通过亲和层析联合蛋白质印迹或质谱法鉴定肌醇磷酸或磷脂酰肌醇相互作用蛋白

摘要

本方案重点在于鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。该方法采用亲和层析技术，将生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇通过链霉亲和素固定于琼脂糖或磁珠上。通过蛋白质印迹（Western blotting）或质谱分析来鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。

摘要

肌醇磷酸盐和磷脂酰肌醇在真核生物中调控多种细胞过程，包括基因表达、囊泡运输、信号转导、代谢以及发育。这些代谢物通过与蛋白质结合，改变蛋白质的构象、催化活性和/或相互作用，从而发挥其调控功能。本文所述方法结合亲和层析与质谱或蛋白质印迹技术，用于鉴定与肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇相互作用的蛋白质。将肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇通过化学方法标记上生物素，随后利用与琼脂糖或磁珠偶联的链霉亲和素进行捕获。蛋白质因其对代谢物的结合亲和力而被分离，再经洗脱后通过质谱或蛋白质印迹进行鉴定。该方法流程简单，具有高灵敏度、非放射性、无需脂质体且可定制化，能够精确分析蛋白质与代谢物之间的相互作用。该策略可用于无标记或氨基酸标记的定量质谱方法中，以鉴定复杂生物样品或纯化蛋白质中的蛋白质-代谢物相互作用。本实验方案已针对Trypanosoma brucei的蛋白质分析进行了优化，但也可适用于相关原生动物寄生虫、酵母或哺乳动物细胞。

引言

肌醇磷酸盐（IPs）和磷脂酰肌醇（PIs）通过调控基因表达^1,2,3、囊泡运输⁴、信号转导^5,6、代谢^7,8,9以及发育^8,10等细胞过程，在真核生物生物学中发挥核心作用。这些代谢物的调控功能源于其与蛋白质相互作用并进而调节蛋白质功能的能力。当与蛋白质结合时，IPs 和 PIs 可能会改变蛋白质构象¹¹、催化活性¹²或相互作用¹³，从而影响细胞功能。IPs 和 PIs 分布于多种亚细胞区室中，例如细胞核^2,3,14,15、内质网^16,17、质膜¹和细胞质¹⁸，可与蛋白质^3,19或RNA²⁰结合存在。

磷脂酶C对膜结合型PI(4,5)P2的切割可释放出Ins(1,4,5)P3，后者可分别被IP激酶和磷酸酶磷酸化或去磷酸化。IPs是可溶性分子，能够与蛋白质结合并发挥调控功能。例如，在后生动物中，Ins(1,4,5)P3可通过结合IP3受体作为第二信使，诱导受体构象改变，从而促使细胞内钙库释放Ca²⁺¹¹。Ins(1,3,4,5)P4可结合组蛋白去乙酰化酶复合物，调控蛋白质复合物的组装与活性¹³。其他IPs调控功能的例子包括染色质结构的调控²¹、RNA转运^22,23、RNA编辑²⁴以及转录调控^1,2,3。相比之下，PIs通常参与将蛋白质招募至质膜或细胞器膜²⁵。然而，PIs新近被发现的特性是其能够在非膜环境中与蛋白质相互作用^3,15,19,26。例如，类固醇生成因子这一核受体的转录调控功能受PI(3,4,5)P3的调节¹⁹，而多聚腺苷酸聚合酶的酶活性则受核内PI(4,5)P2的调控²⁶。IPs和PIs的调控作用已在多种生物中得到证实，包括酵母^22,27、哺乳动物细胞^19,23、Drosophila¹⁰和线虫²⁸。尤为重要的是这些代谢物在锥虫中的作用，锥虫在真核生物进化支系中较早分离。这些代谢物在Trypanosoma brucei中对转录调控^1,3、发育⁸、细胞器形成及蛋白质运输^29,30,31,32具有关键作用，同时也参与调控病原体T. cruzi^33,34,35、Toxoplasma³⁶和Plasmodium^5,37的发育与感染过程。因此，阐明IPs和PIs在锥虫中的功能，有助于揭示这些分子新的生物学作用，并为发现新的药物靶点提供线索。

