本文介绍了利用壳聚糖薄膜培养人牙周膜（PDL）细胞球体的实验方案。三维（3D）细胞球体培养提供了一种替代传统组织培养聚苯乙烯（TCPS）培养系统的方法。
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本文内容
摘要
摘要
牙周膜（PDL）细胞在牙周组织再生方面具有广阔的应用前景。传统上，PDL细胞在二维（2D）基质（如组织培养用聚苯乙烯，TCPS）上进行培养。然而，在体外培养过程中已观察到PDL细胞出现特征性改变。这一现象可能是由于2D TCPS与体内三维（3D）微环境存在差异所致。与在2D基质上培养的细胞相比，在3D微环境中生长的细胞更接近体内状态的细胞。因此，3D细胞培养模型为传统的2D单层细胞培养提供了一种极具前景的替代方案。为了改进传统的PDL细胞培养模型，我们近期开发了一种基于壳聚糖薄膜上PDL细胞形成球状体的3D细胞培养方法。本文详细介绍了基于壳聚糖薄膜的细胞球状体培养方案。PDL细胞球状体的3D培养系统克服了传统2D单层细胞培养的一些局限性，因此可能适用于制备具有更高治疗效能的PDL细胞，用于未来的牙周组织再生。
引言
牙周炎主要由牙菌斑引发1，其特征是牙周组织（包括牙周膜（PDL）、牙槽骨和牙骨质）的破坏。目前对牙周炎的治疗通常能有效阻止活动性疾病的进展，但已丧失的牙周组织的再生仍是临床难题。近年来，在基于细胞的牙周组织再生策略方面取得了重要进展，以克服现有治疗方法的局限性2,3,4。
我们之前的系统性综述表明，牙周膜细胞在牙周组织再生方面具有巨大潜力5。传统上，牙周膜细胞在二维（2D）基质（如组织培养用聚苯乙烯，TCPS）上进行培养。然而，在体外培养过程中已观察到牙周膜细胞出现特征性改变6。这一现象可能是由于2D TCPS与体内三维（3D）微环境存在差异所致7。与在2D基质上培养的细胞相比，在3D微环境中生长的细胞更接近体内状态的细胞8。因此，3D细胞培养模型为传统的2D单层细胞培养提供了一种极具前景的替代方案。
传统的三维培养方法是将细胞包埋于三维生物材料中。与包埋在三维生物材料中的细胞相比，细胞球体因由细胞聚....
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方案
该研究方案已获得同济大学口腔医学院/口腔医院伦理委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书。
1. PDL 细胞分离
- 制备牙周膜细胞（PDL细胞）增殖培养基：在α-MEM培养基中添加10%胎牛血清（FCS）和100 U/mL青霉素-链霉素溶液（pen/strep）。
- 准备一个装有冰的容器，用于转运分离的第三磨牙。
- 使用高压灭菌器对手术器械进行灭菌处理。
- 在同济大学口腔医学院附属口腔医院牙科诊所，从成年患者（18–28岁）中拔除正常的阻生第三磨牙。
- 将第三磨牙放入增殖培养基中，并在4 °C条件下转运至实验室。
- 将拔除的牙齿置于无菌的100 mm培养皿中，在生物安全型超净工作台内操作。
- 加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗牙齿，重复清洗步骤两次。
- 使用无菌手术刀轻轻分离牙根表面的牙周膜。
注意：应从牙根中三分之一区域刮取牙周膜，以避免牙龈组织或根尖组织的污染。 - 借助无菌刀片将牙周膜组织切成1–2 mm大小的组织碎片。
- 将牙周膜组织碎片放入T-25培养瓶中，加入3–4 mL增殖培养基。
- 将培养物置于37 °C、5% CO2及湿润空气的培养箱中进行培养。
- 当观察到牙周膜细胞开始向外生长时，更换培养基。牙....
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结果
采用本实验方案，成功形成了具有活性的牙周膜细胞球体。图1显示，在壳聚糖膜上主要观察到悬浮的细胞或细胞球体，而非贴壁细胞。当接种密度为0.5 × 104 cells/cm2时，在第1天和第3天偶尔可见贴壁的牙周膜细胞，而牙周膜细胞球体极少被观察到。相反，当接种密度为3 × 104 和 6 × 104 cells/cm2时，自第1天起即可观察到不同大小的牙周膜细胞球体。在培养3天后，所有接种密度下均可见牙周膜细胞球体的形成。如图1所示，接种密度为3 × 104 cells/cm2时，牙周膜细胞球体的大小较为均一，因此该密度为最佳接种密度。培养5天后，所有接种密度下均形成了更大的细胞球体，而在第5天几乎未见悬浮的牙周膜细胞。
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讨论
本研究介绍了一种三维细胞培养系统，以克服与传统二维单层细胞培养相关的一些局限性。根据该方案，通过在壳聚糖膜上培养细胞，成功形成了牙周膜（PDL）细胞球。我们之前的研究报道，细胞球的形成可增强PDL细胞的自我更新能力及成骨分化能力14。与使用酶从组织培养聚苯乙烯表面（TCPS）收获细胞不同，PDL细胞球只需通过移液数次即可从壳聚糖膜上轻松收获14。因此，细胞外基质（ECM）和细胞间连接得以良好保存。
本方案的关键步骤包括：（1）确保手术器械和壳聚糖薄膜已灭菌，适用于细胞培养；（2）从牙根中三分之一部分刮取牙周膜组织，以避免来自牙龈或根尖组织的污染；（3）需要较高的细胞接种密度（≥3 × 104 个细胞/cm2），以实现牙周膜细胞成功形成球状体。
然而，该方法的一个局限性在于，牙周膜细胞在形成球状体后增殖能力下降14，这一现象与之前在脂肪基质细胞.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金（NSFC 81700978）、中央高校基本科研业务费专项资金（1504219050）、上海市自然科学基金（17ZR1432800）和上海市医学探索项目（17411972600）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| 细胞培养瓶 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| 细胞培养瓶 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| 壳聚糖 | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | 分子量 500 kDa，脱乙酰度 85% |
| 胎牛血清（FCS） | Gibco | 26140-079 | |
| 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit） | Molecular Probes | L3224 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| 青霉素-链霉素溶液（pen/strep） | Gibco | 15140-122 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Corning | 430790 | |
| 24 孔板 | Corning | 3524 |
参考文献
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodo....
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