方法文章

低成本步态分析用于神经肌肉疾病小鼠模型的行为表型鉴定

DOI：

10.3791/59878

⸱

2019年7月18日

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1Department of Neurology, Duke University School of Medicine, 2Duke Center for Neurodegeneration & Neurotherapeutics, Duke University School of Medicine, 3Biomedical Sciences Graduate Program, University of California San Diego, 4Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

本文内容

摘要

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足迹分析是一种低成本的替代方法，可用于研究人员量化小鼠运动异常，替代数字化步态分析程序。由于其速度快、操作简单且具有纵向研究潜力，该方法非常适合小鼠模型的行为表型分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

动物运动能力的测量是一种常用的行为学工具，用于描述特定疾病、损伤或药物模型的表型。本文展示的低成本步态分析方法，是对小鼠模型中步态异常进行简单而有效的评估手段。通过使用无毒且可水洗的颜料涂抹小鼠足部，使其在一张纸上穿过隧道行走，从而获取足印并进行分析。测试隧道的设计利用了小鼠的自然行为特征及其对狭小昏暗空间的偏好。每只小鼠的步长、步宽和足趾展开度均可使用直尺和铅笔轻松测量。该方法成熟可靠，可提供多个与数字化系统类似的量化指标。该方法具有足够的敏感性，能够在表型出现早期检测到步长的变化，并且由于其非侵入性特点，适用于在生命周期或表型发展过程中对同一群体进行多次测试。

引言

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运动需要复杂的神经和肌肉骨骼系统的协调，运动通路中任何一个方面的功能缺陷都可能导致可观察到的步态异常1,2。步态分析是研究人员测试小鼠模型的重要工具，因为它能够提供可量化的行为数据，反映特定疾病、损伤或药物对动物运动功能的影响3。然而，数字化步态分析需要购置跑步机、摄像机及相关软件，这对研究人员而言可能成本过高。由于步态分析通常仅间歇性地用于追踪运动功能的长期变化，因此若使用频率较低，其费用可能难以合理化4。尽管数字化分析可能比简单的足迹分析提供更详细的步态参数，但这些更复杂的测量指标并不总是表征行为表型所必需或相关的5。

本文介绍一种低成本的手动足迹分析方法，可作为数字化步态分析程序的一种快速且灵敏的替代方案6,7。手动足迹分析已被证明可在多种小鼠疾病模型中检测出显著的步态差异4,7,8,

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方案

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所有小鼠实验均经杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审核并批准。负责实验操作和评分的人员必须对动物的基因型或实验分组保持盲态，直至整个队列的步态分析及评分工作全部完成。

1. 测试材料的制备

  1. 使用三块预先切割的透明亚克力板（厚度为 0.375 英寸）构建测试通道。用专用于粘接亚克力且干燥后不会释放气味的密封剂将面板粘合组装成通道。
    1. 对于标准的 C57BL/6 小鼠，使用以下通道尺寸：宽 2.5 英寸，高 3 英寸，长 13 英寸。小鼠必须能够舒适地穿过通道并迈出足够步数（>4 步），以便测量步态。
  2. 使用厚度为 0.375 英寸的预先切割灰色亚克力板构建目标室，并使用与通道相同的密封剂将各面板粘合。该室内部尺寸为宽 4 英寸、长 4 英寸、高 3 英寸。目标室的开口应与通道开口匹配（宽 2.5 英寸 × 高 3.0 英寸）。由于小鼠天然偏好昏暗环境而非明亮环境，应选用不透明且颜色较深的材料。
  3. 选用厚实且表面光滑的纸张用于足迹记录（水彩纸效果良好）。将单张纸裁剪成略宽于和略长于通道宽度与长度的纸条。若使用此处所述的通道尺寸，则将纸张裁剪为长 15 英寸、宽 3.5 英寸。
  4. 使用两种颜色对比明显的无毒、可水洗的水性颜料（例如绿色和紫色）。分别指定一种颜色用于后肢，另一种用于前肢。测试后小鼠会舔舐脚上残留的颜料，因此所选颜料必须完全....

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结果

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在动物数量充足的情况下，该方法能够检测同一品系小鼠在不同时间点之间以及不同基因型小鼠的步态差异。图1B展示了我们在实验室中使用X连锁脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠模型采集的足印图像的代表性轨迹，SBMA是一种影响下运动神经元和骨骼肌的神经退行性疾病。我们此前曾报道，与非转基因同窝对照小鼠相比，雄性BAC fxAR121转基因小鼠在症状出现后阶段会出现显著的体重下降、抓力减弱以及步幅缩短9。

本文展示了来自一组无症状期（2.5月龄）和有症状期（9月龄）BAC fxAR121转基因雄性小鼠及其同窝非转基因对照小鼠的步态分析结果（图2）。在疾病发作前，BAC fxAR121转基因小鼠的步长、步宽和脚趾展开距离与同窝非转基因对照小鼠相似。疾病发作后，BAC fxAR121转基因小鼠的步长显著缩短（前肢 pforelimb= 0.001，后肢 phind-limb= 0.009）（.......

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讨论

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利用上述低成本步态分析方法，我们成功识别了BAC fxAR121脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠模型在出现症状后年龄阶段的多种步态功能障碍参数。步幅长度的减少与既往关于SBMA小鼠模型及人类患者的研究所报道的结果一致9。我们还首次发现，与非转基因同窝对照小鼠相比，出现症状的SBMA小鼠后肢脚趾展开距离存在显著差异。有趣的是，后肢脚趾展开减少可能由足部伸肌无力、屈肌紧张或神经支配不良引起2,19，这同样符合SBMA的病因学特征。

由于小鼠天生倾向于进入狭小昏暗的空间，它们通常会迅速跑向目标室，但有些小鼠可能不会持续穿过隧道。如果小鼠在隧道内跳跃、停止或转身（见图1C中的示例），应在休息一段时间后使用新的评分纸重复实验。若小鼠在隧道起始处即停止移动，结果仍可能补救，因为通常可轻柔地推动其跑向目标箱。

在小鼠足.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢 A.M. 在动物鉴定方面的协助。本工作由美国国立卫生研究院基金（R01 7 RF1 AG057264 资助 A.R.L.S. 和 C.J.C.，R01 NS100023 资助 A.R.L.S.）以及肌肉萎缩症协会（基础研究基金资助 A.R.L.S.，发展基金资助 C.J.C.）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
游标卡尺n/an/a刻度必须精确至 0.1 mm
手工胶水E6000n/a
足迹颜料（水粉颜料）Artmindn/a必须为无毒材料
圆柄画笔Symply Simmonsn/a直径 0.5 cm
直尺n/an/a刻度必须精确至毫米
水彩纸（水彩画纸垫）Cansonn/a裁剪至所需尺寸
隧道与目标室Interstate Plasticsn/a裁剪至所需尺寸

参考文献

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  1. Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73 (1-2), 159-164 (2001).
  2. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50(2015).
  3. Carter, R. J., Mor....

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