蛋白质与肌醇多磷酸（IP）或磷脂酰肌醇（PI）结合的特异性取决于蛋白质相互作用结构域以及肌醇的磷酸化状态^13,38，尽管蛋白质也可与PI的脂质部分发生相互作用¹⁹。IP和PI的多样性及其修饰激酶与磷酸酶的存在，为调控蛋白质功能提供了一种灵活的细胞机制，该机制受到代谢物的可获得性与丰度、肌醇的磷酸化状态以及蛋白质相互作用亲和力的影响^1,3,13,38。尽管某些蛋白质结构域已被充分表征^39,40,41，例如pleckstrin同源结构域⁴²和SPX（SYG1/Pho81/XPR1）结构域^43,44,45，但仍有部分蛋白质通过尚未明确的机制与IP或PI相互作用。例如，布氏锥虫（T. brucei）的阻遏-激活蛋白1（RAP1）缺乏典型的PI结合结构域，却能与PI(3,4,5)P3结合，并调控参与抗原变异相关基因的转录³。通过对锥虫、酵母或哺乳动物细胞中与IP或PI相互作用的蛋白质进行亲和层析和质谱分析，已鉴定出多个缺乏已知IP或PI结合结构域的蛋白质^8,46,47。这些数据提示存在其他尚未被鉴定的蛋白质结构域可与这些代谢物结合。因此，鉴定与IP或PI相互作用的蛋白质可能揭示蛋白质-代谢物相互作用的新机制，并阐明这些小分子在细胞调控中的新功能。

本文所述方法结合亲和层析与蛋白质印迹或质谱技术，用于鉴定与肌醇多磷酸（IP）或多磷酸肌醇（PI）结合的蛋白质。该方法使用生物素标记的IP或PI，可通过交联至与琼脂糖微珠偶联的链霉亲和素进行捕获，或 alternatively 通过与链霉亲和素偶联的磁性微珠进行捕获（图1）。该方法提供了一种操作简便、灵敏度高、无需放射性标记、无需脂质体的实验流程，适用于检测细胞裂解液或纯化蛋白中与IP或PI结合的蛋白质³（图2）。该方法既可用于无标记^8,46分析，也可结合氨基酸标记的定量质谱技术⁴⁷，从复杂的生物样品中鉴定IP或PI结合蛋白。因此，该方法为目前可用于研究IP或PI与细胞蛋白相互作用的少数方法之一，将有助于阐明这些代谢物在锥虫乃至其他真核生物中的调控功能。

