一种新型的尼古丁酰胺二丁二核苷酸校正方法，用于在活细胞中使用Fura-2-模拟进行细胞内Ca2+测量

Summary

由于NADH和fura-2类似物的激发和发射波长的光谱重叠，在[Ca^2]的定量测量中，活细胞中两种化学物质的信号干扰是不可避免的。因此，开发了一种新型的NADH信号干扰在线校正方法，以测量[Ca^2]。

Abstract

为了定量测量[Ca^2]，经常使用fura-2类比，即比例荧光探针。然而，由于自荧光干扰，染料在活细胞中的使用受到内在限制，主要来自烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）。更具体地说，这是使用 fura-2 模拟体定量测量线粒体 [Ca^2]时的一个主要障碍，因为 NADH 的大部分位于线粒体中。如果荧光染料浓度相同，则一定的激发强度应产生相同的发射强度。因此，两个不同激发波长的发射强度比应该是恒定的。基于此原理，开发了一种新型的NADH信号干扰测量在线校正方法，并得到了NADH和fura-2的实际信号强度。此外，在400nm处，在无共态激发或激发下，开发了一种计算[Ca^2]的新方程。使用这种方法，可以成功地测量线粒体 [Ca^2]的变化。此外，使用一组不同的激发和发射波长，可以同时测量多个参数，包括NADH、[Ca^2]和pH或线粒体膜电位（μm）。线粒体 [Ca^2]和_μm或 pH 值使用 fura-2-FF 和四甲基二甲胺乙酯 （TMRE） 或半磷酸二酯-1（卡博比-SNARF-1）进行测量。

Introduction

细胞内Ca²⁺的重要作用^{是众所周知的1。}[Ca^2]的量化对于了解细胞生理功能的过程至关重要。Fura-2 类比非常有用，因为它们在 UV 范围（<400 nm）中激发，比例测量方法可用于定量测量。因此，其他生理参数，如pH、膜电位等，可以使用其他荧光染料进行测量。据报道，线粒体Ca²⁺浓度（[Ca^2+]_m）范围为0.08±20 μM^{2，3，4，5。}在 fura-2 模拟中，fura-2-FF 适用于测量此范围 [Ca^2]。然而，不幸的是，活细胞含有NADH/NADPH的代谢过程，NADH产生信号干扰，因为与fura-2模拟的激发和发射光谱重叠。这种干扰极大地限制了 fura-2 模拟物的使用。具体来说，如果应用模拟测量线粒体[Ca^2]，这种干扰是最大的障碍，因为NADH的最大量是线粒体。这与线粒体膜电位 （μ_m）相关的 NADH 变化进一步复杂化，而 α_m的变化影响 [Ca^2]_m

Protocol

所有实验协议都通过了当地机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 解决方案准备

1. 准备单新鲜分离的心脏肌^细胞11。
   注:每个实验室可能有不同的细胞存储解决方案。在这里，肌细胞存储在培养基（DMEM）中。
2. 准备 100 mL 的 Ca²⁺无解决方案 （表 1.
3. 在 50 mL 烧杯中准备 50 mL 的培养基。5 mL，在 37°C 下放入水浴中。将剩余的溶液保持在室温下。
4. 通过在 50 mL 的 Ca²⁺无溶液中加入 5 毫克皂苷，制备 50 mL 的皂苷溶液。
   注:皂苷用于渗透心肌细胞，去除细胞体隔间，并仅可视化线粒体荧光。
5. 制备16 μL的1 mM fura-2-FF-AM溶解在二甲基硫酸盐（DMSO）中。
   注:在2mL管中制造1mM库存溶液，将Fura-2-FF-AM溶解在DMSO中，在2mL管中等分16μL。将它们储存在-20°C，直到使用。
6. 在测量无状态点时，准备 50 mL 的无 NADH Ca²⁺无抗性溶液（表 1）和 50 mL 的 NADH 无 Ca²⁺饱和溶液（表 1）。使用 KOH 将 p....

Results

线粒体 Ca²⁺因校正¹⁰而改变
图 4显示了_更正前后[Ca^2]m 中的更改。结果清楚地表明了[Ca^2]_m的重大变化。无细胞Ca^{2+（[Ca 2+}_]c ） 的线粒体静钙浓度为 1.03 ± 0.13 μM （均值 = S.E.， n = 32），最大 [Ca^2]m_在1-μM [Ca^2]_c为 29.6 ± 1.61 μM （均值 = S.E.，n = 33） （图 5）。

同时测量 NADH、[Ca^2]和_+m¹⁰
带正电荷的TMRE可以以膜电位相关的方式分布。膜电位可以使用Nernst的方程计算，每个隔间中的.......

