一种准确高效分析植物microRNA转录组的生物信息学流程

摘要

一种名为miRDeep-P2（简称miRDP2）的生物信息学分析流程，采用了更新的植物miRNA标准并重构了算法，能够准确高效地分析植物中的microRNA转录组，尤其适用于基因组复杂且庞大的物种。

摘要

microRNA（miRNA）是一类长度为20至24个核苷酸（nt）的内源性小RNA（sRNA），广泛存在于植物和动物中，在转录后水平上对基因表达起着重要的调控作用。过去十年中，通过高通量测序（NGS）方法对sRNA文库进行测序已被广泛用于鉴定和分析miRNA转录组，从而极大地促进了miRNA的发现。然而，随着sRNA测序文库深度的增加以及植物基因组在大小和复杂性上的提升，植物miRNA注释面临两个主要挑战。首先，许多其他类型的sRNA，特别是来自sRNA文库的短干扰RNA（siRNA），常被多种计算工具错误地注释为miRNA。其次，对于具有大而复杂基因组的植物物种，miRNA转录组的分析过程变得极为耗时。为应对这些挑战，我们近期将广泛使用的miRNA转录组分析工具miRDeep-P升级为miRDeep-P2（简称miRDP2），通过引入新的过滤策略、全面优化打分算法，并整合最新更新的植物miRNA注释标准。我们在五种基因组复杂性逐步增加的代表性植物——拟南芥、水稻、番茄、玉米和小麦的sRNA测序数据上测试了miRDP2。结果表明，miRDP2能够以极高的效率完成这些分析任务。此外，在灵敏度和准确性方面，miRDP2的表现优于其他预测工具。综上所述，我们的研究结果证明miRDP2是一种快速且准确的植物miRNA转录组分析工具，有助于科研界更精准地完成植物miRNA的注释工作。

引言

过去二十年中，生物学领域最令人振奋的发现之一是sRNA在调控基因组多种功能方面日益凸显的作用¹。其中，miRNA是真核生物中一类重要的20至24个核苷酸长度的sRNA，主要作为关键的基因调控因子，在整个生命周期的发育阶段以及对刺激和胁迫反应中发挥转录后水平的调控作用^2,3。在植物中，miRNA来源于被称为pri-miRNA的初级转录本，这些转录本通常由RNA聚合酶II作为独立的转录单位进行转录^4,5。pri-miRNA通过进化上保守的细胞机制（动物中为Drosha RNase III，植物中为DICER-like蛋白）进行加工，被剪切为直接的miRNA前体pre-miRNA，后者包含可形成分子内茎环结构的序列^6,7。随后，pre-miRNA被进一步加工为双链中间产物，即miRNA双链体（miRNA duplex），由具有功能的成熟miRNA链和较少发挥功能的互补链miRNA*组成^2,8。成熟miRNA被装载到RNA诱导的....

方案

1. 安装与测试

1. 下载所需的依赖项：Bowtie2²² 和 RNAfold²³。建议使用已编译的软件包。
   1. 从其官网（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）下载读段比对工具 Bowtie2。
   2. 从 http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/ 下载 Vienna 软件包中的 RNAfold 工具，用于预测 RNA 二级结构。
   3. 在安装 miRDP2 之前，请确保这两个依赖项已正确安装，并自定义 bash 环境文件（例如 .bashrc），为这两个依赖项设置正确的 PATH。
      注意：其他比对工具（如 Bowtie²⁴）也适用于 miRDP2；自版本 1.1.3 起，Bowtie 或 Bowtie2 均可使用。
2. 要下载 miRDP2 软件包，请访问 ....

结果

本文所述的miRNA注释流程miRDP2应用于来自5种植物物种的10个公开sRNA-seq文库，这些物种的基因组长度逐步增加，包括Arabidopsis thaliana、Oryza sativa（水稻）、Solanum lycopersicum（番茄）、Zea mays（玉米）和Triticum aestivum（小麦）（图1A）。总体而言，对每个物种，选择来自不同组织的两个代表性sRNA文库（合并为唯一序列，详见方案部分）及其索引的基因组序列作为两种输入数据（表1）。为进行比较，选用了五种miRNA计算预测工具：miRDeep-P¹³、miRPlant²⁵、miR-PREFeR²⁶、miRA²⁷和miReNA

讨论

随着下一代测序技术（NGS）的发展，从多种物种日益增长的小RNA测序数据中已鉴定出大量miRNA位点^29,30。在集中管理的社区数据库miRBase²¹中，过去十年间收录的miRNA条目几乎增长了100倍。然而，与动物miRNA相比，植物miRNA具有许多独特特征，使得其鉴定和注释更为复杂^13,14。

首先，植物miRNA前体在长度和结构上具有更高的变异性（补充文件2）¹⁶。与动物miRNA前体相对均一的长度（约70–90 nt）不同，植物前体的长度可相差数倍，甚至可达数百nt^13,31。这种差异在预测mi.......

材料

本文使用的材料清单

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计算机/计算节点	N/A	N/A	需要 Perl；建议至少 8 GB 内存和 100 GB 存储空间