方案

1. 通过亲和层析和蛋白质印迹法分析IP-或PI-结合蛋白

1. 细胞生长、裂解与亲和层析
   1. 将 T. brucei 细胞培养至对数中期，并监测细胞活力和密度。每次结合实验使用 5.0 × 10⁷ 个细胞即可。
      1. 对于血液形态，将细胞在 HMI-9 培养基中（添加 10% 胎牛血清（FBS））于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养。维持细胞密度在 8.0 × 10⁵ 至 1.6 × 10⁶ 个细胞/mL 之间。
         注：细胞密度高于 1.8 × 10⁶ 个细胞/mL 可能影响细胞活力。T. brucei 427 菌株体外培养的倍增时间为 5.5 至 6.5 小时。
      2. 对于前循环形态，将细胞在 SDM-79 培养基中（添加 10% FBS）于 27 °C 培养，并维持细胞密度在 1.0 × 10⁷ 至 3.0 × 10⁷ 个细胞/mL 之间。
      3. 对于纯化蛋白（例如重组蛋白），取 0.5 至 1 µg 蛋白，加入 450 µL 结合缓冲液（25 mM HEPES，150 mM NaCl，0.2% 4-壬基苯基-聚乙二醇，pH 7.4）稀释。保留稀释后蛋白总量的 5%（上样对照）用于 Western 印迹分析。继续进行步骤 1.1.7。
   2. 在室温（RT）下以 1,600 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
      注：有关大体积培养物离心的更多信息，请参见步骤 2.1.2。
   3. 用 10 mL 预热至 37 °C 的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）加 6 mM 葡萄糖（PBS-G）轻柔重悬沉淀以洗涤细胞，随后在室温下以 1,600 × g 离心 5 分钟。重复该步骤两次。
   4. 将沉淀重悬于 1 mL PBS-G 中，转移至 1.5 mL 离心管，以 1,600 × g 在室温下离心 5 分钟，弃去上清液。
      注：细胞沉淀可迅速在液氮中冷冻，并储存在 -80 °C 或液氮中。
   5. 将沉淀重悬于 0.5 mL 裂解缓冲液（25 mM HEPES，150 mM NaCl，1% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，pH 7.4）中，该缓冲液需预先在冰上预冷，并添加 1.5× 蛋白酶抑制剂混合物和 1× 磷酸酶抑制剂混合物（材料表），以裂解细胞。在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育裂解液 10 分钟。
      注：此步骤至关重要，若未按指示操作，蛋白可能发生降解。必要时可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS/PAGE）检测蛋白裂解物的完整性。
      警告：t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇具有毒性，可引起皮肤和眼睛刺激。操作时需佩戴手套、眼罩和面罩。
   6. 在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 10 分钟，将上清液收集至新的 1.5 mL 离心管中用于结合实验。保留总裂解液的 5%（上样对照）用于 Western 印迹分析。上清液中含有用裂解缓冲液提取的寄生虫蛋白。
   7. 取 50 µL 与琼脂糖珠偶联的 IPs 或 PIs（即 50 µL 悬液）或 50 µL 琼脂糖珠，在 1,000 × g 下离心 1 分钟。弃去上清液，用 50 µL 结合缓冲液重悬以平衡珠子。使用未偶联的珠子作为对照。使用具有不同磷酸化构型的 IP/PI-珠（包括非磷酸化形式）以控制非特异性相互作用。
   8. 向细胞裂解液或纯化蛋白中加入 50 µL IP-或 PI-珠（每 1 mL 珠子含 10 nmol 偶联的 IPs 或 PIs）。IP-或 PI-珠的体积应控制在总裂解液体积的 10% 以内，必要时可用结合缓冲液调整结合反应总体积。
      1. 对于竞争实验，向结合反应中加入不同浓度的非偶联 IPs 或 PIs（例如，相对于 IP-或 PI-珠为 1-、10-、100-倍摩尔过量）。
   9. 在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育反应体系 1 小时或过夜。
      注：纯化蛋白的结合反应可根据蛋白稳定性在室温下进行。若使用仅与生物素偶联的 IPs 或 PIs，则仅进行步骤 1.1.9.1；否则进行步骤 1.1.10。
      1. 向结合反应中加入 50 µL 链霉亲和素偶联的磁珠，在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育 1 小时。
   10. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟，移除上清液（流穿液），保留沉淀。保留 5% 上清液用于 Western 印迹分析。
