需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种用于活细胞中Fura-2类似物检测细胞内Ca2+时校正烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的新方法

5.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59881

⸱

2019年9月20日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Ulsan College of Medicine/Asan Medical Center, 2Asan Medical Center, 3Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology

本文内容

摘要

由于NADH和fura-2类似物的激发波长与发射波长存在光谱重叠，因此在活细胞中对[Ca2+]进行定量测定时，这两种化学物质的信号干扰不可避免。为此，开发了一种新型的在线校正NADH信号干扰以测定[Ca2+]的方法。

摘要

为了定量测量[Ca2+]，通常使用作为比率型荧光探针的fura-2类似物。然而，由于内源性荧光干扰（主要来自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）），染料在活细胞中的应用本质上受到限制。更具体而言，当使用fura-2类似物定量测定线粒体[Ca2+]时，这是一个主要障碍，因为大部分NADH存在于线粒体中。如果荧光染料浓度相同，则特定激发强度应产生相同的发射强度。因此，两种不同激发波长下的发射强度比值应保持恒定。基于这一原理，开发了一种新型在线校正NADH信号干扰以测量[Ca2+]的方法，从而可以获得NADH和fura-2的真实信号强度。此外，还建立了一个新的方程，利用等吸收点激发或在400 nm激发来计算[Ca2+]。利用该方法，成功地测量了线粒体[Ca2+]的变化。另外，通过采用不同的激发和发射波长组合，可同时测量多个参数，包括NADH、[Ca2+]以及pH或线粒体膜电位（Ψm）。线粒体[Ca2+]与Ψm或pH分别使用fura-2-FF和四甲基罗丹明乙酯（TMRE）或羧基-硒萘罗丹明荧光素-1（carboxy-SNARF-1）进行测量。

引言

细胞内 Ca2+ 的重要作用广为人知1。定量测定 [Ca2+] 对于理解细胞生理功能过程至关重要。Fura-2 类似物非常有用，因为它们可在紫外光范围（<400 nm）被激发，并且可采用比率法进行定量测量。因此，其他生理参数（如 pH、膜电位等）也可通过其他荧光染料同时测定。据报道，线粒体 Ca2+ 浓度（[Ca2+]m）范围为 0.08−20 μM2,3,4,5。在 Fura-2 类似物中，Fura-2-FF 适用于测量该范围内的 [Ca2+]。然而，活细胞因其代谢过程含有 NADH/NADPH，而 NADH 由于与 Fura-2 类似物的激发和发射光谱重叠，会产生信号干扰。这种干扰极大地限制了 Fura-2 类似物的应用。特别是当该类似物用于测量线粒体 [Ca2+] 时，这一干扰成为最大的障碍，因为线粒体中含有最丰富的 NADH。情况进一步复杂化的是，NADH 的变化与线粒体膜电位（Ψm）相关，而 Ψm 的变化又会影响 [Ca2+]m6,7,8,9。此外，研究 [Ca2+]m 动态变化时，了解其他线粒体参数（如 NADH、Ψm 和 pH）的状态至关重要。

在353 nm、361 nm和400 nm激发下，450 nm和500 nm处的发射信号包含来自NADH和fura-2-FF的信号，其方程如下。其中，353 nm和361 nm分别为fura-2-FF在450 nm和500 nm发射时的等吸收点。

F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,Fura                               公式 1
F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,Fura                                公式 2
F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,Fura                                公式 3

其中，Fx,y 表示在 x nm 激发下于 y nm 处测得的发射强度，Fx,y,NADH 表示仅由 NADH 贡献的发射强度，Fx,y,Fura 表示仅由 fura-2-FF 贡献的发射强度。在荧光染料浓度相同的情况下，特定的激发强度应产生相同的发射强度。因此，两种不同激发波长下的发射强度比值应为常数。Ca2+ 和 fura-2 不影响 NADH 的荧光特性，因此在任意激发波长下，NADH 在 450 nm 与 500 nm 处的发射强度比值保持恒定。基于 NADH 或 [Ca2+] 不影响 fura-2-FF 的激发和发射光谱这一假设，该规则同样适用于 fura-2-FF。然而，Ca2+ 会引起 fura-2-FF 发射光谱的偏移。因此，为了消除 Ca2+ 的影响，需使用不受 Ca2+ 影响的等吸收点（isosbestic）激发波长。每个发射波长（即 450 nm 和 500 nm）具有不同的等吸收点，根据我们的实验设置，选择 500 nm 发射对应的 353 nm 和 450 nm 发射对应的 361 nm 作为等吸收激发波长。据此可得以下方程10。