Discussion

成功地开发了用于测量NADH和fura-2模拟信号的干扰校正方法。准确测量信号对于精确校正至关重要。然而，荧光装置的固有特性会产生与Fura-2的NADH无关的背景信号。最高质量的带通滤波器只能传递^多达10~8个不需要的光波长。然而，来自单个细胞的荧光信号非常小，带通滤波器后激发光的反射仍然足够强，足以污染实际的荧光信号。因此，有必要仔细校正背景信号。

Fura-2 存在测量线粒体 Ca²⁺的加载问题。首先，将染料具体加载到线粒体中并不容易，而非特异性加载到另一个细胞器中可能是错误的。线粒体 Ca²⁺浓度通常高于细胞醇，使用具有高 K_d值的 fura-2-FF 可以避免细胞体 Ca²⁺变化的污染。另一个有问题的细胞器是肉质视网膜（SR）。然而，分布体积差异（SR 3.5% 与线粒体 34%-36% 大鼠心室肌细胞）^13，14和在实验中去除ATP可以补偿SR的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL eppendorf 管	Axygen	MCT-200-C	2 mL 管
AD/DA 转换器	Instrutech	ITC-18	设备
ADP;-二磷酸二钾盐二水合物	Sigma-aldrich	A5285	化学品
带通过滤器	Ealing Electro-Optics， Inc	35-3920	设备，640&以上;11nm
带通滤光片	Omega 光学	690-9823	设备，590±15nm
带通滤光片	Omega 光学	500DF20-9916	设备，500&以上;20nm
带通滤光片	Chroma Technology Corp.	60685	设备，450 岁以上;30nm
氯化钙溶液	Sigma-aldrich	21114	化学品
羧基SNARF-1（AM）	Invitrogen	C1272
电荷耦合器件（CCD）相机	Philips	FTM1800NH/HGI	设备
二向色镜	Chroma Technology Corp. （Chroma 科技股份有限公司）	86009	设备， 多波段二向色镜， 反射 ： <400nm，490&mN;10， 560&00;10、传动率：460±15， 510&mn;20、>580nm
二向色镜	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	设备，反射 ： <560nm， 透射率 ： > 580 nm
二向色镜	Chroma Technology Corp.	480dclp	设备，反射 ： <470nm， 透射率 ： > 490 nm
二向色镜	Chroma Technology Corp.	20728	设备， 多波段二向色镜， 反射 ： <405nm，470±30、透射率：430nm~520nm，> 640 nm
<强>二甲基亚砜（DMSO）	>Sigma-aldrich		154938 Chemicals
DMEM，Dulbecco's 改良鹰's 中等	>Sigma-aldrich	D5030	化学品
<强>EGTA、乙二氮、乙烯-双（氧乙烯腈）四乙酸、乙二醇醚二胺四乙酸	Sigma-aldrich	E4378	化学品
<强>FCCP、甲氧沙腈 4-三氟甲氧基苯腙	Sigma-aldrich	21857	化学品
<强>场隔膜	尼康	86506	设备
<强>Fura-2-FF（AM）	TEFLABS	137
<强>绿管	DWM		试管
<强>HEPES，  4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸））	Sigma-aldrich	H3375	Chemicals
高速计数器	National Instruments	NI-6022	设备
热镜	Chroma Technology Corp.	21002	设备， 50：50
倒置显微镜	Nikon	TE-300	设备
苹果酸	Sigma-aldrich	27606	化学品
近红外滤光片	Chroma Technology Corp.	D750/100X	设备，750&00100nm
油浸镜头	尼康	MRF01400	40 倍，NA 1.3;设备
光子计数器单元	Hamamatsu	C3866	设备
光子倍增管	Hamamatsu	R2949	设备
Polychrome II	Till Photonics	SA3/MG04	设备
氯化钾	Merck	1.04936	化学品
氢氧化钾溶液	Sigma-aldrich	P4494	化学品
丙酮酸	Sigma-aldrich	107360
鱼藤酮	Sigma-aldrich	R8875
皂苷	Sigma-aldrich	S4521	化学品
TMRE、四甲基罗丹明、乙酯	分子探针	T669	化学品