本文介绍了利用壳聚糖薄膜培养人牙周膜（PDL）细胞球体的实验方案。三维（3D）细胞球体培养提供了一种替代传统组织培养聚苯乙烯（TCPS）培养系统的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
牙周膜（PDL）细胞在牙周组织再生方面具有广阔的应用前景。传统上，PDL细胞在二维（2D）基质（如组织培养用聚苯乙烯，TCPS）上进行培养。然而，在体外培养过程中已观察到PDL细胞出现特征性改变。这一现象可能是由于2D TCPS与体内三维（3D）微环境存在差异所致。与在2D基质上培养的细胞相比，在3D微环境中生长的细胞更接近体内状态的细胞。因此，3D细胞培养模型为传统的2D单层细胞培养提供了一种极具前景的替代方案。为了改进传统的PDL细胞培养模型，我们近期开发了一种基于壳聚糖薄膜上PDL细胞形成球状体的3D细胞培养方法。本文详细介绍了基于壳聚糖薄膜的细胞球状体培养方案。PDL细胞球状体的3D培养系统克服了传统2D单层细胞培养的一些局限性，因此可能适用于制备具有更高治疗效能的PDL细胞，用于未来的牙周组织再生。
引言
牙周炎主要由牙菌斑引发1，其特征是牙周组织（包括牙周膜（PDL）、牙槽骨和牙骨质）的破坏。目前对牙周炎的治疗通常能有效阻止活动性疾病的进展，但已丧失的牙周组织的再生仍是临床难题。近年来，在基于细胞的牙周组织再生策略方面取得了重要进展，以克服现有治疗方法的局限性2,3,4。
我们之前的系统性综述表明，牙周膜细胞在牙周组织再生方面具有巨大潜力5。传统上，牙周膜细胞在二维（2D）基质（如组织培养用聚苯乙烯，TCPS）上进行培养。然而，在体外培养过程中已观察到牙周膜细胞出现特征性改变6。这一现象可能是由于2D TCPS与体内三维（3D）微环境存在差异所致7。与在2D基质上培养的细胞相比，在3D微环境中生长的细胞更接近体内状态的细胞8。因此，3D细胞培养模型为传统的2D单层细胞培养提供了一种极具前景的替代方案。
传统的三维培养方法是将细胞包埋于三维生物材料中。与包埋在三维生物材料中的细胞相比，细胞球体因由细胞聚集形成且不依赖外来材料生长，能更接近地模拟体内环境9,10,11,12。已有报道指出，细胞球体可通过保留纤连蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质（ECM）成分，促进间充质干细胞（MSC）的生物学活性13。为了改进传统的牙周膜细胞（PDL细胞）培养模型，我们近期开发了一种基于壳聚糖薄膜上PDL细胞形成球体的三维培养方法14。球体形成可增强PDL细胞的自我更新能力及成骨分化潜能14。本文提供了基于壳聚糖薄膜的PDL细胞球体培养的详细实验方案。该PDL细胞三维球体培养体系克服了传统组织培养聚苯乙烯表面（TCPS）培养方式的一些局限性，因此可能适用于制备具有更强治疗效能的PDL细胞，用于未来的牙周组织再生。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
该研究方案已获得同济大学口腔医学院/口腔医院伦理委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书。
1. PDL 细胞分离
- 制备牙周膜细胞（PDL细胞）增殖培养基：在α-MEM培养基中添加10%胎牛血清（FCS）和100 U/mL青霉素-链霉素溶液（pen/strep）。
- 准备一个装有冰的容器，用于转运分离的第三磨牙。
- 使用高压灭菌器对手术器械进行灭菌处理。
- 在同济大学口腔医学院附属口腔医院牙科诊所，从成年患者（18–28岁）中拔除正常的阻生第三磨牙。
- 将第三磨牙放入增殖培养基中，并在4 °C条件下转运至实验室。
- 将拔除的牙齿置于无菌的100 mm培养皿中，在生物安全型超净工作台内操作。
- 加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗牙齿，重复清洗步骤两次。
- 使用无菌手术刀轻轻分离牙根表面的牙周膜。
