淀粉样蛋白纤维蛋白的相互作用和脑线粒体的膜渗透

Summary

这里提供了一个协议，用于研究从不同组织和大脑不同区域分离的来自不同组织和不同区域的线粒体的不同肽和蛋白质的原生形态、前纤维和成熟的淀粉样纤维之间的相互作用。

Abstract

越来越多的证据表明，膜渗透，包括线粒体等内膜，是神经退行性疾病淀粉样体性引起的毒性的常见特征和主要机制。然而，大多数描述膜中断机制的报告都基于磷脂模型系统，而直接针对生物膜水平发生的事件的研究很少见。本文介绍了一个模型，用于研究膜层淀粉样蛋白毒性机制。对于线粒体隔离，密度梯度培养基用于获得以最小的骨髓污染获得制剂。线粒体膜完整性确认后，研究β-核糖核酸、牛胰岛素和母鸡蛋白溶解酶（HEWL）与大鼠脑线粒体（作为体外生物模型）产生的淀粉样纤维蛋白的相互作用。结果表明，用纤维束体处理脑线粒体可引起不同程度的膜渗透和ROS含量增强。这表明淀粉样纤维蛋白和线粒体膜之间的结构相关相互作用。建议淀粉样纤维的生物物理特性及其与线粒体膜的具体结合，可以解释其中一些观测结果。

Introduction

淀粉样蛋白相关疾病，称为淀粉样蛋白，构成由不同组织和器官中不溶性蛋白质沉积的出现所定义的一大群^{疾病1，2。}其中，神经退行性疾病是蛋白质聚集出现在中枢或周围^{神经系统2中最常见的形式。}虽然已经提出一些机制参与淀粉样粒体的^毒性3，越来越多的证据表明细胞膜中断和渗透作为淀粉样蛋白病理学的主要^{机制4， 5}.除血浆膜外，内部细胞器（即线粒体）也可能受到影响。

有趣的是，新的证据表明线粒体功能障碍在神经退行性疾病的发病机制中起着关键作用，包括阿尔茨海默氏症和^{帕金森病6，7。}根据这个问题，许多报告表明淀粉样蛋白β-肽、β-核糖核酸、亨廷顿蛋白和ALS相关突变SOD1蛋白与线粒^{体8、9、10的结合和积累。 11.}淀粉样粒体渗透膜的机制被认为是通过离散通道（孔）的形成和/或通过非特异性洗涤剂状^{机制5、12、 13}.值得注意的是，这些结论大多基于涉及磷脂模型系统的报告，而直接针对生物膜中发生的事件的研究很少见。显然，这些人造脂质双层不一定反映生物膜的内在特性，包括线粒体，线粒体是异质结构，由各种各样的磷脂和蛋白质组成。

在本研究中，从大鼠大脑中分离的线粒体被用作体外生物模型，以检查β-核糖核酸（作为淀粉样蛋白）、牛胰岛素（作为模型肽显示的淀粉样纤维素）的破坏性影响。与注射局部淀粉样蛋白病有关的人类胰岛素的重要结构同源性，以及母鸡蛋白液化酶（HEWL;作为研究淀粉样蛋白聚集的常见模型蛋白）。然后通过观察线粒体麻化脱氢酶（MDH）（位于线粒体基质）和线粒体活性氧的释放，研究淀粉样纤维诱导的线粒体膜的相互作用和可能的损害物种（ROS）增强。

Protocol

所有动物实验均按照德黑兰大学医学研究所动物护理和使用委员会（IACUC）进行。通过锐化断头刀刃和采用果断和迅速的叶片运动，尽最大努力尽量减少对大鼠的痛苦和有害影响。

