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方法文章

通过电穿孔递送Cas9蛋白-gRNA复合物直接敲除蝾螈脊髓神经干细胞中的基因

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DOI：

10.3791/59850

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2019年7月9日

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2The Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在墨西哥钝口螈脊髓中进行时空限制性基因敲除的实验方案，即通过将CAS9-gRNA复合物注射到脊髓中央管后，进行电穿孔处理。

摘要

墨西哥钝口螈具有完全再生其脊髓的独特能力。这主要归因于室管膜细胞在其一生中始终保持为神经干细胞（NSCs），在脊髓损伤后能够增殖以重新形成室管膜管，并分化为丢失的神经元。解析这些神经干细胞如何在发育完成后仍保持多能性，并在脊髓损伤后增殖以精确重建损伤前的结构，将有助于深入了解哺乳动物脊髓可能的再生机制以及潜在的治疗策略。在特定时间段内对特定亚群的神经干细胞进行基因敲除，可研究这些再生过程背后的分子机制，同时避免发育干扰效应带来的混淆。本文描述了一种利用CRISPR-Cas9系统在墨西哥钝口螈脊髓神经干细胞中实现基因敲除的方法。通过将CAS9-gRNA复合物注射至脊髓中央管，随后进行电穿孔，可在预定时间点对脊髓特定区域的神经干细胞中的目标基因实现敲除，从而允许在再生过程中对脊髓神经干细胞进行分子层面的研究。

引言

大多数脊椎动物的脊髓在受伤后无法再生，导致永久性残疾。然而，包括蝾螈（如墨西哥钝口螈）在内的某些物种是显著的例外。墨西哥钝口螈能够完全再生出结构相同的脊髓，并彻底恢复脊髓功能。这种强大的再生能力主要归因于室管膜细胞。这些细胞排列在中央管周围，与哺乳动物不同，墨西哥钝口螈的室管膜细胞在胚胎发育完成后仍保持为神经干细胞（NSCs）。在脊髓损伤后（例如尾部截断），这些神经干细胞会增殖，以重新生长室管膜管，并分化以替代丢失的神经元1,2,3。揭示墨西哥钝口螈脊髓神经干细胞如何在损伤后维持多能性并被激活，可为开发针对人类患者的新治疗策略提供重要信息。

由于CRISPR-Cas9基因敲除技术的进步，进行基因敲除以解析基因功能变得更加简便，并已在多种物种中展现出广泛的应用性，包括墨西哥钝口螈4,5,6,7,8。近期发布的完整墨西哥钝口螈基因组和转录组数据，使得任何基因组位点均可被靶向，并能更准确地评估脱靶效应9,10,11,12,13,14。目前已开发出利用CRISPR-Cas9系统在墨西哥钝口螈中进行基因敲除和敲入的优化方案15。以CAS9蛋白-gRNA核糖核蛋白复合物（RNP）形式递送CRISPR-Cas9系统，已被证明比使用编码Cas9和gRNA的质粒更为高效4。这可能是因为RNP的尺寸小于质粒载体，能够立即造成DNA断裂，并保护gRNA免受RNA降解。此外，使用RNP可绕过转录和翻译过程，从而避免了当质粒元件来源于不同物种时可能出现的启动子强度和密码子使用偏好等问题。

功能缺失研究是探究目的基因潜在功能的常用方法之一。为了研究基因在再生过程中的功能，理想情况下应在损伤前立即进行基因敲除，以避免对发育过程产生影响。此外，基因敲除应仅限于神经干细胞（NSCs）及再生区域。若在所有NSCs中（包括大脑中的NSCs，这在Cre-LoxP系统中常见）进行靶基因敲除，可能会产生与再生无关的效应，从而干扰实验结果的解释。幸运的是，墨西哥钝口螈脊髓的结构为在NSCs中实现时间和空间限制性的基因敲除提供了独特的机会。脊髓中大多数NSCs均与中央管相接触，并构成了与中央管接触的细胞的绝大部分16,17。因此，将CAS9-gRNA复合物注射至中央管内，随后进行电穿孔，即可在特定时间将基因编辑工具递送至目标区域的脊髓NSCs4,18,19。本实验方案详细展示了该操作的实施过程，可实现对目标脊髓NSCs的高效基因敲除。随后进行相关分析，以研究基因敲除对再生过程及NSC行为的影响。

