通过亲和层析联合蛋白质印迹或质谱法鉴定肌醇磷酸或磷脂酰肌醇相互作用蛋白

摘要

本方案重点在于鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。该方法采用亲和层析技术，将生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇通过链霉亲和素固定于琼脂糖或磁珠上。通过蛋白质印迹（Western blotting）或质谱分析来鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。

摘要

肌醇磷酸盐和磷脂酰肌醇在真核生物中调控多种细胞过程，包括基因表达、囊泡运输、信号转导、代谢以及发育。这些代谢物通过与蛋白质结合，改变蛋白质的构象、催化活性和/或相互作用，从而发挥其调控功能。本文所述方法结合亲和层析与质谱或蛋白质印迹技术，用于鉴定与肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇相互作用的蛋白质。将肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇通过化学方法标记上生物素，随后利用与琼脂糖或磁珠偶联的链霉亲和素进行捕获。蛋白质因其对代谢物的结合亲和力而被分离，再经洗脱后通过质谱或蛋白质印迹进行鉴定。该方法流程简单，具有高灵敏度、非放射性、无需脂质体且可定制化，能够精确分析蛋白质与代谢物之间的相互作用。该策略可用于无标记或氨基酸标记的定量质谱方法中，以鉴定复杂生物样品或纯化蛋白质中的蛋白质-代谢物相互作用。本实验方案已针对Trypanosoma brucei的蛋白质分析进行了优化，但也可适用于相关原生动物寄生虫、酵母或哺乳动物细胞。

引言

肌醇磷酸盐（IPs）和磷脂酰肌醇（PIs）通过调控基因表达^1,2,3、囊泡运输⁴、信号转导^5,6、代谢^7,8,9以及发育^8,10等细胞过程，在真核生物生物学中发挥核心作用。这些代谢物的调控功能源于其与蛋白质相互作用并进而调节蛋白质功能的能力。当与蛋白质结合时，IPs 和 PIs 可能会改变蛋白质构象¹¹、催化活性¹²或相互作用¹³，从而影响细胞功能。IPs 和 PIs 分布于多种亚细胞区室中，例如细胞核^2,3,

方案

1. 通过亲和层析和蛋白质印迹法分析IP-或PI-结合蛋白

1. 细胞生长、裂解与亲和层析
   1. 将 T. brucei 细胞培养至对数中期，并监测细胞活力和密度。每次结合实验使用 5.0 × 10⁷ 个细胞即可。
      1. 对于血液形态，将细胞在 HMI-9 培养基中（添加 10% 胎牛血清（FBS））于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养。维持细胞密度在 8.0 × 10⁵ 至 1.6 × 10⁶ 个细胞/mL 之间。
         注：细胞密度高于 1.8 × 10⁶ 个细胞/mL 可能影响细胞活力。T. brucei 427 菌株体外培养的倍增时间为 5.5 至 6.5 小时。
      2. 对于前循环形态，将细胞在 SDM-79 培养基中（添加 10% FBS）于 27 °C 培养，并维持细胞密度在 1.0 × 10⁷ 至 3.0 × 10⁷ 个细胞/mL 之间。
      3. 对于纯化蛋白（例如重组蛋白），取 0.5 至 1 µg 蛋白，加入 450 µL 结合缓冲液（25 mM HEPES，150 mM NaCl，0.2% 4-壬基苯基-聚乙二醇，pH 7.4）稀释。保留稀释后蛋白总量的 5%（上样对照）用于 We....

结果

通过亲和层析和蛋白质印迹分析 RAP1 与 PI(3,4,5)P3 的相互作用
本示例说明了该方法在分析 T. brucei 裂解物或重组 T. brucei RAP1 蛋白与磷脂酰肌醇（PIs）结合中的应用。结合实验使用了表达血凝素（HA）标签 RAP1 的 T. brucei 血液形态裂解物。RAP1 是一种参与变异表面糖蛋白（VSG）基因转录调控的蛋白质^3,48，VSG 基因编码的表面蛋白通过抗原变异机制介导寄生虫的免疫逃逸⁴⁹。RAP1 在端粒蛋白复合物中与磷脂酰肌醇 5-磷酸酶（PIP5Pase）相互作用³，该酶也参与 VSG 基因转录的调控^1,3。RAP1 含有一个位于 N 末端的乳腺癌 1 羧基末端（B.......

