去垢剂辅助的重组膜蛋白重构 果蝇 用于脂质混合实验的Atlastin蛋白脂质体重组

摘要

生物膜融合由特化的融合蛋白催化。通过脂质混合实验可测定蛋白质的促融合特性。本文介绍了一种方法，用于纯化重组果蝇atlastin蛋白（一种介导内质网同型融合的蛋白），将其重组到预先形成的脂质体中，并检测其融合能力。

摘要

膜融合是真核细胞中的关键过程，需要特定蛋白质来催化该过程。Atlastin 是定位于内质网（ER）的蛋白质，参与内质网的同型融合。本文详细描述了一种通过两轮亲和层析纯化带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多聚组氨酸标签的黑腹果蝇（Drosophila）atlastin的方法。体外研究融合反应需要将纯化的融合蛋白插入脂双层中。脂质体是理想的模型膜系统，因其脂质组成和大小均可调节。为此，我们介绍了一种通过去垢剂透析法将黑腹果蝇 atlastin 重组到预先形成的脂质体中的方法。尽管存在多种重组方法，但去垢剂去除法具有若干优势，使其特别适用于 atlastin 及其他类似蛋白。该方法的优势包括较高的重组效率以及重组蛋白的正确取向。此方法可推广至其他膜蛋白，以及需要蛋白脂质体的其他应用。此外，我们还描述了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的脂质混合检测法，用于检测蛋白脂质体的膜融合程度。

引言

膜融合是许多生物反应中的关键过程。在生物条件下，膜融合并非自发进行，需要特定的融合蛋白来催化此类反应¹。在动物中，内质网同型膜融合由动力相关GTP酶atlastin介导²。atlastin在同型融合中的作用对于外周内质网中三向连接的形成至关重要，这些三向连接构成了贯穿整个细胞的广泛互联的管状网络。atlastin具有保守的结构域形态，包括一个较大的GTP酶结构域、一个由三段α螺旋组成的中间结构域、一个疏水性跨膜锚定区以及一个短的胞质C端尾部³。利用重组果蝇atlastin进行的体外研究表明，当将其重建至脂质体中时，其仍保持促融合活性。然而，其他atlastin蛋白（包括人源同源蛋白）尚未能在体外重现融合活性。本文描述了一种纯化带有GST和多聚组氨酸标签的重组果蝇atlastin、将其重建至脂质体并检测其融合活性的方法学。

在体外研究膜融合具有挑战性，因为促融合蛋白通常具有膜锚定结构。为了对其进行研究，必须将其重组到模型脂双层中。大单层囊泡（LUV）是研究脂质-蛋白质相互作用的有用工具。本文介绍一种制备不同脂质组成LUV的系统，用于蛋白质重组和融合检测。将整合膜蛋白重组到LUV中可通过多种方法实现，包括有机溶剂介导的重组、机械机制或去垢剂辅助重组⁴。本文介绍一种通过去除去垢剂将果蝇atla....

方案

1. GST-DAtl-His8 的纯化

1. 蛋白表达与裂解液制备
   1. 转化BL21 (DE3) E. coli pGEX4-T3 载体中的 GST-DAtl-His8 构建体² 并在氨苄青霉素平板上进行筛选。
   2. 挑选单个转化子，接种于5 mL LB + 氨苄青霉素（ampicillin）中5 µL 含100 mg/mL氨苄青霉素的14 mL培养管中，于 25 °C 以200 rpm振荡培养6-8小时。
      注意： 由于存在泄漏表达，不建议在较高温度下培养。生长于 25 °C 减少蛋白质在此生长期的聚集。
   3. 接种1 mL的5 mL培养物到200 mL LB + 氨苄青霉素培养基中，于~15–18 h内过夜培养 25 °C.
   4. 次日早晨，通过离心（2,000 x g 孵育10分钟后，重悬于5 mL LB培养基中。
   5. 接种4 L LB培养基（含氨苄青霉素）并测定OD值₆₀₀ (0.05–0.15)。于 25 °C 振荡条件下。
      注意： 预留部分培养基作为OD测定的空白对照₆₀₀ 添加细菌前的测量。
   6. 测定 OD₆₀₀ 每小时检测一次，直至 OD 达到 0.....

结果

atlastin 重构效率如图2所示。将重构后的蛋白脂质体在碘克沙醇不连续梯度中上浮。未整合的蛋白质沉降至底层（B）或中层（M），而重构后的蛋白质则上浮至顶层（T）。收集梯度各层样品，并通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行分析。通过密度测定法对凝胶进行定量，结果显示重构效率极高，损失可忽略不计：总蛋白中有96%以蛋白脂质体形式上浮至顶层（T）；少于1%的蛋白未重构并存在于中层（M），仅有3%的蛋白未重构或发生聚集并沉降至底层（B）。

除了描述重构程度外，还通过凝血酶切割实验对atlastin重构后的取向进行了定量分析¹⁴。重构后的蛋白质可能处于错误的取向，即朝向脂质体的腔内空间。处于错误取向的蛋白质应受到脂双层的保护而免于蛋白水解。在N端GST标签的末端与atlastin的起始端之间编码有一个凝血酶切割位点。漂浮的蛋白脂质体在37 °C下与凝血酶孵育1小时，随后加入不含EDTA的蛋白酶抑制剂孵育30分钟以终止反应。样品通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色进行分析，并采.......