1. 大脑均质化和线粒体隔离

注:所有线粒体隔离试剂均根据西姆斯和^安德森14号制备。

1. 为线粒体隔离准备缓冲液
   1. 准备 100 mM Tris-HCl 溶液:重量为 0.605 g 的 Tris-HCl，并将其溶解在烧杯中约 40 mL 的去离子水 （DW） 中。将溶液转移到 50 mL 体积烧瓶，并通过添加 DW 将最终体积增加到 50 mL。
   2. 准备 10 mM EDTA 溶液:重量为 0.202 g EDTA，并将其溶解在烧杯中约 40 mL 的 DW 中。将溶液转移到 50 mL 体积烧瓶，并通过添加 DW 将最终体积增加到 50 mL。
      注:两种溶液可在4°C下储存至少4周。
   3. 准备 Tris-HCl/EDTA/蔗糖库存溶液:在烧杯中加入 30 mL 的 100 mM Tris-HCl 和 30 mL 的 10 mM EDTA。重量为 32.86 g 蔗糖，在用磁性搅拌器搅拌时将其添加到烧杯中。当蔗糖溶解时，将溶液转移到100 mL体积烧瓶，并通过添加DW将最终体积增加到100 mL。
      注:此解决方案可在 4°C 下存储长达 3 天。
   4. 准备隔离缓冲液 （IB）:将 100 mL 的 Tris-HCl/EDTA/蔗糖库存添加到大约 150 mL 的 DW 中。通过添加 0.1 M HCl 将 pHH 调整为 7.4，通过添加 DW 将最终体积增加到 300 mL。
   5. 通过添加 1.5 mL 的密度梯度介质到 8.5 mL 的冷 IB，使用 IB 制备 15% （v/v） 密度梯度介质。
   6. 制备10mg/mL牛血清白蛋白（BSA）溶液:称量20毫克不含脂肪酸的BSA，并将其溶解在2mL小瓶中约1.5 mL DW中。通过添加 DW 并将其存储在冰上直到使用，将最终音量增加到 2 mL。
      注:在线粒体隔离当天，从步骤 1.1.4_1.1.6 中新鲜准备解决方案，并将其储存在冰上直到使用。
2. 大鼠大脑的隔离
   注:根据西姆斯和^{安德森14，}对雄性大鼠进行斩首和脑切除（150-200克）。
   1. 在冰桶中放入 30 mL 烧杯，并在烧杯中加入 10 mL 的冷 IB。
   2. 用小动物断头台将大鼠斩首，并在斩首后1分钟内从头骨中取出大脑，以限制线粒体特性的恶化。
   3. 迅速将大脑转移到含有冷IB的烧杯。
3. 线粒体的脑均质化和制备
   注:线粒体分数根据西姆斯和^安德森14所述的协议被隔离，并作了一些修改，如^前15所述。重要的是快速工作，并在整个过程中保持所有工作。
   1. 用30 mL的IB清洗组织2x，转移到装有冷IB的烧杯，用剪刀细切大脑。
   2. 加入10卷预冷却IB（每个大鼠大脑约10mLIB）。
   3. 将组织悬浮液转移到20 mL冷点质器。
   4. 使用九个向上和向下的笔触与电动刺一致组织片。
      注:每组三次均质冲程后，将混合物留在冰上约 30 s，以确保均质保持低温。
   5. 将均质转移到预冷却的10 mL离心管中，并在1，300x g和4°C下离心3分钟。
   6. 小心地将上清液分明，并将其转移到预冷却的10 mL离心管中，并在4°C下以21，000g离心10分钟。
   7. 用移液器轻轻搅拌混合物，丢弃上清液，在冷15%密度梯度培养溶液中重新悬浮颗粒（每个大脑5 mL）。
   8. 使用慢速加速（45 s 从 0 rpm 到 500 rpm，然后是正常的加速）和减速（无制动器），在 4°C 下以 30，700x g的固定角度转子离心 5 分钟。这将产生两个不同的材料带（图1A，左图）。
   9. 使用巴斯德移液器，去除在梯度顶部积累的尖锐材料带，其中大多含有骨髓。然后，尽可能去除覆盖材料（在波段 2）的密度梯度介质溶液，而不会损失波段 2 中的任何富集线粒体分数。
      注: 波段 2 包含突触和非突触线粒体。
   10. 将 8 mL 的 IB 添加到线粒体部分中，同时用移液器轻轻搅拌混合物。
   11. 在 4°C 下在 16，700x g下离心 10 分钟，并小心地去除上清液，使底部松动的颗粒不受干扰。
   12. 在离心管中加入1mL的10mg/mL无脂肪酸BSA，同时用移液器的尖端轻轻搅拌混合物。通过添加IB，将最终体积增加到每脑5 mL。
   13. 在4°C下在6，900x g下离心10分钟，产生坚紧的颗粒（图1A，右图）。
   14. 将上清液分明，轻轻重新悬浮IB中的线粒颗粒，将其与0.5 mL管中等分，并储存在液氮中，直到使用。