讨论

鉴定与IPs或PIs结合的蛋白质对于理解这些代谢物的细胞功能至关重要。亲和层析联合Western印迹或质谱分析为鉴定与IP或PI相互作用的蛋白质提供了可能，从而有助于揭示其调控功能。通过化学标记（例如将Ins(1,4,5)P₃与生物素共价连接）并将IPs或PIs经链霉亲和素交联至琼脂糖微珠，或由链霉亲和素磁珠捕获，可分离出相互作用的蛋白质，随后通过质谱或Western印迹进行鉴定。本文所述方案已被用于鉴定与这些代谢物结合的T. brucei^3,8及哺乳动物细胞⁴⁷中的蛋白质。使用定制标签（非生物素）的该方法变体也已在酵母中应用⁴⁶。该方法的一个重要考虑因素是使用对照以区分特异性与非特异性相互作用。未偶联的微珠是必要的对照，其他对照还可包括非磷酸化的PIs或与微珠偶联的肌醇³。也可使用具有不同磷酸化组合的IPs或PIs³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Sigma-Aldrich	650501	酮类
乙腈	Sigma-Aldrich	271004	溶剂
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	A6141	无机盐
Avanti J6-MI 离心机	Beckman Coulter	Avanti J6-MI	用于大体积样品（例如 1 L）的离心机
离心瓶	Sigma-Aldrich	B1408	用于 1 L 培养液离心的瓶子
对照珠	Echelon	P-B000-1ml	亲和层析试剂 - 对照
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	糖类，在 PBS 中添加以维持细胞活性
二硫苏糖醇（DTT）	Bio-Rad	1610610	还原剂
Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠	ThermoFisher Scientific	65305	用于结合生物素配体的链霉亲和素磁珠
无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836170001	蛋白酶抑制剂
电泳运行缓冲液	Bio-Rad	1610732	25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3
Falcon 15 mL 锥形离心管	Corning Life Sciences	430052	用于离心 10 mL 培养液
甲酸	Sigma-Aldrich	106526	酸类
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126	氨基酸
HMI-9 细胞培养基	ThermoFisher Scientific	ME110145P1	用于 T. brucei 血液形态的细胞培养基
Imperial 蛋白染色液	ThermoFisher Scientific	24615	用于 SDS/PAGE 中蛋白质检测的考马斯亮蓝染色
Ins(1,4,5)P3 磁珠	Echelon	Q-B0145-1ml	亲和层析试剂
Instant 脱脂 干 奶粉	Thomas Scientific	C837M64	Western 印迹封闭试剂
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I6125	用于半胱氨酸蛋白或肽的烷基化试剂
Lab 旋转混合仪	Thomas Scientific	1159Z92	用于结合实验
LoBind 微量离心管	ThermoFisher Scientific	13-698-793	低蛋白吸附管，适用于质谱分析
Nonidet P-40（Igepal CA-630）	Sigma-Aldrich	21-3277	去垢剂
PBS，pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010031	生理缓冲液
化学发光用过氧化物酶底物	ThermoFisher Scientific	32106	用于 Western 印迹蛋白质检测的底物
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂	Roche	4906845001	磷酸酶抑制剂
PI(3)P PIP 磁珠	Echelon	P-B003a-1ml	亲和层析试剂
PI(3,4)P2 PIP 磁珠	Echelon	P-B034a-1ml	亲和层析试剂
PI(3,4,5)P3 diC8	Echelon	P-3908-1mg	亲和层析试剂
PI(3,4,5)P3 PIP 磁珠	Echelon	P-B345a-1ml	亲和层析试剂
PI(3,5)P2 PIP 磁珠	Echelon	P-B035a-1ml	亲和层析试剂
PI(4)P PIP 磁珠	Echelon	P-B004a-1ml	亲和层析试剂
PI(4,5)P2 diC8	Echelon	P-4508-1mg	亲和层析试剂
PI(4,5)P2 PIP 磁珠	Echelon	P-B045a-1ml	亲和层析试剂
PI(5)P PIP 磁珠	Echelon	P-B005a-1ml	亲和层析试剂
Ponceau S 溶液	Sigma-Aldrich	P7170	蛋白质染色（0.1% [w/v] 溶于 5% 乙酸）
铁氰化钾(III)	Sigma-Aldrich	702587	钾盐
PtdIns PIP 磁珠	Echelon	P-B001-1ml	亲和层析试剂
PVDF 膜	Bio-Rad	1620177	用于 Western 印迹
冷冻离心机	Eppendorf	5910 R	用于小体积样品（例如 1.5 mL）的微量离心机
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	862010	去垢剂
硫代硫酸钠	Sigma-Aldrich	72049	化学试剂
SpeedVac 真空浓缩仪	ThermoFisher Scientific	SPD120-115	样品浓缩（例如用于质谱分析）
细胞培养用 T175 培养瓶	ThermoFisher Scientific	159910	用于培养 50 mL T. brucei 培养物
胰蛋白酶，质谱级	Promega	V5280	用于蛋白质消化的胰蛋白酶
尿素	Sigma-Aldrich	U5128	变性试剂
涡旋振荡器	Fisher Scientific	02-215-418	用于混合反应体系
Western 印迹转膜缓冲液	Bio-Rad	1610734	25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，pH 8.3，含 20% 甲醇
Whatman 3 mm 滤纸	Sigma-Aldrich	WHA3030861	用于 Western 转膜的滤纸
2-巯基乙醇（14.2 M）	Bio-Rad	1610710	还原剂
2x Laemmli 上样缓冲液	Bio-Rad	161-0737	蛋白质上样缓冲液
4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶	Bio-Rad	4561094	用于蛋白质电泳的凝胶
4x Laemmli 上样缓冲液	Bio-Rad	161-0747	蛋白质上样缓冲液