Rf = F361,450,Fura/F353,500,Fura                                公式 4
RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH                                公式 5
RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH                                公式 6

根据这些常数，以下公式（公式 1）、（公式 2）和（公式 3）成立。

F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,Fura                                公式 7
F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,Fura                                公式 8
F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,Fura                                公式 9

根据这些方程，如果已知 Rf、RN1 和 RN2，则可按如下方法获得 NADH 和 fura-2 的纯信号。

F361,450,NADH = (F361,450 - Rf × F353,500)/(1 − Rf × RN2)                                公式 10
F353,500,Fura = (RN2 × F361,450 − F353,500)/(Rf × RN2 − 1)                                公式 11
F400,500,Fura = F400,500 − RN1 × F361,450,NADH                                 公式 12
RFura = F353,500,Fura/F400,500,Fura                                公式 13

Fura-2-FF 的 Ca2+ 结合形式在 400 nm 激发波长下几乎不产生荧光。基于这一特性，可推导出以下新的校准方程。

[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max) × (RFura − Rmin)                                公式 14

其中，Kd 为解离常数，F400,500,max 和 F353,500,max 分别表示在 400 nm 和 353 nm 激发下于 500 nm 处发射信号的最大值，Rmin 为无 Ca2+ 条件下 RFura 的最小值。由于采用了等吸收点激发，该方程可进一步简化如下。

[Ca2+] = Kd ∙ (1 / Rmin) ∙ (RFura − Rmin)                                公式 15

因此，仅需 Kd 和 Rmin 值即可计算 [Ca2+]。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验方案均经当地机构动物护理与使用委员会批准。

1. 溶液配制

  1. 制备单个新鲜分离的心肌细胞11.
    注意：每个实验室的细胞保存溶液可能不同。此处，心肌细胞保存在培养基（DMEM）中。
  2. 配制 100 mL 的 Ca2+-无溶液（表1).
  3. 在50 mL烧杯中配制50 mL培养基。分装5 mL至另一容器，置于37 °C水浴中。其余溶液于室温保存。
  4. 通过将 5 mg 皂苷加入 50 mL Ca2+无菌溶液
    注意：皂苷用于透化心肌细胞，去除胞质成分，仅用于观察线粒体荧光。
  5. 配制16 μL浓度为1 mM的fura-2-FF-AM，溶于二甲基亚砜（DMSO）中。
    注意：用DMSO配制1 mM的fura-2-FF-AM储备液，分装至2 mL离心管中，每管16 μL。-20 °C保存，直至使用。
  6. 制备 50 mL 无 NADH 的 Ca2+无溶液（表1）和 50 mL 无 NADH 的 Ca2+-饱和溶液（表1在测量等吸收点时进行。用 KOH 调节 pH 至 7.0。
    注意：无 NADH 的 Ca2+无溶液表1含有10 µM FCCP和100 µM ADP，不含任何线粒体底物，以最大限度减少线粒体内的NADH。
  7. 制备 50 mL 的 Ca2+无底物溶液、50 mL 苹果酸溶液、50 mL 丙酮酸溶液、50 mL 苹果酸-丙酮酸溶液，以及用于NADH校正因子测定的50 mL 鱼藤酮溶液（表1).

