本文介绍了一种利用β-雌二醇诱导的AID系统，在酵母Saccharomyces cerevisiae中高效且特异性地降解目标蛋白的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
植物生长素结合受体 TIR1 在生长素存在的情况下可识别含有特定生长素诱导降解子（AID）基序的蛋白质，并使其靶向降解。该系统已被广泛应用于多种非植物真核生物中，使得带有 AID 标签的目标蛋白在添加生长素后被降解。TIR1 的表达水平至关重要：过量表达会导致即使在无生长素的情况下，AID 标签蛋白也被降解，而表达量过低则导致目标蛋白清除速度缓慢。为此，研究人员构建了由 β-雌二醇诱导的 AID 系统，其中 TIR1 的表达受 β-雌二醇诱导型启动子调控。通过在添加生长素前改变与 β-雌二醇共孵育的时间，可调节 TIR1 的表达水平。本实验方案描述了如何利用 AID 系统快速耗竭目标蛋白。合适的 β-雌二醇孵育时间取决于目标蛋白的丰度。因此，高效的蛋白耗竭依赖于最佳的时间控制，同时最大限度地减少无生长素依赖性的降解。
引言
条件性突变（如温度敏感型突变体）是研究必需蛋白的有力工具，可在允许条件下支持细胞生长，而在非允许条件下导致蛋白功能丧失。然而，诱导缺陷所需的培养条件改变可能严重干扰细胞代谢，并可能产生脱靶效应。目前已开发出多种方法，通过添加小分子来条件性地隔离目标蛋白1，或调控其表达2,3。本实验方案利用生长素及其诱导型降解决定子（auxin-inducible degron, AID）系统，高效耗竭目标蛋白。
AID 系统起源于植物，在植物中，生长素（本实验方案中使用的是吲哚-3-乙酸（IAA））可促进 Aux/IAA 蛋白与 TIR1（SCF U3 泛素连接酶复合物的一个组分）之间的相互作用4。SCF 复合物的相互作用导致 Aux/IAA 家族蛋白发生多聚泛素化，从而使其被蛋白酶体降解5,6。
该系统先前已针对酵母Saccharomyces cerevisiae7,8进行了改造，通过在酵母细胞中表达来自Oriza sativa的TIR1蛋白（osTIR），使其能够与内源性酵母SCF复合物相互作用。目的蛋白被标记上来自Aux/IAA蛋白IAA17的一个基序，以靶向其降解。随后开发出IAA17的功能性截短版本，例如AID*8,9,10，其中包含来自Arabidopsis thaliana IAA17的43个氨基酸组成的生长素敏感基序，并带有一个表位标签以便检测。
最初为芽殖酵母改造的系统7,8利用酵母GAL启动子表达osTIR1蛋白。该表达需要将细胞转移至以半乳糖为唯一碳源的培养基中，但不幸的是，这会引起双相生长现象，导致细胞代谢发生广泛变化11。另一方面，已有报道指出，若TIR1组成型表达水平较高，则即使在缺乏生长素/IAA的情况下也可能导致目标蛋白降解12；而TIR1表达水平过低又会导致目标蛋白耗竭效率低下。为此，研究人员开发了一种改进的AID系统，称为β-est AID，其中osTIR受一个可诱导且可调节的启动子控制，可根据目标蛋白的特性进行优化，同时对细胞代谢的影响最小。为实现这一目标，构建了一种人工转录因子（ATF），其将病毒转录激活因子VP16与雌激素受体以及四联锌指DNA结合结构域（DBD）融合在一起。当存在β-雌二醇（一种雌激素）时，该ATF可进入细胞核，并通过结合其启动子（Z4EVpr）来诱导osTIR的转录13,12。
加入β-雌二醇后约20分钟通常可检测到osTIR的表达12。然而，为实现用生长素高效耗竭标记蛋白，同时避免在添加生长素前发生耗竭，osTIR表达的最佳持续时间需针对每种目标蛋白通过实验确定。该预孵育时间的大致范围可根据《酿酒酵母基因组数据库》（SGD https://www.yeastgenome.org/）中的丰度数据进行估算。如图1所示，丰度较高的蛋白Dcp1（每细胞2880至4189个分子）需要40分钟的β-雌二醇预孵育，且未观察到无生长素依赖性的耗竭。而丰度低得多的蛋白Prp2（每细胞172至211个分子）在仅20分钟预孵育后即出现显著耗竭。建议在初始估计时间前后再测试两个额外的预孵育时间点，即比估计时间提前或延后10至20分钟（推荐最短预孵育时间为20分钟）。最佳预孵育时间应满足：在添加生长素前目标蛋白未发生耗竭，而在添加生长素后耗竭程度可接受，或蛋白水平接近可能的最低值。因此，从图1b可见，Prp22在30分钟预孵育后，添加生长素10分钟时蛋白水平尚未明显下降；相比之下，40分钟预孵育并加入IAA 15分钟后未见进一步明显耗竭，说明延长生长素处理时间超过10分钟或预孵育时间超过30分钟并无益处，尤其在40分钟时已有非生长素依赖性耗竭的迹象。对于Dcp1，在40分钟预孵育（此为添加生长素前蛋白水平仍近似为100%的最后一个时间点）条件下，用生长素耗竭15至20分钟是可接受的。建议尽可能缩短耗竭时间，以减少对细胞代谢的继发性影响14。