2. 蛋白质浓度测定

注:蛋白质浓度使用Lowry^等人16的方法测量。

1. 为劳里测定准备解决方案
   1. 制备溶液A:重量为0.4g的NaOH和2克的Na₂CO_3，溶解在80 mL的DW中，然后将溶液转移到100 mL体积烧瓶中，并通过添加DW将体积增加到100 mL。
   2. 制备溶液B:称量0.1克酸钾和0.05克CuSO_4，溶解在8 mL DW中，然后将溶液转移到10 mL体积烧瓶中，通过添加DW将体积增加到10 mL。
      注:两种溶液A和B可在4°C下保持稳定长达6个月。
   3. 制备溶液C:将0.5 mL的叶林溶液加入7.5 mL的DW。
      注:准备溶液C新鲜，并保持远离光，直到使用。
   4. 通过组合 0、20、40、60、100 和 120 μg/mL，分别结合 0、20、40、60、80、100 和 120 μL 1mg/mL BSA，制备最终浓度为 0、20、40、100 和 120 μL 的 BSA 标准，并结合足够的 DW，使溶液达到 1000 μl。
2. 蛋白质浓度测量
   注: 为了获得更高的精度，在三元中运行此步骤。
   1. 在 96 孔板的每个孔中加入 50 μL 的标准溶液和线粒体均质，然后添加 45 μL 溶液 A。然后，在50°C的温水浴中孵育10分钟。
   2. 加入5μL溶液B，在室温（RT）下在黑暗中孵育10分钟。
   3. 加入150 μL溶液C，在50°C的温水浴中孵育10分钟。
   4. 将板加载到板读取器中，并在 650 nm 处记录标准和线粒体悬浮液的吸光值。然后，使用校准曲线计算线粒体的蛋白质含量。

3. 线粒体膜完整性测定

注:通过测量Triton X-100在膜中断前后的孤立线粒体中的马精酸脱氢酶（MDH）活性，可以确认线粒体膜的完整性。

1. 用冷IB稀释线粒体均质至1mg/mL，并放入两个1.5 mL管中（通常每管线粒体195 μL）。
2. 将 5 μL 20% （v/v） Triton X-100 （与 DW 一起稀释） 添加到一个管中（作为最大酶活性的正控制），将 5 μL 的 DW 添加到另一个管（用于控制），然后与搅拌器混合。
3. 在30°C的温水浴中孵育管子10分钟。
4. 在16，000 x g和4°C的固定角度转子中，管离心，15分钟。
5. 使用下一节中描述的标准分光光度测定法，仔细收集生成的上生物，以测定线粒体 MDH 的活性。
6. 计算线粒体膜的完整性如下:
   

4. MDH活动确定

注:MDH活性是按索托卡萨^等人17所述的分光光度测量的。

1. 为MDH活性测定准备解决方案
   1. 准备50 mM Tris-HCl溶液（pH = 7.5）:使用Tris-HCl在DW中制备7.9mg/mL溶液，并在25°C时将pH值调整为7.5，使用1.0 M NaOH。
   2. 制备50 mM牛沙酸酯溶液:在Tris-HCl中使用奥洛醋酸盐制备6.6mg/mL溶液。
      注意:此解决方案在解决方案中一次不稳定，应在使用前立即准备好。
   3. 准备10 mM β-NADH溶液:在Tris-HCl中使用β-NADH制备7.81mg/mL溶液。
2. MDH 活动确定
   注:1.0 mL反应混合物中的最终测定浓度为50 mM Tris-HCl、5 mM牛酸酯和0.1 mM β-NADH。
   1. 将分光光度计设置为 25°C 和 340 nm。移液器 890 μL Tris-HCl 缓冲液、100 μL 牛油酸盐溶液和 10 μL NADH 溶液，用于空白比色剂和 880 μL Tris-HCl 缓冲液、100 μL 的牛油酸溶液和 10 μL 的 NADH 溶液。
   2. 在分光光度计中孵育3⁄4分钟，参考空白。
   3. 然后向样品比色皿中加入10μL线粒体均质（1mg/mL），立即通过反转混合，并记录在340nm下NADH氧化导致的吸收率降低1分钟。