       注：若使用磁珠，可通过磁力架移除上清液并进行后续洗涤（无需离心）。
   11. 加入 1 mL 洗涤缓冲液（25 mM HEPES，300 mM NaCl，0.2% 4-壬基苯基-聚乙二醇，pH 7.4），通过轻敲或旋转离心管重悬树脂（避免使用移液器，以防珠子粘附在枪头上）。在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。重复该步骤共洗涤五次。
       警告：4-壬基苯基-聚乙二醇具有毒性，可引起皮肤和眼睛刺激。操作时需佩戴手套、眼罩和面罩。
   12. 向珠子中加入 50 µL 含 710 mM 2-巯基乙醇的 2× Laemmli 缓冲液，通过轻敲或涡旋混匀以洗脱蛋白。在 95 °C 加热 5 分钟，然后以 10,000 × g 离心 1 分钟，收集上清液（含洗脱蛋白）。或者，使用 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸（pH 2.9）洗脱蛋白以避免使用 SDS。将洗脱液在 -80 °C 冻存，或直接进行 Western 印迹分析。
       警告：2-巯基乙醇具有毒性，可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。操作时需佩戴手套并在通风橱中进行。
2. Western 印迹分析
   1. 将步骤 1.1.6 中的上样对照（input）或步骤 1.1.10 中的流穿液（flow-through）样品各取 15 µL，与 5 µL 4× Laemmli 缓冲液混合。将上样对照和流穿液样品在 95 °C 加热 5 分钟。对于用 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸（pH 2.9）洗脱的样品，取 15 µL 洗脱液与 5 µL 4× Laemmli 缓冲液混合，95 °C 加热 5 分钟。
      注：使用 2× Laemmli 缓冲液洗脱的样品无需此步骤。
   2. 在 4–20% SDS/PAGE 凝胶的加样孔中分别加入 2.5 µL 上样对照、2.5 µL 流穿液和 20 µL 洗脱样品，并根据制造商推荐加载蛋白分子量标记。
      注：根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。
   3. 在电泳缓冲液中以 150 V 电压运行 SDS/PAGE 30–45 分钟，或直至 Laemmli 缓冲液中的蓝色染料迁移至凝胶底部。
      注：运行时间可能因实验室设备而异。
   4. 将凝胶从玻璃（或塑料）板中取出，浸入转移缓冲液中 15 分钟。
   5. 将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素膜。将膜和 3 mm 滤纸浸入转移缓冲液中。组装“三明治”结构：三层滤纸、硝酸纤维素膜或 PVDF 膜、凝胶、再加三层滤纸。确保三明治中无气泡残留，必要时可用滚轮排除气泡。将膜置于转印夹的阴极侧，凝胶置于阳极侧。
      注：请参考膜制造商的说明书了解膜活化或转印前处理的相关信息。
   6. 将含“三明治”结构的转印夹放入含转移缓冲液的转印槽中，将槽置于冰浴或 4 °C 环境（如冷室）中。以 100 V 电压转移 1 小时（电流在 200–400 mA 之间变化）。或者，在 4 °C 下以 15 mA 恒定电流过夜转移。
   7. 从转印夹中取出膜，将其在含 0.05% 吐温 20 的 6% 脱脂奶粉 PBS 溶液（PBS-T）或兼容的封闭液中于室温孵育 1 小时以封闭膜。
      注：封闭前可用 Ponceau S 染色检测转印质量。将膜在 15 mL Ponceau S 溶液中孵育 1 分钟，用水冲洗后观察条带。
   8. 弃去封闭液，将膜在含一抗的 PBS-T 稀释液（含 6% 脱脂奶粉）中于室温以 50 rpm 转速旋转孵育 1 小时。或者，在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育过夜。
      注：孵育时间可能因抗体质量而异；但大多数抗体在室温下孵育 1–3 小时即可。请遵循制造商推荐的抗体浓度或稀释比例。
   9. 将膜在 PBS-T 中于室温以 50 rpm 转速旋转孵育 5 分钟进行洗涤。重复该步骤 3–5 次。根据抗体质量可能需要更多次洗涤。
   10. 将膜在含辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗的 PBS-T 稀释液（含 6% 脱脂奶粉）中于室温以 50 rpm 转速旋转孵育 1 小时。
       注：请遵循制造商推荐的抗体浓度或稀释比例。
   11. 按步骤 1.2.9 所述方法洗涤印迹膜。
   12. 加入化学发光底物覆盖膜表面。去除多余底物，在避光条件下室温孵育 5 分钟。
       注：请参考制造商说明书获取化学发光试剂的使用建议。
   13. 使用基于相机的成像系统捕获化学发光信号。或者，使用 X 光片捕获化学发光信号。