本文演示了如何通过优化β-雌二醇孵育时间以实现osTIR表达，从而在添加IAA后快速耗竭目标蛋白，同时在添加生长素之前不引起目标蛋白的耗竭，进而使用β-雌二醇诱导的AID系统。
方案
注意：图形摘要请参见图2。
1. 菌株制备
- 使用一个 ura3-菌株中引入β-雌二醇AID系统（即编码β-雌二醇响应型转录因子（ATF）和osTIR的基因），并对目标蛋白进行AID*标记（参见 图3 以及表1以获取该操作流程的概要。
- 转化15 pZTRK（G418抗性标记）或pZTRLLEU2 标记物）质粒（可从酵母基因资源中心获取）转入 ura3- 酵母菌株，或使用该质粒作为模板扩增PCR产物用于基因组整合。
- 使用高保真DNA聚合酶，从质粒pZTRK或pZTRL中扩增ATF（质粒图谱中标记为Z4EVATF）和osTIR。引物设计需包含50至60个碱基的3’端延伸序列，该延伸序列应与基因组靶区域具有同源性，以介导同源重组实现定点整合16. 若要将这两个组分单独或共同整合到基因组中，请参见 表1 引物和反应条件。
注意： 菌株 pZ4EV-NTR1 的组分已整合至基因组中（可从日本酵母遗传资源中心获取）。 - 确保使用Longtine方法对目标蛋白进行AID*标记17 （参见 图3b 和 表1).
- 在无β-雌二醇和IAA存在的条件下，对该菌株进行生长分析，以确定AID*标签是否影响其生长，并预测生长速率，用于步骤1.5。
2. 耗竭的一般操作步骤
- 计算所有样品采集所需的培养物体积；例如，对于单个样品，OD600 为 0.8 的 10 mL 培养液足以用于蛋白质、RNA 和 DNA 的提取，因此对于 6 个样品，至少需要 60 mL 培养液。
- 从过夜培养物中，以 OD600 0.1 至 0.2 接种足够量的新鲜培养液，并在 30 °C 下继续培养。推荐使用 YPDA 等丰富培养基，但也可使用其他生长条件：
酵母提取物 10 g 蛋白胨 20 g 葡萄糖 20 g 硫酸腺嘌呤 40 mg H2O 定容至 1 L
注意：需进行高压灭菌或过滤除菌；推荐使用过滤除菌，因为高压灭菌产生的肽-糖复合物会在样品收集所用的甲醇中发生沉淀。 - 准备接收样品。
- 将预期样品体积 30% 至 50% 的甲醇加入离心管中。例如，若采集 10 mL 样品，则在 15 mL 离心管中加入 5 mL 甲醇，并拧紧管盖。密封后标记管子，并置于干冰或 -80 °C 环境中预冷。
注意：应在通风橱中分装甲醇。 - 标记用于样品长期保存的 1.5 mL 离心管，并置于冰上预冷。
- 将足量 H2O（每份样品至少 1 mL）置于冰上预冷。
- 将预期样品体积 30% 至 50% 的甲醇加入离心管中。例如，若采集 10 mL 样品，则在 15 mL 离心管中加入 5 mL 甲醇，并拧紧管盖。密封后标记管子，并置于干冰或 -80 °C 环境中预冷。
- 预测培养物的生长情况。采集样品的目标 OD 值约为 0.7 至 0.8，但预孵育步骤（即加入 β-雌二醇以诱导 osTIR 系统）需提前开始，以确保在采集样品时培养物达到合适的 OD 值。
注意：建议在实验所用条件下进行生长曲线测定，以便估算该起始 OD 值。 - 当培养物达到预孵育起始目标 OD 值时，取一份样品（通常为 10 mL），加入预先准备好的含冷甲醇的离心管中。短暂颠倒混匀后，立即放回干冰中。
注意：若操作方便，约 5 分钟后可将样品转移至冰水混合物中。 - 立即向培养液中加入 β-雌二醇，终浓度为 1 µL/mL（最终浓度为 10 µM）；建议预先量取所需 β-雌二醇并用移液器准备好，以缩短样品采集与添加 β-雌二醇之间的时间间隔。通过剧烈涡旋迅速混匀。
- 继续按步骤 2.2 的条件培养，加入 β-雌二醇孵育（即“预孵育”步骤），孵育时间应为最佳时长（最佳预孵育时间的确定参见 图 1）。
- 准备添加 IAA（生长素）。量取步骤 2.10 所需的 IAA 体积（即每 mL 培养液加 0.5 µL IAA），以便加快步骤 2.20 的操作。
- 按照步骤 2.5 的方法采集一份样品。