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方案

所有动物实验必须依照当地和国家关于动物实验的法规，并在获得相关机构审查委员会批准后进行。

1. 准备 CAS9-gRNA RNP 混合物

  1. 设计并合成gRNA。
    注意：有关gRNA的设计与合成，请参考其他已发表的文献，其中包括专门针对墨西哥钝口螈的研究15,20,21,22。
  2. 通过自行制备或商业购买的方式获取CAS9-NLS蛋白。
  3. 配制CAS9-gRNA混合物：将5 µg CAS9-NLS蛋白、4 µg gRNA、0.9 µL 10x CAS9缓冲液混合，并用无核酸酶的H2O定容至10 µL。若不立即使用，可将混合物分装后于-80 °C保存。

2. 准备用于电穿孔的琼脂糖平板

  1. 在1x DPBS中配制200 mL的2% (wt/vol)琼脂糖溶液。将溶液用微波炉加热溶解后，倒入直径10 cm的培养皿中，厚度约为10 mm（足够覆盖整个动物）。
  2. 让培养皿在室温下凝固。若不立即使用，应将培养皿置于4 °C保存。
  3. 使用外科手术刀在琼脂糖凝胶上切割出一条狭缝以固定尾部，一个用于容纳动物身体的凹槽，以及两个额外的凹槽用于放置电极（图1E）。
  4. 将培养皿放在冰上，并用预冷的1x DPBS加满至边缘。使用与制备培养皿相同的DPBS溶液，以确保实验装置中电导率的一致性。

3. 配置电穿孔仪

  1. 配置电穿孔仪。设置穿孔脉冲为一个70 V的双相脉冲，持续时间为5 ms，间隔为50 ms，无电压衰减。设置转移脉冲为四个40 V的双相脉冲，每个脉冲持续时间为50 ms，间隔为999 ms，电压衰减为10%。
  2. 将电极连接至电穿孔仪，并调节镊子电极间距为7 mm。在每次电穿孔操作之前及操作间隙，将电极浸入盛有DPBS的烧杯中。

4. 准备和装载显微注射玻璃毛细管

  1. 根据制造商的说明，在火焰式/棕色微量移液器拉制仪上进行梯度测试，以确定加热值。
  2. 使用以下参数拉制具有锥形末端的注射毛细管：加热 = 梯度测试值，拉力 = 100，速度 = 100，时间 = 100。
  3. 在体视显微镜下观察针头。使用精细镊子，以一定角度折断毛细管，使其形成斜面尖端。折断位置应足够细以靶向中央管，同时又足够坚固以刺穿皮肤。
    注意：当直径约为 20 µm 或脊髓直径的约 50% 时，可作为合适的起始点。可能需要多次尝试以获得最佳折断效果。
  4. 将快绿 FCF 溶液按 1:30 的比例加入 RNP 混合液中，并用 Microloader 移液器吸头将约 5 µL 注射混合液装入毛细管中。
  5. 将毛细管安装到气动泵上，使斜面尖端朝下。

5. 配置气动泵

  1. 配置气动泵。将持留压力设为 0.5 磅每平方英寸（psi），喷射压力设为 2 psi 持留，持续时间设为门控模式。
  2. 通过将毛细管浸入水滴中并踩下脚踏开关进行注射，测试毛细管和气动泵的设置。确保注射混合物以缓慢但稳定的速度流出。
  3. 如果注射混合物自发泄漏或水被吸入毛细管内，则调整持留压力。如果注射混合物流出过慢，可增加喷射压力或进一步折断毛细管尖端；如果注射速度过快，则降低喷射压力。