2. 通过亲和层析和质谱法分析 IP/PI 结合蛋白

1. 细胞生长、裂解及亲和层析
   1. 将 T. brucei 细胞培养至对数中期，并监测细胞活力和密度。
      注意：总共 1.0 × 10¹⁰ 个细胞足以进行两次结合实验。若使用的细胞数量少于建议值，可能会影响质谱检测低丰度蛋白的能力。
      1. 对于 T. brucei 血液形态，将细胞在 HMI-9 培养基（含 10% 胎牛血清）中于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养至对数中期（8.0 × 10⁵–1.6 × 10⁶ 个细胞/mL）。对于 427 菌株，5 L 培养液可获得 0.5–1.0 × 10¹⁰ 个细胞。监测细胞生长，避免细胞密度超过 1.8 × 10⁶ 个细胞/mL，否则可能影响细胞活力。细胞培养体积应保持为培养瓶总体积的 1/10；否则，由于通气不良，细胞生长速率将受到影响。
         注意：427 菌株的倍增时间为 5.5–6.5 小时。
      2. 对于前循环形态，将细胞在 SDM-79 培养基（含 10% 胎牛血清）中于 27 °C 培养，细胞密度维持在 1.0 × 10⁷ 至 3.0 × 10⁷ 个细胞/mL。500 mL 培养液可获得 0.5–1.5 × 10¹⁰ 个细胞。
   2. 在室温下以 1,600 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 200 mL 预热至 37 °C 的 PBS-G 中。使用圆底离心管（材料表），因为使用固定角度转子时，T. brucei 血液形态的沉淀容易被扰动。再次在室温下以 1,600 × g 离心 5 分钟。
   3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 10 mL PBS-G 中。在室温下以 1,600 × g 离心 5 分钟。重复该步骤，最后一次洗涤后弃去上清液。
      注意：沉淀可用液氮速冻，并保存于 -80 °C 或液氮中。
   4. 将细胞沉淀重悬于 5 mL 预冷的裂解缓冲液中（含 1.5× 蛋白酶抑制剂混合物和 1× 磷酸酶抑制剂混合物）（材料表）。将裂解物在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育 10 分钟。
   5. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟。收集上清液（可溶性蛋白），并将其稀释于 20 mL 结合缓冲液中。
   6. 取 400 µL 与琼脂糖珠偶联的 IPs 或 PIs（即 400 µL 悬液）或 400 µL 对照珠，在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，并用 400 µL 结合缓冲液重悬以平衡珠子。使用琼脂糖珠作为阴性对照，以确定蛋白-代谢物相互作用的特异性富集，排除非特异性结合（例如蛋白非特异性结合珠子）。使用具有不同磷酸化构型的 IPs 或 PIs（包括非磷酸化形式），以控制因磷酸电荷或生物素结合引起的非特异性相互作用。
   7. 将 400 µL IP/PI-珠或对照珠加入 10 mL 裂解液中，在 4 °C 下以 50 rpm 转速孵育 1 小时或过夜。若使用仅与生物素偶联（无珠）的 IPs 或 PIs，则进入步骤 2.1.7.1；否则进入步骤 2.1.8。
      1. 加入 100 µL 与链霉亲和素偶联的磁珠，在 4 °C 下以 50 rpm 转速孵育 1 小时。
