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方法 体内 新生仔猪臂丛神经生物力学测试

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DOI：

10.3791/59860

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2019年12月19日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Widener University, 2School of Biomedical Engineering, Science and Health Systems, Drexel University

本文内容

摘要

本文介绍了一种在新生猪模型中对臂丛神经进行体内生物力学测试的方法。

摘要

新生儿臂丛神经麻痹（NBPP）是一种在分娩过程中发生的牵拉性损伤，累及位于颈部和肩部区域的神经丛，统称为臂丛（BP）。尽管产科护理近年来取得了进展，但NBPP问题仍然是全球性的健康负担，发病率为每1000例活产中有1.5例。此类损伤较严重的形式可导致从肩部向下延伸至整个手臂的永久性瘫痪。预防和治疗NBPP需要深入了解新生儿臂丛神经在受到牵拉时的生物力学与生理反应。目前对新生儿臂丛的认识主要基于成年动物或尸体臂丛组织的研究，而非来自活体新生儿臂丛组织的数据。本研究描述了一种用于在新生仔猪中开展活体生物力学测试的体内机械测试装置及操作流程。该装置由夹具、驱动器、测力传感器和摄像系统组成，可施加并监测直至组织断裂为止的体内应变与载荷。摄像系统还可实时观察断裂发生的位置。总体而言，该方法可实现对新生儿臂丛在牵拉条件下详细的生物力学特性表征。

引言

尽管产科领域取得了近期进展，但由于臂丛神经复合体受到牵拉损伤而导致的新生儿臂丛麻痹（NBPP）问题仍然是全球性的健康负担，其发病率为每1000例活产中有1.5例1,2。相关的风险因素可能来自母体（如体重过度增加、妊娠期糖尿病、子宫异常、既往臂丛神经麻痹史）、胎儿（如胎儿巨大症）或分娩过程本身（如肩难产、产程延长、使用产钳或真空吸引器助产、臀位分娩3）。尽管在某些情况下这些并发症不可避免，但预防和治疗NBPP需要深入了解新生儿臂丛神经在受到牵拉时所表现出的生物力学和生理学反应。

关于臂丛神经（BP）的生物力学研究多采用成年动物和人类尸体组织，其结果存在显著差异4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。由于臂丛神经复合组织的生物力学特性具有重要的临床意义，亟需建立一种新生动物模型以及体内生物力学测试方法。此外，在复杂的真实分娩场景中研究臂丛神经牵拉损伤存在诸多局限性，这增加了对计算机模型的依赖，后者可提供用于分析各种分娩并发症及助产技术影响的研究手段。这些模型临床相关性的关键在于其生物保真度（即对人体反应的模拟程度）。目前Gonik等16和Grimm等17建立的计算模型依赖于兔和大鼠的神经组织，而非新生个体的臂丛神经组织。在具有临床相关性的新生动物模型中开展体内生物力学测试，有望填补新生儿臂丛神经数据缺失的关键空白。

本研究介绍了一种用于对3至5日龄雄性约克夏新生仔猪进行生物力学测试的体内机械测试装置及操作流程。该装置由夹具、执行器、测力传感器和摄像系统组成，可在破坏过程中施加并监测体内的应变和载荷。摄像系统还可用于监测破裂时的破坏位置。总体而言，该系统能够对新生仔猪的臂丛（BP）在受到拉伸时进行详细的生物力学表征，从而提供其在体内发生机械性破坏时的临界应变和应力值。所获得的数据可进一步改善现有计算模型对人体生物力学行为（生物保真度）的模拟，这些模型旨在研究与新生儿臂丛神经损伤（NBPP）相关的分娩场景中内外源性力对臂丛拉伸的影响。

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方案

德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会批准了所有程序（#20704）。

1. 动物到达与适应

  1. 仔猪到达后，将1–2日龄的仔猪隔离至少24小时。
  2. 将仔猪饲养在清洁并消毒过的不锈钢笼子（36英寸×48英寸×36英寸）中，垫以白杨木屑，并自由饲喂仔猪代乳粉。
  3. 维持室温在85 °F，以确保热中性环境。

2. 实验当天

  1. 实验前 2 小时撤除饲料。
  2. 对仔猪进行肌肉注射氯胺酮（10–40 mg/kg）/赛拉嗪（1.5–3.0 mg/kg，肌内注射），并通过转运箱将其运送至手术区域。

