低成本步态分析用于神经肌肉疾病小鼠模型的行为表型鉴定

摘要

足迹分析是一种低成本的替代方法，可用于研究人员量化小鼠运动异常，替代数字化步态分析程序。由于其速度快、操作简单且具有纵向研究潜力，该方法非常适合小鼠模型的行为表型分析。

摘要

动物运动能力的测量是一种常用的行为学工具，用于描述特定疾病、损伤或药物模型的表型。本文展示的低成本步态分析方法，是对小鼠模型中步态异常进行简单而有效的评估手段。通过使用无毒且可水洗的颜料涂抹小鼠足部，使其在一张纸上穿过隧道行走，从而获取足印并进行分析。测试隧道的设计利用了小鼠的自然行为特征及其对狭小昏暗空间的偏好。每只小鼠的步长、步宽和足趾展开度均可使用直尺和铅笔轻松测量。该方法成熟可靠，可提供多个与数字化系统类似的量化指标。该方法具有足够的敏感性，能够在表型出现早期检测到步长的变化，并且由于其非侵入性特点，适用于在生命周期或表型发展过程中对同一群体进行多次测试。

引言

运动需要复杂的神经和肌肉骨骼系统的协调，运动通路中任何一个方面的功能缺陷都可能导致可观察到的步态异常^1,2。步态分析是研究人员测试小鼠模型的重要工具，因为它能够提供可量化的行为数据，反映特定疾病、损伤或药物对动物运动功能的影响³。然而，数字化步态分析需要购置跑步机、摄像机及相关软件，这对研究人员而言可能成本过高。由于步态分析通常仅间歇性地用于追踪运动功能的长期变化，因此若使用频率较低，其费用可能难以合理化⁴。尽管数字化分析可能比简单的足迹分析提供更详细的步态参数，但这些更复杂的测量指标并不总是表征行为表型所必需或相关的⁵。

本文介绍一种低成本的手动足迹分析方法，可作为数字化步态分析程序的一种快速且灵敏的替代方案^6,7。手动足迹分析已被证明可在多种小鼠疾病模型中检测出显著的步态差异^{4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}，至少有一项研究显示，这种低成本方法检测到了常用数字化步态分析程序未能发现的步态变化¹²。该方法所需材料总成本极低，且可轻松适用于其他啮齿类动物研究模型。

尽管可以获取多种不同的步态参数数据，但我们所描述的方法重点关注以下三个特定指标：步长、步宽（又称“轨迹宽度”）和脚趾展开度。需要注意的是，应根据具体动物模型来确定需要评估的参数。该步态分析方法并非用于测量认知功能，也不推荐用于需要复杂步态生物力学测量的研究¹⁶。

我们展示了来自一组建模X连锁脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）的临床前及临床期小鼠的行为学数据，SBMA是一种以运动神经元变性和肌肉萎缩为特征的神经肌肉疾病。这些小鼠在步态上出现进行性缺陷，且与其它疾病特异性表型的出现时间相吻合。这证明了该方法的有效性和特异性，并证实其能够可靠地区分患病动物与非患病动物。

本研究中使用的实验小鼠为2.5个月（症状前）和9个月（症状后）龄的BAC fxAR121转基因小鼠，背景品系为C57BL/6（n_expt=12）。该模型由本实验室构建，并已被充分表征，是一种强大的脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠模型⁹。非转基因同窝小鼠作为对照组（n_ctrl=8）。脊髓延髓肌萎缩症是一种性别限制性疾病，仅在雄性中完全表现，因此本研究仅使用雄性小鼠。在实验设计阶段，研究人员必须考虑美国国立卫生研究院（NIH）关于将性别作为生物学变量的相关指南，以确定实验分组的规模和构成¹⁸。

方案

所有小鼠实验均经杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审核并批准。负责实验操作和评分的人员必须对动物的基因型或实验分组保持盲态，直至整个队列的步态分析及评分工作全部完成。