   8. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟，移除上清液（流穿液），保留沉淀。保留 5% 上清液用于 Western blot 分析。
   9. 向沉淀中加入 5 mL 洗涤缓冲液，轻轻混匀（通过轻柔旋转离心管），然后在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟。弃去上清液。重复洗涤五次。若使用磁珠，则使用磁力架收集上清液并进行洗涤（无需离心）。
   10. 向珠子中加入 50 µL 2× Laemmli 缓冲液（或 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸 pH 2.9，以避免使用 SDS），通过轻弹或涡旋混匀（避免使用移液器，因为珠子可能粘附在枪头上），然后在 95 °C 加热 5 分钟。以 10,000 × g 离心 1 分钟，收集上清液（洗脱蛋白）。重复该步骤两次，共收集三个洗脱组分。
   11. 将洗脱液在 -80 °C 冻存，或立即进行 SDS/PAGE 分离，或保持在溶液中用于胰蛋白酶消化及质谱分析。
2. 用于质谱分析的蛋白质胰蛋白酶消化
   注意：本步骤提供两种操作方式，分别对应第 2.2.1 节（凝胶内）和第 2.2.2 节（溶液中）的蛋白质消化。建议使用低吸附蛋白管以防止样品损失。请咨询蛋白质组学平台的分析化学专家，确认该方案是否适用于您的样品及可用的质谱仪器。
   1. 凝胶内蛋白质胰蛋白酶消化
      1. 在 SDS/PAGE 分离蛋白质后，用高纯度水短暂冲洗凝胶。将凝胶转移至洁净的玻璃板上。使用洁净刀片切取蛋白条带，避免切取条带外多余的凝胶。将凝胶切成小块（约 1 mm 见方），并转移至 1 mL 离心管中。必要时可使用移液枪头，但需确保枪头在使用前用乙醇冲洗。
         注意：佩戴手套以避免凝胶污染。凝胶块可保存于 -20 °C。
      2. 向管中加入 100 μL 高纯度水或高效液相色谱级水冲洗凝胶块，弃去水。
         1. 对于考马斯亮蓝或钌基荧光染色的凝胶块，将凝胶块在脱色液（25 mM NH₄HCO₃ 溶于 50% 乙腈）中孵育 1 小时，然后弃去溶液。重复该步骤直至染色不可见。
            注意：NH₄HCO₃ 溶液应通过稀释 100 mM NH₄HCO₃ 储备液（pH 7.8）配制。
            警告：乙腈为挥发性溶剂，易燃且有毒。NH₄HCO₃ 可能引起皮肤或眼睛刺激。请佩戴手套并在通风橱中操作。
         2. 对于银染凝胶块，将凝胶块在 50 μL 银染脱色液（15 mM K₃[Fe(CN)₆]，50 mM Na₂S₂O₃）中孵育 30 分钟。弃去溶液，并用 200 μL 水洗涤凝胶块。重复洗涤五次或直至凝胶黄色不可见。
            警告：K₃[Fe(CN)₆] 可能引起皮肤或眼睛刺激。请佩戴手套。
      3. 使用 200 μL 乙腈在室温下脱水 10 分钟，然后弃去溶液。
         注意：脱水后的凝胶块体积更小，呈不透明且发黏。若多个凝胶块合并于同一管中，需重复该步骤以确保充分脱水。
      4. 加入 50 µL（或足以覆盖凝胶块的体积）还原液（10 mM 二硫苏糖醇 [DTT] 溶于 100 mM NH₄HCO₃），在 56 °C 孵育 1 小时。之后将管冷却至室温，并弃去多余的还原液。
      5. 加入 50 µL（或足以覆盖凝胶块的体积）烷基化液（50 mM 碘乙酰胺溶于 100 mM NH₄HCO₃），在室温避光孵育 30 分钟。之后弃去多余的烷基化液。
      6. 使用 200 μL 乙腈在室温下脱水 10 分钟，弃去乙腈，再用 100 mM NH₄HCO₃ 在室温下水化 10 分钟。