注意：应从牙根中三分之一区域刮取牙周膜，以避免牙龈组织或根尖组织的污染。 - 借助无菌刀片将牙周膜组织切成1–2 mm大小的组织碎片。
- 将牙周膜组织碎片放入T-25培养瓶中，加入3–4 mL增殖培养基。
- 将培养物置于37 °C、5% CO2及湿润空气的培养箱中进行培养。
- 当观察到牙周膜细胞开始向外生长时，更换培养基。牙周膜细胞通常需要1–2周时间开始外生长，可通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况。
- 此后每周更换培养基两次。
- 当牙周膜细胞达到汇合状态时，按1:4比例进行传代培养（第一代）。
- 每日观察细胞生长情况，并每周更换培养基两次。
- 后续每次传代均在细胞达到80%汇合度后按1:4比例进行。用于细胞接种的牙周膜细胞应选用第三代至第五代细胞。
2. 壳聚糖薄膜的制备
- 配制1% (v/v) 乙酸溶液时，将5 mL乙酸加入495 mL双蒸水中，置于洁净的玻璃烧杯中混合。
- 配制1% w/v 壳聚糖溶液时，称取5 g壳聚糖粉末（平均分子量400 kDa，脱乙酰度85%），加入495 mL的1% (v/v) 乙酸溶液中。
- 将配制好的溶液置于60 °C条件下，使用磁力搅拌子和磁力搅拌器连续搅拌24小时。
- 将配制好的溶液进行高压灭菌，以确保壳聚糖完全溶解。
注意：实验可在此步骤暂停。 - 为制备壳聚糖薄膜，将1% w/v 壳聚糖溶液以0.25 mL/cm2的量加入组织培养级聚苯乙烯（TCPS）培养皿中。例如，在24孔板的一个孔中加入0.5 mL的1% w/v 壳聚糖溶液。
- 将TCPS培养皿置于60 °C烘箱中干燥24小时，以形成壳聚糖薄膜。
- 配制0.5 N氢氧化钠（NaOH）溶液。将10 g NaOH分批少量加入大量双蒸水中，使用磁力搅拌子搅拌溶解，然后定容至0.5 L。
注意：必须将NaOH加入水中，切勿将水加入固体NaOH中。切勿直接接触NaOH，因其可能引起化学灼伤。 - 用0.5 N NaOH溶液中和壳聚糖薄膜。在24孔板的一个孔中加入0.5 mL 0.5 N NaOH溶液，作用2小时。
- 用双蒸水清洗壳聚糖薄膜三次。
注意：实验可在此步骤暂停。 - 在接种细胞前，将涂覆壳聚糖的24孔板置于70%乙醇中，在室温下过夜灭菌。
- 在室温下用PBS冲洗涂覆壳聚糖的培养板三次。
- 将涂覆壳聚糖的培养板在室温下经紫外光照射过夜，进行灭菌处理。
3. 细胞接种
- 将增殖培养基 PBS 溶液和胰蛋白酶/EDTA 溶液预热至 37 °C。
- 弃去 T-75 细胞培养瓶中的上清液。
- 用 10 mL PBS 溶液洗涤汇合的 PDL 细胞。
- 弃去 PBS 溶液。
- 向 T-75 细胞培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液。
- 在 37 °C 下，用胰蛋白酶/EDTA 溶液孵育细胞 3 分钟。
- 向 T-75 细胞培养瓶中加入 3 mL 增殖培养基，终止胰蛋白酶的消化作用。
- 将制备好的细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
- 在室温下，以 300 x g 离心 5 分钟。
- 弃去 15 mL 圆锥形离心管中的上清液，并将细胞沉淀重悬于 500 µL 增殖培养基中。
- 使用血细胞计数板对 PDL 细胞进行计数。
- 以 0.5 x 104、1 x 104、3 x 104 和 6 x 104 个细胞/cm2 的密度接种 PDL 细胞。
- 将 PDL 细胞在壳聚糖膜上接种后，置于含 5% CO2 的湿润空气中，于 37 °C 培养箱中培养。
- 此后每周更换两次培养基。
- 在第 1、2、3、4 和 5 天，每天通过倒置相差显微镜观察细胞形态。
4. 细胞存活率
- 培养 1、3 和 6 天后，使用商用细胞活力/细胞毒性检测试剂盒测定细胞存活率。
- 在 15 mL 离心管中，将 2 mM 钙黄绿素-AM 和 4 mM 碘化丙啶同型二聚体溶于 PBS 中，配制 2 mL 新鲜溶液，涡旋混匀 5 秒。