2. 线粒体中Fluoroprobe的加载步骤

  1. 通过将 2 mL 培养基加入 16 µL 的 1 mM fura-2-FF-AM 中来配制染料负载溶液。
    注意：荧光染料对光敏感。请在使用前立即配制，并将含荧光染料的溶液置于避光处。fura-2-FF-AM 的终浓度为 8 µM。若使用 carboxy-SNARF-1，则用 2 µM carboxy-SNARF-1-AM 配制染料负载溶液。
  2. 取 2 mL 分离的细胞，置于 5 mL 试管中，保持直立。
  3. 静置 15 分钟，使心肌细胞沉降至管底，然后吸除上清液。
    注意：上清液中可能含有细胞碎片。请勿离心，以免损伤细胞。
  4. 加入 2 mL 染料负载溶液。
  5. 在 4 °C 条件下，将染料负载溶液与细胞共同孵育 60 分钟。
  6. 随后，将试管直立放入 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
  7. 吸除上清液，加入 4 mL 预热至 37 °C 的培养基，并在 37 °C 水浴中继续孵育细胞 60 分钟。
  8. 最后，吸除上清液，加入 4 mL 室温培养基，并将试管置于室温下保存。

3. 多参数测量系统的介绍

注意：图1 显示了整个系统的示意图。

  1. 使用快速单色器（polychrome II）作为激发光源，可在 3 ms 内切换光线。
  2. 采用油浸物镜（40倍，数值孔径 NA 1.3）与倒置显微镜结合，以增强信号强度。
  3. 使用近红外滤光片和电荷耦合器件（CCD）相机监测观察视野，避免荧光信号干扰。
  4. 捕获观察视野图像以获取区域信息。
  5. 通过视场光阑调节显示器上的观察视野，仅显示细胞区域，以降低背景干扰。
  6. 使用四个带通滤光片（450、500、590 和 640 nm）的光电倍增管，采用光子计数法检测发射波长。选用合适的二向色镜对发射光进行分光和重定向。
    注意：激发光强度远高于发射光。因此，应选择具有最强阻断特性的带通滤光片以降低背景信号。光子计数系统由光电倍增管（PMT）、光子计数单元和高速计数器组合而成。为控制该系统并采集数据，使用了自行开发的驱动软件。需探索将此方法应用于其他系统的方式。