      7. 再次使用 200 μL 乙腈在室温下脱水 10 分钟，并弃去多余溶液。
      8. 加入 15 µL 质谱级胰蛋白酶（溶于 50 mM NH₄HCO₃ 缓冲液），或加入足以覆盖水化凝胶块的体积，在 37 °C 孵育 4 小时或过夜。胰蛋白酶总量应控制在 100 至 500 ng（或每微克蛋白使用 20 ng 胰蛋白酶）。
      9. 将样品冷却至室温，在微量离心机中以 2,000 × g 离心 1 分钟。加入 10–20 μL 5% 甲酸水溶液，室温孵育 10 分钟。
         警告：甲酸易燃、腐蚀性强且有毒。请佩戴手套并在通风橱中操作。
      10. 按步骤 2.2.1.9 所述离心，收集上清液（含提取的肽段）至另一管中。向原管中加入 20 μL 5% 甲酸溶于 50–60% 乙腈的溶液，室温孵育 10 分钟。将提取的肽段组分收集至同一管中。
      11. 在真空浓缩仪中干燥样品，用 10 μL 含 0.5% 乙酸和 2% 乙腈的溶液重新溶解，用于质谱分析。离心并将溶液收集至管底，于 -20 °C 或 -80 °C 保存。
   2. 溶液中蛋白质胰蛋白酶消化
      1. 沉淀蛋白质以减少样品体积、去除盐分并进行缓冲液置换。向样品中加入六倍体积的预冷（-20 °C）丙酮，例如向 100 μL 样品中加入 600 μL 丙酮。涡旋混匀，并在 -20 °C 孵育 15 分钟至 1 小时。溶液将变浑浊或形成沉淀。
         警告：丙酮有毒且易燃。请佩戴手套并在通风橱中操作。
      2. 在 4 °C 下离心 30 分钟。倾去丙酮，将沉淀在空气中干燥 15 分钟。
      3. 加入 10 µL 6–8 M 尿素或含 1% SDS 的 50 mM NH₄HCO₃ 溶液以溶解沉淀，并涡旋混匀。对于蛋白量较大（> 10 µg）的样品，可使用最多 20 µL 溶解缓冲液。
      4. 加入 5 µL 还原液并涡旋。使用微量离心机离心沉降液体。若样品溶于尿素，则在室温孵育 1 小时；若溶于 SDS，则在 56 °C 孵育 1 小时。
      5. 使用微量离心机离心沉降液体。加入 3 µL 烷基化液并涡旋。再次离心沉降，避光室温孵育 30 分钟。
      6. 加入 3 μL 还原液以中和反应。使用 50 mM NH₄HCO₃ 缓慢稀释样品至 1 M 尿素或 0.05% SDS。
         注意：胰蛋白酶消化缓冲液必须含有去垢剂或变性剂。变性剂的浓度限制如下：0.05% SDS；0.1% 正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷；0.1% 4-壬基苯基-聚乙二醇；0.1% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；0.1% 吐温 20；0.1% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐；< 1 M 尿素或硫脲。
      7. 加入 5 µL 质谱级胰蛋白酶（溶于 50 mM NH₄HCO₃ 缓冲液），在 37 °C 孵育 4 小时或过夜。胰蛋白酶总量应控制在 100 至 500 ng（或每微克蛋白使用 20 ng 胰蛋白酶）。
      8. 将样品冷却至室温，使用微量离心机离心沉降液体。加入 5% 乙酸（或 5% 甲酸溶于 50% 乙腈）以终止反应。
      9. 按步骤 2.2.1.11 所述在真空浓缩仪中干燥样品。样品保存于 -80 °C。使用反相柱（如 C18 Zip-tip）对肽段进行脱盐和浓缩，然后进行质谱分析。