- 立即按步骤 2.8 的准备，向培养液中加入 IAA 至终浓度 0.5 µL/mL（最终浓度为 750 µM）。通过剧烈涡旋迅速混匀。
- 根据实验设计，按照步骤 2.5 的方法采集样品。可采集单个样品（在预期目标蛋白已稳定耗尽的时间点），或进行时间梯度采样以观察蛋白耗尽过程。例如，每隔 5 分钟采样一次便于计时，并可获得一系列蛋白水平变化数据。图 1 所示的优化策略可提示合适的时间点。
- 处理样品。
- 若尚未进行，将样品置于冰上。确保样品未冻结；若已冻结，用手轻轻温热并持续颠倒，防止局部温度升高。
注意：建议用手操作，以便感知样品温度，应始终感觉冰凉。随后放回冰上。此步骤不可暂停——一旦所有样品恢复液态，应立即进行下一步。 - 所有样品采集完毕且完全解冻后，在 4 °C 条件下以 3,500 x g 离心 2 分钟。
- 倾去甲醇/培养基混合液，将管子放回冰上；不必完全去除所有液体。
- 用 1 mL 冰冷 H2O（来自步骤 2.3.3）重悬细胞沉淀，并转移至已标记的 1.5 mL 离心管（步骤 2.3.2 中准备）中，置于冰上。
- 短暂离心（例如总时间 10 秒）于 >15,000 x g 以重新沉淀细胞，放回冰上后弃去上清液。
- 用抽吸法去除 H2O。细胞沉淀可在 -20 °C 或 -80 °C 长期保存。
- 若尚未进行，将样品置于冰上。确保样品未冻结；若已冻结，用手轻轻温热并持续颠倒，防止局部温度升高。
- 通过 Western blot 分析检测目标蛋白的耗尽程度18。
注意：通常从单个细胞沉淀中可提取足够量的蛋白质19 和/或核酸用于大多数实验目的，但若检测稀有 RNA 物种，可能需要更大的样品量。
结果
蛋白耗尽的代表性示例如图1所示。本图中展示的三个实验分别为Prp2、Prp22和Dcp1蛋白耗尽条件的优化实验。低丰度的剪接体蛋白Prp2和Prp22在与β-雌二醇预孵育40分钟后，再加入auxin处理15分钟，其蛋白水平均降低至不足20%。更长的预孵育时间可加快耗尽速度，但也会导致在加入auxin前出现不期望的蛋白耗尽。相比之下，丰度较高的Dcp1蛋白在相同处理条件下仅耗尽至约30%；但若预孵育60分钟，则在相同的auxin处理下可耗尽至13%，代价是在加入auxin前已发生一定程度的蛋白耗尽。因此，采用β-雌二醇预孵育50分钟并辅以15分钟auxin处理，可能在更短的时间内达到类似效果，因而更为优化。
图1：通过调节β-雌二醇预孵育时间可调控目标蛋白的降解速率。目标蛋白的蛋白质印迹分析18结果：(a 和 b) Prp22-AID*-6FLAG，(c 和 d) Prp2-AID*-6FLAG，以及(e 和 f) Dcp1-AID*-6HA，样品来自在添加生长素前分别用β-雌二醇（β-est）预孵育20、30、40或60分钟的培养物12。每条泳道上样的总蛋白量相等。Pgk1作为上样对照进行检测，但在图e中，Pgk1与Dcp1迁移位置重叠。图a、c和e中蛋白条带的定量结果分别显示于图b、d和f。为衡量降解速率，计算了各曲线线性阶段（从初始值100%降至30%）的斜率（m）。最佳预孵育时间是指在此时蛋白水平仍接近未诱导状态（100%），且后续降解速率较快的时间点。对于Dcp1（f），60分钟预孵育过长，因蛋白在未加生长素时已开始降解；而20分钟则过短，因在此时间段内蛋白未发生明显降解。经40分钟预孵育后，加入生长素15分钟即可使蛋白降解约70%，尽管延长至20分钟可导致进一步降解，但也可能引发继发性效应。误差棒表示两次生物学重复实验的标准差。每个实验仅展示一张代表性印迹图。本图改编自先前发表的研究9。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：图示摘要。 在适宜温度下，向处于丰富培养基中生长至适当密度的培养物中加入 β-雌二醇，以启动预孵育。在加入 IAA（生长素）启动蛋白耗尽前，继续培养所需的预孵育时间。预孵育和耗尽时间取决于目标蛋白，但预孵育通常为 20–60 分钟，耗尽时间通常为 10 至 20 分钟。应在预孵育开始和结束时以及耗尽过程中采集 10 mL 样品。这些样品需迅速用冷甲醇固定，离心后保存。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：B-est 系统的菌株构建。