讨论

本文所述方法提供了一种高效纯化、重建并测定重组atlastin融合活性的方案。为确保获得高产量的功能性atlastin，必须注意若干关键步骤。atlastin的表达需在低温（16 °C）下进行，以避免蛋白聚集，且最终蛋白浓度应控制在0.4–1.5 mg/mL之间。若蛋白浓度过低，则在1:400的蛋白与脂质比例下无法实现最佳重建效果。重建效率可选择性地通过本文所述的浮力梯度离心法进行分析（图2）。脂质体浮力梯度离心法的优势之一在于，该方法可拓展用于分析与脂双层结合的可溶性蛋白¹³。此外，也可通过蛋白酶消化法分析重建后蛋白的取向¹⁴，但该方法可能无法区分错误折叠或聚集的重建蛋白与方向错误的重建蛋白（图3）。本方法制备的蛋白脂质体可用于膜融合活性检测，或用于在模型脂双层体系中研究atlastin的功能。尽管重建过程相对简单，但去垢剂和脂质浓度若稍偏离最优值，均可能导致重建效率下降。例如，过量的去垢剂可能引起脂质体溶解。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 聚合层析柱	Biored	731-1550
10 mm x 75 mm 茄形玻璃管	VWR	608225-402
47 mm 直径，0.45 μm 孔径 Whatman 无菌膜滤器	Whatman	7141 104
96 孔白色板	NUNC	437796
Anapoe X-100	Anatrace	9002-931-1
细胞破碎仪	Avestin	Avestin Emulsiflex C3
DOPS（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐））	Avanti	840035P-10mg	DOPS
EDTA	Research organics inc.	6381-92-6	乙二胺四乙酸
无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11873580001	Complete 蛋白酶抑制剂
挤出器	Sigma Aldrich	Z373400	Liposofast Basic 挤出器
GE Akta Prime 液相色谱系统	GE Pharmacia	8149-30-0006
谷胱甘肽琼脂糖珠	Sigma aldrich	G4510-50ml
甘油	EMD	GX0185-5
GTP	Sigma Aldrich	36051-31-7	鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物
HEPES，无酸型	Omnipur	5330
咪唑	fluka	5670
固定化金属亲和层析（IMAC）树脂柱	GE Healthcare	17040801	1 mL HiTrap Chelating HP 固定化金属亲和层析柱
碘海醇	Accurate chemical and scientific corporation	AN 7050 BLK	Accudenz/Nycodenz
IPTG	Research products international corp.	I56000-100.0	IPTG，无二噁烷
还原型 L-谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G4251-5g
氯化镁	Fisher	7791-18-6
甲醇	Omnisolv	MX0488-1
NBD-DPPE（1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐））	Avanti	236495	NBD-DPPE
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Chem-Impex International	21950
非极性聚苯乙烯吸附珠	BioRad	152-3920	SM2 Biobeads
Nuclepore 蚀刻聚碳酸酯膜，19 mm，0.1 μm 孔径	Whatman	800309
Optima LE80K 超速离心机	Beckman Coulter
磷脂酰胆碱，L-α-二棕榈酰基 [甲基-3H-胆碱]	ARC	ART0284	放射性标记脂质
酶标仪	TECAN	TECAN infinite M200 酶标仪
POPC（1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷脂酰胆碱）	Avanti	850457C-25mg	POPC
氯化钾	MP	151944
Rh-DPPE（1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(罗丹明B磺酰基)（铵盐））	Avanti	236495	Rh-DPPE
闪烁液	National Diagnostics	LS-272	适用于水相或非水相样品的 Ecoscint XR 闪烁液
闪烁瓶	Beckman	592928	快旋盖 Mini Poly-Q 瓶
凝血酶	Sigma	T1063-1kU	人血浆来源凝血酶
Triton X-100	Fisher	BP151-500
超透明离心管 5 mm x 41 mm	Beckman	344090
9 至 13 mm 试管涡旋适配器	VWR	58816-138	用于涡旋茄形玻璃管的插入件
涡旋管架固定器	VWR	58816-132	涡旋管架所需固定件
涡旋振荡器	VWR	2.235074	Vortex Genie 2 型号 G560
β-巯基乙醇，分子生物学级	Calbiochem	444203