注意：操作过程需避光。 - 移除培养基，并用 PBS 清洗类球体。
- 将类球体置于含 2 mM 钙黄绿素-AM 和 4 mM 碘化丙啶同型二聚体的 PBS 中，在室温下避光孵育 30 分钟。
- 用 PBS 漂洗类球体两次。对于来自 24 孔板一个孔的类球体，每次使用 2 mL PBS。
- 使用荧光显微镜观察样品，放大倍数为 10× 或 20×。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
采用本实验方案，成功形成了具有活性的牙周膜细胞球体。图1显示，在壳聚糖膜上主要观察到悬浮的细胞或细胞球体，而非贴壁细胞。当接种密度为0.5 × 104 cells/cm2时，在第1天和第3天偶尔可见贴壁的牙周膜细胞，而牙周膜细胞球体极少被观察到。相反，当接种密度为3 × 104 和 6 × 104 cells/cm2时，自第1天起即可观察到不同大小的牙周膜细胞球体。在培养3天后，所有接种密度下均可见牙周膜细胞球体的形成。如图1所示，接种密度为3 × 104 cells/cm2时，牙周膜细胞球体的大小较为均一，因此该密度为最佳接种密度。培养5天后，所有接种密度下均形成了更大的细胞球体，而在第5天几乎未见悬浮的牙周膜细胞。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究介绍了一种三维细胞培养系统，以克服与传统二维单层细胞培养相关的一些局限性。根据该方案，通过在壳聚糖膜上培养细胞，成功形成了牙周膜（PDL）细胞球。我们之前的研究报道，细胞球的形成可增强PDL细胞的自我更新能力及成骨分化能力14。与使用酶从组织培养聚苯乙烯表面（TCPS）收获细胞不同，PDL细胞球只需通过移液数次即可从壳聚糖膜上轻松收获14。因此，细胞外基质（ECM）和细胞间连接得以良好保存。
本方案的关键步骤包括：（1）确保手术器械和壳聚糖薄膜已灭菌，适用于细胞培养；（2）从牙根中三分之一部分刮取牙周膜组织，以避免来自牙龈或根尖组织的污染；（3）需要较高的细胞接种密度（≥3 × 104 个细胞/cm2），以实现牙周膜细胞成功形成球状体。
然而，该方法的一个局限性在于，牙周膜细胞在形成球状体后增殖能力下降14，这一现象与之前在脂肪基质细胞...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金（NSFC 81700978）、中央高校基本科研业务费专项资金（1504219050）、上海市自然科学基金（17ZR1432800）和上海市医学探索项目（17411972600）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| 细胞培养瓶 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| 细胞培养瓶 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| 壳聚糖 | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | 分子量 500 kDa，脱乙酰度 85% |
| 胎牛血清（FCS） | Gibco | 26140-079 | |
| 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit） | Molecular Probes | L3224 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| 青霉素-链霉素溶液（pen/strep） | Gibco | 15140-122 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Corning | 430790 | |
| 24 孔板 | Corning | 3524 |
参考文献
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
