一种用于活细胞中Fura-2类似物检测细胞内Ca2+时校正烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的新方法

摘要

由于NADH和fura-2类似物的激发波长与发射波长存在光谱重叠，因此在活细胞中对[Ca²⁺]进行定量测定时，这两种化学物质的信号干扰不可避免。为此，开发了一种新型的在线校正NADH信号干扰以测定[Ca²⁺]的方法。

摘要

为了定量测量[Ca²⁺]，通常使用作为比率型荧光探针的fura-2类似物。然而，由于内源性荧光干扰（主要来自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）），染料在活细胞中的应用本质上受到限制。更具体而言，当使用fura-2类似物定量测定线粒体[Ca²⁺]时，这是一个主要障碍，因为大部分NADH存在于线粒体中。如果荧光染料浓度相同，则特定激发强度应产生相同的发射强度。因此，两种不同激发波长下的发射强度比值应保持恒定。基于这一原理，开发了一种新型在线校正NADH信号干扰以测量[Ca²⁺]的方法，从而可以获得NADH和fura-2的真实信号强度。此外，还建立了一个新的方程，利用等吸收点激发或在400 nm激发来计算[Ca²⁺]。利用该方法，成功地测量了线粒体[Ca²⁺]的变化。另外，通过采用不同的激发和发射波长组合，可同时测量多个参数，包括NADH、[Ca²⁺]以及pH或线粒体膜电位（Ψ_m）。线粒体[Ca²⁺]与Ψ_m或pH分别使用fura-2-FF和四甲基罗丹明乙酯（TMRE）或羧基-硒萘罗丹明荧光素-1（carboxy-SNARF-1）进行测量。

引言

细胞内 Ca²⁺ 的重要作用广为人知¹。定量测定 [Ca²⁺] 对于理解细胞生理功能过程至关重要。Fura-2 类似物非常有用，因为它们可在紫外光范围（<400 nm）被激发，并且可采用比率法进行定量测量。因此，其他生理参数（如 pH、膜电位等）也可通过其他荧光染料同时测定。据报道，线粒体 Ca²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_m）范围为 0.08−20 μM^2,3,4,5。在 Fura-2 类似物中，Fura-2-FF 适用于测量该范围内的 [Ca²⁺]。然而，活细胞因其代谢过程含有 NADH/NADPH，而 NADH 由于与 Fura-2 类似物的激发和发射光谱重叠，会产生信号干扰。这种干扰极大地限制了 Fura-2 类似物的应用。特别是当该类似物用于测量线粒体 [Ca²⁺] 时，这一干扰成为最大的障碍，因为线粒体中含有最丰富的 NADH。情况进一步复杂化的是，NADH 的变化与线粒体膜电位（Ψ_m）相关，而 Ψ_m 的变化又会影响 [C....

方案

所有实验方案均经当地机构动物护理与使用委员会批准。

1. 溶液配制

1. 制备单个新鲜分离的心肌细胞¹¹.
   注意：每个实验室的细胞保存溶液可能不同。此处，心肌细胞保存在培养基（DMEM）中。
2. 配制 100 mL 的 Ca²⁺-无溶液（表1).
3. 在50 mL烧杯中配制50 mL培养基。分装5 mL至另一容器，置于37 °C水浴中。其余溶液于室温保存。
4. 通过将 5 mg 皂苷加入 50 mL Ca²⁺无菌溶液
   注意：皂苷用于透化心肌细胞，去除胞质成分，仅用于观察线粒体荧光。
5. 配制16 μL浓度为1 mM的fura-2-FF-AM，溶于二甲基亚砜（DMSO）中。
   注意：用DMSO配制1 mM的fura-2-FF-AM储备液，分装至2 mL离心管中，每管16 μL。-20 °C保存，直至使用。
6. 制备 50 mL 无 NADH 的 Ca²⁺无溶液（表1）和 50 mL 无 NADH 的 Ca²⁺-饱和溶液（表1在测量等吸收点时进行。用 KOH 调节 pH 至 7.0。
   注意：无 N....

结果

由于校正引起的线粒体 Ca²⁺ 变化¹⁰
图 4 显示了校正前后 [Ca²⁺]_m 的变化。结果清楚地表明 [Ca²⁺]_m 发生了显著改变。在无胞质 Ca²⁺（[Ca²⁺]_c）条件下，线粒体静息钙浓度为 1.03 ± 0.13 µM（均值 ± 标准误，n = 32），而在 1-µM [Ca²⁺]_c 条件下，[Ca²⁺]_m 的最大值达到 29.6 ± 1.61 µM（均值 ± 标准误，n = 33）（图 5）。

同时测量 NADH、[Ca²⁺] 和 Ψ_m¹⁰
带正电荷的 TMRE 可以依据膜电位进行分布。可.......