3. 麻醉的诱导与维持

  1. 通过鼻罩给予4%异氟烷与氧气混合的吸入麻醉剂，并通过检测角膜反射和回缩反射消失来确认动物已深度麻醉。
  2. 将动物置于仰卧位进行气管插管，使用喉镜（直型镜片）辅助将气管插管（直径2.5–2 mm）插入气管。
  3. 固定气管插管后，将动物连接至呼吸机。
  4. 确保仔猪接受异氟烷（0.25%–3%维持浓度）、氧气和氧化亚氮的混合气体。
  5. 给予芬太尼（10 μg/kg）一次剂量，并每1–2小时重复给药一次，以维持充分的镇痛和镇静深度，避免因动物移动造成气管插管移位的风险。
  6. 在皮下腹静脉或其他任何外周静脉建立静脉（IV）通路。
  7. 通过股动脉建立动脉通路。此操作可采用无创方式或切开暴露法完成。

4. 监测与护理

  1. 通过确认角膜反射消失以及对脚趾夹捏无回缩反应，监测麻醉深度。
  2. 在麻醉期间及整个实验过程中持续监测生理参数，包括动脉血压、心电图（ECG）、呼气末 CO2、脉搏血氧饱和度和体温。
  3. 每 0.5–1 小时监测一次血气和血糖，并根据需要为麻醉时间超过 1 小时的动物给予静脉输液（50% 葡萄糖和 50% 生理盐水），输液速率约为 100 cc/kg/天，以维持正常血糖水平。
  4. 密切且频繁地监测动物的麻醉状态。必要时给予镇痛剂和/或增加吸入麻醉剂用量。
  5. 通过调节呼吸机参数和药物剂量，维持动物正常的氧张力以确保常氧状态，然后将动物置于温度可控的循环水毯上，使实验期间体温维持在 39 °C 的正常水平。

5. 臂丛神经手术

  1. 按照第3节所述方法进行适当麻醉后，将动物仰卧位固定于手术台上，上肢外展，暴露腋窝区域。
  2. 使用任何外科手术巾覆盖动物。采用清洁但非无菌的操作技术。
  3. 沿气管表面的皮肤和筋膜做正中切口（使用#10刀片），向下至胸骨上三分之一处，对应脊柱C3–T3节段，以暴露脊柱两侧的臂丛复合体。
  4. 使用镊子和止血钳从胸骨上切迹开始，沿锁骨边缘向两侧水平延长切口至臂部，注意保留头静脉和贵要静脉。
  5. 使用剪刀和镊子进行钝性分离，游离上下皮瓣，分别暴露臂丛的颈段和胸段区域。
  6. 识别C2椎体轴线及T1水平的第一肋。以这些解剖标志为参考，定位下三个颈椎（C6–C8）及第一胸椎（T1）的椎间孔，随后仔细观察臂丛，寻找分支处的分叉结构（M形），以实现充分暴露。
  7. 在上述分叉处靠近脊柱侧、位于分叉上方的臂丛区域，使用神经环标记为“根/干”（root/trunk）；在分叉下方、靠近肢体侧的区域标记为“束”（chord），后接具体神经名称。