6. 将RNP混合物注射至脊髓

  1. 将墨西哥钝口螈置于 0.03% 的苯佐卡因溶液中麻醉至少 10 分钟。通过将动物在水中翻转至腹部朝上来检查其是否无反应。
  2. 使用环形镊子夹取动物，将其放置在硅胶基质上，使动物左侧朝上，尾部指向右侧。将注射部位置于体视显微镜视野中央（图 1A）。
  3. 调节显微操作仪，使毛细管从视野右侧以 60° 角进入（图 1B）。
  4. 识别脊髓和中央管（图 1C）。
    注：脊髓是位于脊索上方的管状结构。
  5. 对准中央管，向前移动毛细管，轻柔刺穿皮肤和肌肉，进入脊髓的中央管。毛细管移动应限制在微小步进范围内，因为脊髓紧位于尾部肌肉下方。
  6. 踩下并按住脚踏开关，将混合物注入中央管。观察 RNP 混合物是否沿中央管向两侧扩散形成蓝色线条，若出现此现象，则表明毛细管位置正确（图 1D）。
  7. 若未发生扩散，保持脚踏开关按下状态，同时轻微前后移动毛细管，直至 RNP 混合物开始进入。若毛细管被组织堵塞，可通过在水中施加较高压力排出内容物以清除堵塞。
  8. 调节排出压力，使其刚好足以促使 RNP 混合物在中央管内扩散，但又不至于过高而破坏组织结构。
  9. 持续按住脚踏开关，使注射混合物沿中央管进一步扩散，直至到达脊髓末端的终室以及脑室内的脑室腔。
    注：此过程可能需要长达 2 分钟，具体时间取决于动物大小。可能需要在一段时间后适当增加压力，以促使 RNP 混合物进入脑室。
  10. 注射成功后应尽快进行电穿孔操作。

7. 电穿孔

  1. 用持针器将动物转移至预冷的琼脂糖电穿孔板上（图1E），置于冰上。将尾部放入切口内，使其被琼脂糖夹在中间（图1F）。
  2. 将电极插入尾部两侧的孔中。确保整个动物和电极均被冰冷的PBS覆盖。
  3. 踩下脚踏开关以启动电穿孔。
  4. 电穿孔完成后，将动物放回水中。
  5. 如有需要，继续注射其他动物。
  6. 在麻醉作用消退后，检查经电穿孔处理的动物是否健康，并确认尾部无损伤。

8. 评估基因敲除效率

  1. 固定电穿孔动物的尾部，对尾部进行横切，随后进行免疫组织化学染色，以评估基因敲除在蛋白水平的效率。
    注意：如果在电穿孔后进行尾部截除，可利用截下的尾部组织用于此目的。使用针对Gfp或Tyrosinase的gRNA进行电穿孔的动物, 例如，可作为阴性对照4.
  2. 或者，可提取经电穿孔的脊髓组织并进行裂解以获取DNA。随后进行基因分型PCR，再通过Sanger测序或高通量测序分析编辑基因位点的比例15.
    注意：由于包含了未电穿孔的细胞以及缺乏与中央管腔顶接触因而无法接收到RNP混合物的神经元，所得到的编辑效率将低估NSCs的实际编辑效率。

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结果

将针对Sox2的CAS9-gRNA复合物注射并电穿孔至墨西哥钝口螈脊髓中央管后，导致大多数脊髓神经干细胞（NSCs）中SOX2免疫反应信号显著丧失，以针对酪氨酸酶（Tyrosinase, Tyr）的gRNA作为对照（图2A）。B3-微管蛋白（由TUJ1标记）是神经元的标志物，在NSCs中不表达，而中央管周围SOX2阴性且TUJ1阴性的细胞被视为携带Sox2基因缺失的细胞。定量分析显示，通过CAS9-Sox2-gRNA电穿孔可在大量NSCs中实现Sox2基因敲除（图2B），表明该方法可在脊髓神经干细胞中实现高效且广泛渗透的基因敲除。

在对具有泛表达GFP的转基因墨西哥钝口螈（CAGGS-GFP）同时进行注射和电穿孔后，分别针对Sox2和Gfp的两种CAS9-gRNA复合物的混合物导致双基因敲除...

