，欧氏平均距离变化率（像素/s）的比较。MATLAB软件用于量化子宫运动。*t 间隔设置为 5 s。"+距离"计算为初始帧距离和帧距离 5 s 之间的差值。统计分析使用 Kruskal-Wallis 对等级差异的单向分析进行，然后根据 Dunn 的方法使用 SigmaPlot 13 执行所有对多比较过程。星号表示与其他实验数据集明显不同的数据集（P = <0.001）。请点击此处查看此图的较大版本。

补充电影1:延时视频剪辑显示自发子宫运动之前添加1μM肾上腺素。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。

补充电影2:延时视频剪辑显示自发子宫运动时，克雷布斯缓冲液补充1μM肾上腺素。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。

补充电影3:延时视频剪辑显示冲洗后自发的子宫运动。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。

补充图1:运动跟踪过程中每15周拍摄一次的代表性图像。请点击此处查看此图的较大版本。

补充材料:基于 MATLAB 的跟踪算法脚本。请点击此处下载此文件。

作者没有什么可透露的。