讨论

已成功开发出一种干扰校正方法，用于准确测量NADH和fura-2类似物的信号。信号的精确测量是实现准确校正的关键。然而，荧光装置本身的固有特性会产生与NADH或fura-2无关的背景信号。即使最高质量的带通滤光片也只能阻隔至多10⁻⁸的非目标波长光。然而，单个细胞产生的荧光信号非常微弱，经过带通滤光片后残留的激发光反射仍足够强，会污染真实的荧光信号。因此，必须对背景信号进行仔细校正。

Fura-2 在用于测量线粒体 Ca²⁺ 时存在负载问题。首先，很难将染料特异性地导入线粒体，而对其他细胞器的非特异性负载可能导致错误结果。线粒体内的 Ca²⁺ 浓度通常高于细胞质，因此使用具有较高 K_d 值的 fura-2-FF 可避免细胞质 Ca²⁺ 变化带来的干扰。另一个可能造成干扰的细胞器是肌浆网（SR）。然而，由于分布容积的差异（大鼠心室肌细胞中 SR 占 3.5%，线粒体占 34%−36%）^13,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>2 mL 离心管	Axygen	MCT-200-C	2 mL 离心管
<强>模数/数模转换器	Instrutech	ITC-18	仪器设备
<强>ADP，腺苷5′-二磷酸′二磷酸一钾二水合物	Sigma-Aldrich	A5285	化学品
<强>带通滤光片	伊灵电光有限公司	35-3920	设备，640±11 nm
<强>带通滤光片	Omega Optical	690-9823	设备，590±15 nm
<强>带通滤光片	Omega Optical	500DF20-9916	设备，500±20 nm
<强>带通滤光片	Chroma Technology Corp.	60685	设备，450±30 nm
<强>氯化钙溶液	Sigma-Aldrich	21114	化学品
<强>羧基-SNARF-1(AM)	Invitrogen	C1272	化学品
<强>电荷耦合器件（CCD）相机	飞利浦	FTM1800NH/HGI	仪器设备
<强>二向色镜	Chroma Technology Corp.	86009	设备，多波段二向色镜，反射： <400 nm, 490±10, 560±10，透射率：460±15, 510±20, >580 nm
<强>二向色镜	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	设备，反射 <560 nm，透射率： > 580 nm
<强>二向色镜	Chroma Technology Corp.	480dclp	设备，反射： <470 nm，透射率： > 490 nm
<强>二向色镜	Chroma Technology Corp.	20728	设备，多波段二向色镜，反射： <405纳米，470±30，透射率：430 nm～520 nm > 640 nm
<强>二甲基亚砜(DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	化学品
<强>DMEM，杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基	Sigma-Aldrich	D5030	化学品
<强>EGTA，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，乙二胺四乙酸四乙酸，乙二醇醚二胺四乙酸	Sigma-aldrich	E4378	化学品
<强>FCCP，4-三氟甲氧基苯基腙基丙酮腈	Sigma-Aldrich	21857	化学品
<强>视场光阑	尼康	86506	仪器设备
<强>Fura-2-FF(AM)	TEFLABS	137	化学品
<强>绿管	DWM		试管
<强>HEPES  4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)	Sigma-Aldrich	H3375	化学品
<强>高速计数器	国家仪器公司	NI-6022	仪器设备
<强>热反射镜	Chroma Technology Corp.	21002	设备，50:50
<强>倒置显微镜	尼康	TE-300	仪器设备
<强>苹果酸	Sigma-Aldrich	27606	化学品
<强>近红外滤光片	Chroma Technology Corp.	D750/100X	设备，750±100 nm
<强>油浸物镜	尼康	MRF01400	40x，数值孔径 1.3；设备
<强>光子计数器单元	滨松	C3866	仪器设备
<强>光电倍增管	滨松	R2949	仪器设备
<强>多色染色 II	蒂尔光子学	SA3/MG04	仪器设备
<强>氯化钾	默克	1.04936	化学品
<强>氢氧化钾溶液	Sigma-Aldrich	P4494	化学品
<强>丙酮酸	Sigma-Aldrich	107360	化学品
<强>鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875	化学品
<强>皂苷	Sigma-Aldrich	S4521	化学品
<强>四甲基罗丹明乙酯（TMRE）	分子探针	T669	化学品