结果

通过亲和层析和蛋白质印迹分析 RAP1 与 PI(3,4,5)P3 的相互作用
本示例说明了该方法在分析 RAP1 与磷脂酰肌醇（PIs）结合中的应用，所用样品为来自 T. brucei 裂解液或重组 T. brucei RAP1 蛋白的 RAP1。结合实验使用了表达血凝素（HA）标签 RAP1 的 T. brucei 血液形态虫体的裂解液。RAP1 是一种参与变异表面糖蛋白（VSG）基因转录调控的蛋白质^3,48，VSG 基因编码的表面蛋白通过抗原变异机制介导寄生虫的免疫逃逸⁴⁹。RAP1 在端粒蛋白复合物中与磷脂酰肌醇 5-磷酸酶（PIP5Pase）相互作用³，该酶也参与 VSG 基因的转录调控^1,3。RAP1 含...

讨论

鉴定与IPs或PIs结合的蛋白质对于理解这些代谢物的细胞功能至关重要。亲和层析联合Western印迹或质谱分析为鉴定与IP或PI相互作用的蛋白质提供了可能，从而有助于揭示其调控功能。通过化学标记（例如将Ins(1,4,5)P₃与生物素共价连接）并将IPs或PIs经链霉亲和素交联至琼脂糖微珠，或由链霉亲和素磁珠捕获，可分离出相互作用的蛋白质，随后通过质谱或Western印迹进行鉴定。本文所述方案已被用于鉴定与这些代谢物结合的T. brucei^3,8及哺乳动物细胞⁴⁷中的蛋白质。使用定制标签（非生物素）的该方法变体也已在酵母中应用⁴⁶。该方法的一个重要考虑因素是使用对照以区分特异性与非特异性相互作用。未偶联的微珠是必要的对照，其他对照还可包括非磷酸化的PIs或与微珠偶联的肌醇³。也可使用具有不同磷酸化组合的IPs或PIs³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Sigma-Aldrich	650501	酮类
乙腈	Sigma-Aldrich	271004	溶剂
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	A6141	无机盐
Avanti J6-MI 离心机	Beckman Coulter	Avanti J6-MI	用于大体积样品（例如 1 L）的离心机
离心瓶	Sigma-Aldrich	B1408	用于 1 L 培养液离心的瓶子
对照珠	Echelon	P-B000-1ml	亲和层析试剂 - 对照
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	糖类，在 PBS 中添加以维持细胞活性
二硫苏糖醇（DTT）	Bio-Rad	1610610	还原剂
Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠	ThermoFisher Scientific	65305	用于结合生物素配体的链霉亲和素磁珠
无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836170001	蛋白酶抑制剂
电泳运行缓冲液	Bio-Rad	1610732	25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3
Falcon 15 mL 锥形离心管	Corning Life Sciences	430052	用于离心 10 mL 培养液
甲酸	Sigma-Aldrich	106526	酸类
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126	氨基酸
HMI-9 细胞培养基	ThermoFisher Scientific	ME110145P1	用于 T. brucei 血液形态的细胞培养基
Imperial 蛋白染色液	ThermoFisher Scientific	24615	用于 SDS/PAGE 中蛋白质检测的考马斯亮蓝染色
Ins(1,4,5)P3 磁珠	Echelon	Q-B0145-1ml	亲和层析试剂
Instant 脱脂 干 奶粉	Thomas Scientific	C837M64	Western 印迹封闭试剂
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I6125	用于半胱氨酸蛋白或肽的烷基化试剂
Lab 旋转混合仪	Thomas Scientific	1159Z92	用于结合实验
LoBind 微量离心管	ThermoFisher Scientific	13-698-793	低蛋白吸附管，适用于质谱分析
Nonidet P-40（Igepal CA-630）	Sigma-Aldrich	21-3277	去垢剂
PBS，pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010031	生理缓冲液
化学发光用过氧化物酶底物	ThermoFisher Scientific	32106	用于 Western 印迹蛋白质检测的底物
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂	Roche	4906845001	磷酸酶抑制剂
PI(3)P PIP 磁珠	Echelon	P-B003a-1ml	亲和层析试剂
PI(3,4)P2 PIP 磁珠	Echelon	P-B034a-1ml	亲和层析试剂
PI(3,4,5)P3 diC8	Echelon	P-3908-1mg	亲和层析试剂
PI(3,4,5)P3 PIP 磁珠	Echelon	P-B345a-1ml	亲和层析试剂
PI(3,5)P2 PIP 磁珠	Echelon	P-B035a-1ml	亲和层析试剂
PI(4)P PIP 磁珠	Echelon	P-B004a-1ml	亲和层析试剂
PI(4,5)P2 diC8	Echelon	P-4508-1mg	亲和层析试剂
PI(4,5)P2 PIP 磁珠	Echelon	P-B045a-1ml	亲和层析试剂
PI(5)P PIP 磁珠	Echelon	P-B005a-1ml	亲和层析试剂
Ponceau S 溶液	Sigma-Aldrich	P7170	蛋白质染色（0.1% [w/v] 溶于 5% 乙酸）
铁氰化钾(III)	Sigma-Aldrich	702587	钾盐
PtdIns PIP 磁珠	Echelon	P-B001-1ml	亲和层析试剂
PVDF 膜	Bio-Rad	1620177	用于 Western 印迹
冷冻离心机	Eppendorf	5910 R	用于小体积样品（例如 1.5 mL）的微量离心机
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	862010	去垢剂
硫代硫酸钠	Sigma-Aldrich	72049	化学试剂
SpeedVac 真空浓缩仪	ThermoFisher Scientific	SPD120-115	样品浓缩（例如用于质谱分析）
细胞培养用 T175 培养瓶	ThermoFisher Scientific	159910	用于培养 50 mL T. brucei 培养物
胰蛋白酶，质谱级	Promega	V5280	用于蛋白质消化的胰蛋白酶
尿素	Sigma-Aldrich	U5128	变性试剂
涡旋振荡器	Fisher Scientific	02-215-418	用于混合反应体系
Western 印迹转膜缓冲液	Bio-Rad	1610734	25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，pH 8.3，含 20% 甲醇
Whatman 3 mm 滤纸	Sigma-Aldrich	WHA3030861	用于 Western 转膜的滤纸
2-巯基乙醇（14.2 M）	Bio-Rad	1610710	还原剂
2x Laemmli 上样缓冲液	Bio-Rad	161-0737	蛋白质上样缓冲液
4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶	Bio-Rad	4561094	用于蛋白质电泳的凝胶
4x Laemmli 上样缓冲液	Bio-Rad	161-0747	蛋白质上样缓冲液