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讨论

本方案可在墨西哥钝口螈脊髓的神经干细胞（NSCs）中实现时间和空间限制性的基因敲除。当前方案能够在特定的时间和位置对NSCs进行高效且特异的靶向操作。该方法避免了使用Cre-LoxP系统时可能产生的非预期效应，例如在脑部等其他区域NSCs中发生基因敲除所引发的问题。同时，该方案也规避了持续性基因敲除所导致的发育期影响，从而能够专注于研究基因在再生过程中的功能。此外，本方案可在野生型动物中直接实施，无需等待构建额外的转基因墨西哥钝口螈品系（Cre-LoxP系统所必需），显著缩短实验周期。该方法还具备同时敲除多个基因的灵活性，并具有高效的编辑穿透率，可在F0代动物中直接开展实验。重要的是，已有证据表明，该操作对尾部和脊髓的再生过程无明显可观测的不良影响4。

使用CAS9蛋白-gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物的效率也显著高于使用Cas9和gRNA表达质粒的系统4。这可能是由于RNP复合物的尺寸小于质粒，以及哺乳动物系统来源的质粒中密码子使用差异影响了CAS9蛋白的表达。此外...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 Elly M. Tanaka 教授的持续长期支持。本工作得到了国家自然科学基金（NSFC）项目（317716）、华南师范大学科研启动基金（S82111 和 8S0109）以及中国博士后科学基金项目（2018M633067）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Sigma-AldrichA9539
苯佐卡因Sigma-AldrichE1501-100G
0.03% (wt/vol) 苯佐卡因溶液将500 ml 10× TBS、500 ml 400% (wt/vol) Holtfreter’s 溶液和30 ml 10% (wt/vol) 苯佐卡因储备液混合，用dH₂O定容至10 L。该溶液可在室温下保存长达6个月。
10% (wt/vol) 苯佐卡因溶液将50 g苯佐卡因溶于500 ml 100% (vol/vol) 乙醇中。该溶液可在室温下保存长达12个月。
硼硅酸盐玻璃毛细管，外径1.2 mm，内径0.94 mmStutter Instrument BF120-94-8
CaCl2·2H2OMerck102382
CAS9缓冲液，10x将200 mM HEPES和1.5 M KCl溶于无RNase的水中，调节pH至7.5。过滤除菌后分装，于−20 °C保存，最长可保存24个月。
CAS9-NLS蛋白  PNA BioCP03
细胞培养皿，10 cmFalcon351029
Dumont #5 精细镊子Fine Scientific Instruments11254-20
电穿孔仪Nepa Gene NEPA21
BEXPulse Generator CUY21EDIT II
亮蓝FCFSigma-AldrichF7252-5G
5x 亮蓝FCF溶液将12.5 mg亮蓝FCF粉末溶于10 mL 1× PBS中。
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 Stutter Instrument P-97
400% (wt/vol) Holtfreter’s 溶液 将11.125 g MgSO4·7H₂O、5.36 g CaCl2·2H₂O、158.4 g NaCl和2.875 g KCl溶于10 L dH₂O中。该溶液可在室温下保存长达6个月。
KClMerck104936
MgSO4·7H2OMerck105886
微量移液器加样头（Microloader）Eppendorf5242956003
显微操作仪 NarishigeMN-153 
NaClMerck106404
气动PicoPumpWorld Precision Instruments SYS-PV830
环形镊子Fine Scientific Instruments11103-09
体视显微镜OlympusSZX10 
Tris碱Sigma-AldrichT6066
Tris缓冲盐水，10x将24.2 g Tris碱和90 g NaCl溶于990 ml dH₂O中，加入10 ml 37% (vol/vol) HCl调节pH至8.0。该溶液可在室温下保存长达6个月。
带可调间隙的镊子式双圆铂电极，直径10 mmNepa Gene CUY650P10

参考文献

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