1. 测试材料的制备

1. 使用三块预先切割的透明亚克力板（厚度为 0.375 英寸）构建测试通道。用专用于粘接亚克力且干燥后不会释放气味的密封剂将面板粘合组装成通道。
   1. 对于标准的 C57BL/6 小鼠，使用以下通道尺寸：宽 2.5 英寸，高 3 英寸，长 13 英寸。小鼠必须能够舒适地穿过通道并迈出足够步数（>4 步），以便测量步态。
2. 使用厚度为 0.375 英寸的预先切割灰色亚克力板构建目标室，并使用与通道相同的密封剂将各面板粘合。该室内部尺寸为宽 4 英寸、长 4 英寸、高 3 英寸。目标室的开口应与通道开口匹配（宽 2.5 英寸 × 高 3.0 英寸）。由于小鼠天然偏好昏暗环境而非明亮环境，应选用不透明且颜色较深的材料。
3. 选用厚实且表面光滑的纸张用于足迹记录（水彩纸效果良好）。将单张纸裁剪成略宽于和略长于通道宽度与长度的纸条。若使用此处所述的通道尺寸，则将纸张裁剪为长 15 英寸、宽 3.5 英寸。
4. 使用两种颜色对比明显的无毒、可水洗的水性颜料（例如绿色和紫色）。分别指定一种颜色用于后肢，另一种用于前肢。测试后小鼠会舔舐脚上残留的颜料，因此所选颜料必须完全无毒。
5. 使用两支圆形笔身的画笔，每种颜料各用一支（直径约 0.5 cm，笔尖呈锥形或尖头状）。
6. 选用刻度精确至毫米的直尺，以及测量精度达 0.1 mm 的游标卡尺。建议使用铅笔在评分纸上书写标记。
7. 可选步骤：对于焦虑程度较高或动机较低的动物，可在目标室内提供行为激励物。例如少量灭菌的葵花籽（在测试前 2 天放入动物的饲养笼中，以使其适应）。在测试当天，将葵花籽放置于目标室内，以促使小鼠顺利穿过通道而不中途停留。

2. 数据采集

1. 若在独立房间进行测试，需先将小鼠在新房间内适应30分钟，然后开始行为学检测。此外，由于小鼠具有夜行性，测试前应确保所有小鼠已完全清醒并保持警觉至少5分钟。
2. 通过将隧道置于纸张上方并用小鼠编号和测试日期标记纸张来准备测试装置。将目标室置于隧道末端，连接两端开口。如需激励，可在隧道末端（目标室内）放置葵花籽。
3. 将待测小鼠从笼中取出，牢固地抓住其颈背部皮肤，并同时抓握尾巴以稳定其后肢活动。
4. 用颜料涂抹前肢，使所有脚趾的整个底面及足底中心完全着色。后肢则使用对比色颜料重复此步骤。若小鼠身体其他部位沾染颜料，需用干净的湿布擦拭干净，以防污迹干扰数据采集。
   注意：小鼠操作必须由经验丰富的研究人员进行，以尽量减少动物应激。
5. 将小鼠放置于隧道起始端，使其沿隧道行走至目标室，随后取出小鼠，用湿润的布轻轻擦拭其足部，并将其放回原笼。
6. 待足迹纸完全干燥后再进行评分。每只动物测试结束后，需使用乙醇或等效清洁液彻底擦拭测试区域和隧道。