6. 生物力学测试

  1. 生物力学测试装置的设置
    注意： 设计并制造了一种定制的机械测试装置，用于对 BP 进行体内拉伸（图1）。
    1. 将装置底座固定在推车上。
    2. 使用大型C型夹将电动执行器固定在底座上。该执行器可提供150磅的力，10"行程，以及15 mm/s的速度。速度可降低至0.2 mm/s并仍能正常工作。
    3. 将200 N的载荷传感器连接到执行器上。
    4. 将一个夹具（螺纹旋入式）连接到载荷传感器上，该夹具包含带衬垫的有机玻璃，以防止夹持部位产生应力集中。
    5. 将相机安装在三脚架上。确保相机具备以658 x 4926像素分辨率、每秒120帧（f/s）的速度进行录像的能力。
    6. 将来自相机、执行器和载荷传感器的USB线缆连接至计算机，以集成并同步整个装置的所有组件。
    7. 将计算机、执行器和载荷传感器接入电源。
  2. 在记录施加载荷之前，对载荷传感器进行校准。操作步骤如下：
    1. 使用可调节手柄将执行器设置为90°角，并用量角器检查角度。
    2. 打开与载荷传感器配套的软件（材料表）。点击开始按钮以显示电压的实时读数。
    3. 从装置上悬挂0–1000 g范围内的砝码，以100 g为增量，依次悬挂在夹具上，并记录测得的电压值。
    4. 通过计算斜率（m）和截距（b），求得电压与重量之间的线性方程。可使用电子表格程序及其内置的斜率函数，根据下方公式1计算b值。将下方所示的公式2输入机械装置的控制代码中。
      公式1：b = y - mx
      其中：y为重量，x为电压，m为斜率，b为截距（常数）。
      公式2：y = mx + b
      其中：y为重量，x为电压，m为斜率，b为常数。
  3. 测试：切断BP神经，并使用定制夹具将其固定在测试装置上。
    1. 使用精细剪刀切断BP神经。
    2. 如图1所示，将BP神经的切断端固定在定制夹具中。
    3. 手动将黑色丙烯酸颜料或印度墨水涂抹在被夹持的BP段上（图2）。
    4. 在动物体内平放一个校准网格（即1 cm刻度尺），用于设定数据分析的尺度。
    5. 使用相机软件查看相机是否正对测试段上方，从而实时监测标记物的运动/位移，并在任意时间点确定实际组织应变。
    6. 记录初始测量数据，包括神经从桌面插入身体的高度、夹具距桌面的高度、执行器的角度以及组织的全长。
    7. 打开编程软件（包含图形用户界面[GUI]的表格，如图3所示）。
    8. 点击运行按钮启动GUI。
    9. 点击初始化按钮对系统进行初始化。
    10. 点击去皮按钮对系统进行归零。
    11. 按下开始测试按钮以拉伸BP段。该操作将以500 mm/min的指定速率拉动组织，直至BP任一段发生完全断裂。该拉伸速率的选择依据现有文献4,8,18。程序同时保存视频文件、施加的拉伸载荷、组织位移以及测试持续时间。
    12. 记录断裂位置，即组织破裂的点。
  4. 安乐死：实验结束后，通过静脉注射致死剂量的戊巴比妥（120 mg/kg）对仔猪实施安乐死。
  5. 数据分析：使用运动追踪软件分析测试过程中获取的视频。
    1. 在运动追踪软件中选择文件 | 打开视频文件，以打开实验中的视频文件。
    2. 使用校准网格，在运动追踪软件中设置比例尺：使用直线工具画线，画完后右键点击该线，选择校准测量，并输入已知的厘米数值（图4）。
    3. 在运动追踪软件中追踪组织上的标记物：右键点击视频，选择轨迹路径，将标记物中心与组织上的标记对齐，并持续追踪至破裂为止。
    4. 选择文件导出至电子表格，导出标记物的x和y坐标，以便用于应变计算。
    5. 将数据导入编程软件，用于计算随时间变化的x和y坐标之间的距离，进而计算应变。
    6. 通过将距离变化除以原始距离（并校正拉伸过程中倾斜角度的变化），计算每个时间点的应变值。实际应变值在每个时间点的每对相邻标记之间确定，并同时计算这些应变的平均值。

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结果

代表性载荷-时间曲线以及来自臂丛神经（BP）四个节段（位于四个标记点之间）的应变数据分别如图5和图6所示。测得的断裂载荷为8.3 N，平均断裂应变为35%，反映了新生个体臂丛神经在拉伸作用下的生物力学响应。神经的不同区域所经历的应变程度不同，表明沿神经长度方向损伤分布不均。摄像数据可确定断裂位置位于椎间孔近端。

带有载荷传感器和夹具的致动器；用于力测量的静态平衡实验装置。
图 1：体内力学测试装置的详细结构，包括致动器、载荷传感器和夹具。

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讨论

现有文献中关于牵拉对BP组织生物力学响应的研究，在阈值范围和方法学上均表现出较大的差异性4,6,8,18,19,20,21,22,23. 已发表结果的差异可能源于组织处理方法的不同（例如，固定的 与 未固定的组织）、测量伸长率的方法学差异以及所用物种的不同。此外，这些数据均来自成年动物或人类尸体，而非新生儿。由于伦理原因，难以获取活体人类新生儿的力学数据，因此可采用在解剖结构上与人类相似的大型动物模型进行替代研究。仔猪是一...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所，项目编号为 R15HD093024，以及美国国家科学基金会职业奖，编号为 1752513。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Omega微型张力传感器 &和压缩负荷传感器OmegaLCM201-200N200N 负载传感器
Basler acA640-120uc 相机巴塞尔acA640-120uc
反馈线性执行器Progressive AutomationsPA-14P10" 中风，150磅力，15毫米/秒速度
运动追踪软件KinoveaN/A开源
编程软件 - MATLABMathworksN/A版本 2018A
手术器械
镊子Fine Science Tools 公司11006-12 和 11027-12 或 11506-12
止血钳Fine Science Tools 公司13009-12
剪刀Fine Science Tools 公司14094-11 或 14060-09

参考文献

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