4. 使用多参数测量系统的NADH校正方法

  1. 原位鉴定Fura-2-FF的等吸收点
    注意：许多研究报告指出，细胞的荧光特性会发生改变。因此，应执行所有步骤以获取用于校正干扰的参数 原位
    1. 将染料负载的细胞置于显微镜载物台上，静置3分钟，使细胞沉降至底部。
      注意：调整细胞数量，使在40倍物镜下每个视野约有一个细胞。
    2. 灌注无 NADH 的 Ca2+37 °C 的无血清溶液中
    3. 靶向细胞后，测量无细胞背景和细胞区域，如第4.1节所示。根据细胞区域计算细胞背景。
      注意：每次实验均需校正两个背景信号。
    4. 灌注皂苷溶液 60 秒，然后恢复至无 NADH 的 Ca2+无菌溶液
    5. 通过以0.1 nm为步长在350 nm至365 nm范围内进行激发扫描，同时在450 nm和500 nm处检测Fura-2-FF发射信号。
    6. 灌注无NADH的Ca2+-饱和溶液，并重复步骤4.2.5。
    7. 减去 Ca 信号中的背景信号2+-饱和溶液中来自Ca的信号2+无菌条件
    8. 重复步骤4.2.2至4.2.7，对其他单个心肌细胞进行相同操作。
      注意：如果信号强度变弱，请从步骤 4.2.1 重新开始。对至少 5 个不同的细胞重复该操作。
    9. 根据所有获得的信号，计算每种激发波长下的发射光标准差，并选择标准差（SD）值最小的激发波长作为等吸收点。
      注意：代表性图像如下所示 图2.
  2. 细胞面积的背景信号检测与校正方法
    注意：背景信号有两种来源，一种来自细胞本身，另一种来自盖玻片表面的反射（即无细胞背景）。每次实验中均需对这两种背景进行校正。
    1. 将无染料的细胞置于显微镜载物台的灌流槽中，静置3分钟使细胞沉降至底部。灌注无NADH的Ca2+无溶液环境静置约 5 分钟。
      注意：所有溶液灌流速度为 2-3 mL/min，温度 37 °C。
      注意：调整细胞数量，使用40倍物镜时每个视野约有一个细胞。
    2. 将目标区域设置为覆盖目标细胞。
    3. 将细胞移出视野后，测量无细胞窗口的背景信号，并将其设为偏移量。
      注：信号指光子计数系统中待检测的光信号。
    4. 将细胞移回初始位置，测量细胞的背景信号和细胞面积。
      注意：尽管激发光已通过带通滤光片进行过滤，但仍含有较大量的残余滤除光。当这些光照射到细胞时会发生散射，由于光子计数系统具有高灵敏度，从而产生显著的背景信号，因此需要对此进行校正。
      注意：细胞面积可通过捕获的细胞图像和可用的成像软件进行计算。细胞面积的单位可以是任意单位，包括像素数，但需进行标准化。
    5. 重复步骤 4.1.1 至 4.1.4 共 10 次，以获得细胞面积与细胞背景信号之间的关系。
      注意：随后可根据该关系式从细胞区域计算细胞背景信号。由于激发光源灯泡会逐渐老化，此步骤需至少每月重复一次。
  3. R因子的测定
    1. 根据第4.2节中获得的信号，使用公式4计算Rf。
    2. 将未染色的细胞置于显微镜下，并灌注 Ca2+无溶液
    3. 测量信号，例如 F361, 450, NADH，F400, 500, NADH，F361, 450, NADH，以及 F353, 500，NADH.
    4. 灌注苹果酸溶液，重复步骤4.3.3，并测量信号。
    5. 灌注丙酮酸溶液，重复步骤4.3.3，并测量信号。
    6. 灌注苹果酸-丙酮酸溶液，重复步骤4.3.3，并测量信号。
    7. 灌注鱼藤酮溶液，重复步骤 4.3.3，并测量信号。
      注意：图中显示的是在5 mM丙酮酸、5 mM苹果酸加5 mM丙酮酸以及添加10 µM鱼藤酮条件下记录的NADH信号示例 图3.
    8. 计算 F 的每条斜率361, 450, NADH 与 F 相比400, 500, NADH 和 F361, 450, NADH 对比 F353, 500, NADH如图所示 图3每条斜率代表 RN1 和 RN2.

5. TMRE 或羧基-SNARF-1 的激发光与发射光选择

  1. 如果额外使用了TMRE来检测线粒体膜电位，则采用530 nm的激发波长和590 nm的发射波长。
  2. 如果额外使用了羧基-SNARF-1来检测线粒体膜电位，则采用540 nm的激发波长，以及590 nm和640 nm的发射波长12。

6. fura-2-FF 的 Kd 值选择

  1. pH 的变化可能影响 fura-2-FF 结合 Ca2+ 的 Kd 值10。线粒体中请使用 pH 7.5 时的 Kd 值 5.28。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

由于校正引起的线粒体 Ca2+ 变化10
图 4 显示了校正前后 [Ca2+]m 的变化。结果清楚地表明 [Ca2+]m 发生了显著改变。在无胞质 Ca2+（[Ca2+]c）条件下，线粒体静息钙浓度为 1.03 ± 0.13 µM（均值 ± 标准误，n = 32），而在 1-µM [Ca2+]c 条件下，[Ca2+]m 的最大值达到 29.6 ± 1.61 µM（均值 ± 标准误，n = 33）（图 5）。

同时测量 NADH、[Ca2+] 和 Ψm10
带正电荷的 TMRE 可以依据膜电位进行分布。可...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

已成功开发出一种干扰校正方法，用于准确测量NADH和fura-2类似物的信号。信号的精确测量是实现准确校正的关键。然而，荧光装置本身的固有特性会产生与NADH或fura-2无关的背景信号。即使最高质量的带通滤光片也只能阻隔至多10−8的非目标波长光。然而，单个细胞产生的荧光信号非常微弱，经过带通滤光片后残留的激发光反射仍足够强，会污染真实的荧光信号。因此，必须对背景信号进行仔细校正。