3. 评分标准

1. 使用步距均匀且脚印清晰无模糊的行走轨迹进行评分。图1B 是一个可用于评分的脚印序列的良好示例。为了获得足够的评分数据，每只脚至少需要有连续的2个步态印记，但建议每只脚保留4-6个步态印记。请勿包含纸张上第一个和最后一个脚印，因为此时小鼠正在调整行走速度，这些脚印不太可能代表正常的步态。
2. 使用步长、步宽和足趾展开度作为可通过本方法分析的三种不同步态指标。
   注：步长和步宽的测量需要清晰的连续脚印，且前足区域的染料印记需明确可辨。足趾展开度的测量不需要连续的脚印，仅需单个脚印中第一和第五趾尖印记清晰即可。然而，如果某个特定脚印未被用于步长或步宽的测量，则该脚印也不能用于足趾展开度的评分。所有三项指标均以厘米为单位进行评估。
   1. 将步长定义为同一侧肢体连续两个脚印之间的距离（即一个步幅）（图1A，1B）。
      1. 用铅笔在单个步幅中两侧前肢脚印的前足区域（根据上方指定颜色识别）周围画出直径2-4 mm的圆圈，并使用直尺在两个圆心之间画一条连线。
      2. 记录两个脚印圆心之间（即每个脚垫中心）的距离，标记为右前肢1（RF1）或左前肢1（LF1）。
      3. 对所有可评分的步态重复此操作（RF2、LF2、RF3、LF3，依此类推）。
      4. 对右侧和左侧后肢脚印重复上述步骤。
      5. 计算每侧肢体所有单个步长距离的平均值。在统计分析中，可进一步计算各实验组个体间的平均值。
   2. 将步宽定义为左右前肢或左右后肢之间的距离（图1A，1B）。
      1. 为测量该距离，从一侧后肢脚印中标记出的前足区域画一条线，并使其与对侧后肢步长连线垂直相交，测量该垂直距离。
      2. 对所有可评分的后肢脚印重复此操作，然后计算测量值的平均值。前肢与后肢的步宽计算方法相同。
   3. 将足趾展开度定义为单个前肢或后肢脚印中第一趾与最后一趾之间的距离（图1A，1B）。
      1. 使用游标卡尺测量第一趾尖与最后一趾尖印记顶端之间的距离。
      2. 对所有可评分的后肢脚印重复测量并计算平均值。前肢与后肢的足趾展开度计算方法相同。
3. 若无法对纸张上的脚印进行评分，应让动物休息10分钟后再次尝试。

结果

在动物数量充足的情况下，该方法能够检测同一品系小鼠在不同时间点之间以及不同基因型小鼠的步态差异。图1B展示了我们在实验室中使用X连锁脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠模型采集的足印图像的代表性轨迹，SBMA是一种影响下运动神经元和骨骼肌的神经退行性疾病。我们此前曾报道，与非转基因同窝对照小鼠相比，雄性BAC fxAR121转基因小鼠在症状出现后阶段会出现显著的体重下降、抓力减弱以及步幅缩短⁹。

本文展示了来自一组无症状期（2.5月龄）和有症状期（9月龄）BAC fxAR121转基因雄性小鼠及其同窝非转基因对照小鼠的步态分析结果（图2）。在疾病发作前，BAC fxAR121转基因小鼠的步长、步宽和脚趾展开距离与同窝非转基因对照小鼠相似。疾病发作后，BAC fxAR121转基因小鼠的步长显著缩短（前肢 p_forelimb= 0.001，后肢 p_hind-limb= 0.009）（...

讨论

利用上述低成本步态分析方法，我们成功识别了BAC fxAR121脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠模型在出现症状后年龄阶段的多种步态功能障碍参数。步幅长度的减少与既往关于SBMA小鼠模型及人类患者的研究所报道的结果一致⁹。我们还首次发现，与非转基因同窝对照小鼠相比，出现症状的SBMA小鼠后肢脚趾展开距离存在显著差异。有趣的是，后肢脚趾展开减少可能由足部伸肌无力、屈肌紧张或神经支配不良引起^2,19，这同样符合SBMA的病因学特征。

由于小鼠天生倾向于进入狭小昏暗的空间，它们通常会迅速跑向目标室，但有些小鼠可能不会持续穿过隧道。如果小鼠在隧道内跳跃、停止或转身（见图1C中的示例），应在休息一段时间后使用新的评分纸重复实验。若小鼠在隧道起始处即停止移动，结果仍可能补救，因为通常可轻柔地推动其跑向目标箱。

在小鼠足...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
游标卡尺	n/a	n/a	刻度必须精确至 0.1 mm
手工胶水	E6000	n/a
足迹颜料（水粉颜料）	Artmind	n/a	必须为无毒材料
圆柄画笔	Symply Simmons	n/a	直径 0.5 cm
直尺	n/a	n/a	刻度必须精确至毫米
水彩纸（水彩画纸垫）	Canson	n/a	裁剪至所需尺寸
隧道与目标室	Interstate Plastics	n/a	裁剪至所需尺寸