（a）为构建含有 AID* 系统的酵母菌株，可将 pZTRL（LEU2）或 pZTRK（卡那霉素（G418）抗性）质粒导入菌株中；或者，也可通过 PCR 扩增生成的 DNA 片段，利用同源重组将 ATF 和 osTIR 插入基因组（见 图 3b 和 Table 1）。 （b）目标蛋白的C端标签化通过PCR扩增质粒pURA3-AID*-6FLAG的相应区域实现（pURA3_AID*-6HA仅在标签上不同，操作方法完全相同），使用Longtine引物S3-F和S2-R，其3’端延伸序列与目标蛋白3’端同源。正向引物的延伸部分应包含最后一个氨基酸密码子，并与AID*标签的起始端保持阅读框一致，但不得包含终止密码子；反向引物的延伸部分应位于编码区下游的区域。一旦插入基因组后，可通过在含5-FOA的培养基中培养，筛选出因两端同源区域发生同源重组而丢失URA3标记的细胞，从而实现对URA3阳性细胞的反向筛选。请点击此处查看该图的放大版本。
| a. 引物序列 | |||||||
| 靶标 | 位置 | 引物 | 名称 | 序列 | Tm (°C) | ||
| pZTRL | 516 | F | pZTRL_F | <-同源区域->GCGACAGCATCACCGACTTCG | 61.23 | ||
| 7897 | R | pZTR_R | CGCCGCCTCTACCTTGCAGA<-同源区域 (RC)-> | 61.30 | |||
| pZTRK | 9154 | F | pZTRK_F | <-同源区域->ACGTTGAGCCATTAGTATCAATTTGCTTACC | 59.40 | ||
| 5897 | R | pZTR_R | CGCCGCCTCTACCTTGCAGA<-同源区域 (RC)-> | 61.30 | |||
| pURA3-AID*-6FLAG 或 pURA3_AID*-6HA | F | S3-F | <-同源区域->CGTACGCTGCAGGTCGAC | 59.21 | |||
| R | S2-R | ATCGATGAATTCGAGCTCG<-同源区域 (RC)-> | 52.76 | ||||
| pZRTL/K 用于扩增 β-雌二醇诱导型 AID 系统 | |||||||
| pURA3-AID*-6FLAG/6HA 用于扩增 AID* 和表位标签，以标记目标蛋白（Lontine 方法） | |||||||
| <-同源区域-> | 与系统插入位点侧翼区域同源的序列。该区域越长，修饰成功的可能性越高；建议长度为 50–100 个碱基。 | ||||||
| <-同源区域 (RC)-> | 与系统插入位点侧翼区域同源的序列，需使用其反向互补序列。同上，该区域越长效果越好。 | ||||||
| Tm (°C) | 采用 %GC 法计算 Tm，假设 NaCl 浓度为 50 mM | ||||||
| b. PCR 反应体系 | |||||||
| 组分 | 体积 (µL) | ||||||
| 模板 | <10 | ||||||
| NEB Phusion HF Buffer (5x)* | 100 | ||||||
| 正向引物 100 µM | 2.5 | ||||||
| 反向引物 100 µM | 2.5 | ||||||
| dNTPs 各 10 mM | 10 | ||||||
| H2O | 补足至 500 | ||||||
| * 也可使用 NEB Phusion GC Buffer (5x)，但不推荐 | |||||||
| 配制上述混合液，分装为 10 个 50 µL 的反应体系，并按照表 1 c 所示条件进行 PCR 扩增 | |||||||
| 通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果 | |||||||
| 将所有成功的扩增产物合并至一个离心管中，并进行乙醇沉淀 | |||||||
| 将 PCR 扩增所得全部产物转化至酵母中 | |||||||
| c. PCR 反应条件 | |||||||
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 | |||||
| 初始变性 | 98 | 30 s | |||||
| 25–35 个循环 | 变性 | 98 | 10 s | ||||
| 退火 | 45–60 | 20 s | |||||
| 延伸 | 72 | 30 s/kb | |||||
| 最终延伸 | 72 | 10 min | |||||
| 保存 | 8 | ||||||