Fura-2 在用于测量线粒体 Ca2+ 时存在负载问题。首先，很难将染料特异性地导入线粒体，而对其他细胞器的非特异性负载可能导致错误结果。线粒体内的 Ca2+ 浓度通常高于细胞质，因此使用具有较高 Kd 值的 fura-2-FF 可避免细胞质 Ca2+ 变化带来的干扰。另一个可能造成干扰的细胞器是肌浆网（SR）。然而，由于分布容积的差异（大鼠心室肌细胞中 SR 占 3.5%，线粒体占 34%−36%）13,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部长资助的基础科学研究中心项目（2018R1A6A3A01011832）以及科学技术信息通信部支持 & 未来规划（NRF-2016M3C1A6936606）以及贸易、工业 & 能源 (10068076)

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>2 mL 离心管AxygenMCT-200-C2 mL 离心管
<强>模数/数模转换器InstrutechITC-18仪器设备
<强>ADP，腺苷5′-二磷酸′二磷酸一钾二水合物Sigma-AldrichA5285化学品
<强>带通滤光片伊灵电光有限公司35-3920设备，640±11 nm
<强>带通滤光片Omega Optical690-9823设备，590±15 nm
<强>带通滤光片Omega Optical500DF20-9916设备，500±20 nm
<强>带通滤光片Chroma Technology Corp.60685设备，450±30 nm
<强>氯化钙溶液Sigma-Aldrich21114化学品
<强>羧基-SNARF-1(AM)InvitrogenC1272化学品
<强>电荷耦合器件（CCD）相机飞利浦FTM1800NH/HGI仪器设备
<强>二向色镜Chroma Technology Corp.86009设备，多波段二向色镜，反射： <400 nm, 490±10, 560±10，透射率：460±15, 510±20, >580 nm
<强>二向色镜Chroma Technology Corp.567DCXRU设备，反射 <560 nm，透射率： > 580 nm
<强>二向色镜Chroma Technology Corp.480dclp设备，反射： <470 nm，透射率： > 490 nm
<强>二向色镜Chroma Technology Corp.20728设备，多波段二向色镜，反射： <405纳米，470±30，透射率：430 nm～520 nm > 640 nm
<强>二甲基亚砜(DMSO)Sigma-Aldrich154938化学品
<强>DMEM，杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基Sigma-AldrichD5030化学品
<强>EGTA，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，乙二胺四乙酸四乙酸，乙二醇醚二胺四乙酸Sigma-aldrichE4378化学品
<强>FCCP，4-三氟甲氧基苯基腙基丙酮腈Sigma-Aldrich21857化学品
<强>视场光阑尼康86506仪器设备
<强>Fura-2-FF(AM)TEFLABS137化学品
<强>绿管DWM试管
<强>HEPES  4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)Sigma-AldrichH3375化学品
<强>高速计数器国家仪器公司NI-6022仪器设备
<强>热反射镜Chroma Technology Corp.21002设备，50:50
<强>倒置显微镜 尼康TE-300仪器设备
<强>苹果酸Sigma-Aldrich27606化学品
<强>近红外滤光片 Chroma Technology Corp.D750/100X设备，750±100 nm
<强>油浸物镜 尼康MRF0140040x，数值孔径 1.3；设备
<强>光子计数器单元滨松C3866仪器设备
<强>光电倍增管滨松R2949仪器设备
<强>多色染色 II蒂尔光子学SA3/MG04仪器设备
<强>氯化钾默克1.04936化学品
<强>氢氧化钾溶液Sigma-AldrichP4494化学品
<强>丙酮酸Sigma-Aldrich107360化学品
<强>鱼藤酮Sigma-AldrichR8875化学品
<强>皂苷Sigma-AldrichS4521化学品
<强>四甲基罗丹明乙酯（TMRE） 分子探针T669化学品

参考文献

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
  3. Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
  4. Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
  5. Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
  6. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  7. Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
  8. Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
  9. Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
  10. Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
  11. Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
  12. Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
  13. Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
  14. Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
  15. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

NADH NADH 1
一种用于活细胞中Fura-2类似物检测细胞内Ca2+时校正烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的新方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。