| Lontine 引物组（S3-F 和 S2-R）退火温度为 45 °C，pZTRL/K 引物退火温度为 60 °C | |||||||
| Lontine PCR 延伸时间为 3 分钟，pZTRL/K PCR 延伸时间也为 3 分钟 | |||||||
表1：引物序列、PCR反应体系及PCR反应条件。
讨论
经过良好优化的实验方案可实现目标蛋白的快速高效去除。确定与β-雌二醇预孵育的合适时间非常重要，因为这有助于提高蛋白去除的可重复性，但预孵育时间的微小差异通常可以耐受。另一方面，在添加生长素后的操作时间必须严格控制，因为蛋白水平会迅速下降。
该方法的一个优势在于，通过调整β-雌二醇预孵育时间和IAA孵育时间的组合，可实现精确调控的蛋白耗竭。例如，若需要，可通过缩短预孵育时间来更缓慢地耗竭目标蛋白。
与组成型表达OsTIR的系统相比，β-est AID系统具有一些优势。例如，如果目标蛋白对细胞存活至关重要，则通过调控osTIR的表达可避免目标蛋白的过早耗竭。此外，osTIR的表达水平可依据目标蛋白的丰度及其对降解的敏感性进行调节，从而实现快速或缓慢的蛋白耗竭。两种小分子效应物β-雌二醇和生长素在本实验所用条件下不会干扰酵母的代谢，而锚定移除系统中使用的雷帕霉素则会产生干扰1。
需要注意的是，对某些蛋白质进行标记会破坏其功能，这是所有靶向降解系统都可能面临的问题。在这种情况下，N端标记可能有效，而C端标记则可能无效。此外，并非所有蛋白质都能被高效降解；例如，目标蛋白上的AID标签可能无法被osTIR蛋白接触。因此，在完成AID标记后，应对每个目标蛋白进行检测，评估标记对其生长是否产生影响，并确认降解是否有效，然后再优化β-雌二醇预孵育和生长素处理的时间条件。
该AID*系统非常简单，且与任何不涉及进一步生长的后续实验步骤兼容，例如蛋白质、DNA或RNA分析或显微镜检测。此外，该系统与硫醇标记结合用于纯化新生RNA时效果良好20。
该系统提供了一种快速、特异且可重复的蛋白质耗竭方法，且不会影响酵母细胞的其他代谢过程。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Jane Reid 发起本项目，Barbara Terlouw 对项目的推进，Vahid Aslanzadeh 提供“ura looper”载体构建，以及 Susana de Lucas 的诸多有益讨论。本研究得到了墨西哥国家科学技术理事会（CONACYT）和爱丁堡大学生物科学学院为 GIMO 提供的奖学金、IEM 获得的惠康基金会博士生奖学金 [105256]，以及 JD Beggs 获得的惠康基金会资助 [104648] 的支持。惠康细胞生物学中心的工作由惠康基金会核心资助 [092076] 支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硫酸腺嘌呤 | Formedium | DOC0230 | |
| 琼脂 | Formedium | AGA03 | |
| Β-雌二醇 | Sigma Aldrich | E2758-1G | 溶于乙醇的10 mM溶液。于-20 °C保存 |
| DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO在4 °C下应呈固态 |
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
| IAA 1H-吲哚-3-乙酸 | Across Orgainics | 122150100 | 生长素类似物。溶于DMSO的1.5 M溶液。溶液呈红褐色，并随时间推移逐渐变深；若变为深红色则应弃用，并配制新溶液。于-20 °C保存。 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | 注意：有毒且易燃 |
| Phusion 高保真DNA聚合酶 | NEB | M0530 | |
| 蛋白胨 | Formedium | PEP03 | |
| SCSM单缺组分培养基 –ura | Formedium | DSCS101 | |
| 酵母提取物 | Formedium | YEA03 | |
| 不含氨基酸但含硫酸铵的酵母氮源基础培养基 | Formedium | CYN0410 |
参考文献
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