5. 体外β-核糖核酸、牛胰岛素和HEWL纤维蛋白形成

1. 蛋白质制备
   1. β-核糖核酸:
      注:重组β-核糖核酸的表达和纯化由Hoyer^等人18号进行，并进行了一些修改，SDS-PAGE确认了β-核糖核酸的纯度。
      1. 对磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行透析纯化+-核素过夜。
      2. 在275nm19时，使用5600^{M-1 cm-1}的消光系数确定蛋白质浓度。
      3. 在1.5 mL管中分量蛋白质，储存在-80°C，直到使用。
   2. 牛胰岛素和HEWL:
      1. 同时提供牛胰岛素和HEWL。
      2. 将每种蛋白质溶解在50 mM甘氨酸缓冲液中（pH值 = 1.6;用HCl调节pH值）。
      3. 在276纳米和280纳米的1.0mg/mL中，使用1.0和2.63的灭绝系数确定牛胰岛素和HEWL浓度，^{分别为20、21。}
2. 淀粉样颤动诱导
   1. 淀粉样颤动解决方案的准备:
      1. 制备皮洛文T（ThT）缓冲液:重量为0.3克NaH₂PO_4，将其溶解在80 mL的DW中，将pH调整为6.5，并通过添加DW将体积增加到100 mL。
      2. 制备ThT库存溶液（5 mM）:重1.6毫克ThT，将其溶解在1mL的ThT缓冲液中，通过0.22 μm滤纸，在4°C时远离光线，直到使用。
         注:此溶液可在4°C下储存长达4周。
      3. 制备 ThT 溶液 （1 mM）:将 200 μL 的 ThT 库存溶液 （5 mM） 添加到 800 μL 的 ThT 缓冲液中。
         注:此溶液可在4°C下储存长达1周。
   2. 体外β-核糖核酸淀粉样纤维蛋白形成:
      1. 将蛋白质溶液（200 μM）和6μL的ThT溶液（1 mM）添加到1.5 mL管中，然后搅拌。
      2. 在37°C的温混剂中孵育管子，在800rpm的恒定搅拌下孵育4天。
      3. 在固定时间间隔后，将孵育样品的等分（10 μL）进行，加入490μL的ThT缓冲液，彻底混合，在RT孵育5分钟。
      4. 将激发和发射狭缝宽度分别设置为 5 nm 和 10 nm，并使用荧光分光光度计在 440 nm 处通过激发测量 ThT 荧光，在 485 nm 处发射 ThT 荧光。
   3. 体外牛胰岛素淀粉样纤维蛋白形成:
      1. 将637μL的蛋白质溶液（250μM）加入1.5 mL管。然后，加入13 μL的ThT溶液（1 mM），然后搅拌。
      2. 在清底96孔板的每个孔中加入含有20μM ThT的蛋白溶液（200μM）等分（200μL），用水晶般清晰的密封胶带密封板。
      3. 将板加载到荧光板读取器中，并在 57°C 下孵育，无搅拌。
      4. 以 30 分钟间隔测量 ThT 荧光，在 440 nm 处进行激发，在 485 nm 处发射，为 12 小时。
         注:每次测量前，将板摇动 5 s。
   4. 体外HEWL淀粉样纤维蛋白形成:
      1. 在清底96孔板的每口孔中加入含有20μM ThT的含20μM ThT的等分（200μL）蛋白溶液，用水晶般清晰的密封胶带密封板。
      2. 将板加载到荧光板读取器中，并在 57°C 下孵育，无搅拌。
      3. 以 2 小时间隔测量 ThT 荧光，440 nm 的激发和 485 nm 的排放，4 天。
         注:对于所有三种蛋白质，淀粉样纤维蛋白的形成由原子力显微镜确认（图2B）。

6. 用淀粉样纤维、MDH释放测定和ROS测量治疗线粒体

1. 用淀粉样纤维的孤立线粒体的孵育
   1. 打开离心机和温水浴，分别设置为 4°C 和 30°C。
   2. 使用IF，将线粒体均匀化至1mg/mL的最终浓度。
   3. 准备两个系列1.5 mL管，含有线粒体均质（一个系列用于MDH释放测定，另一个系列用于线粒体ROS测量）。
   4. 向线粒体均质（最终体积 = 200 μL）中加入新鲜或淀粉样蛋白纤维蛋白（最终浓度为5μM、10μM、20μM和25μM;使用PBS或甘氨酸缓冲液作为对照）的二恶客（最终体积=200μL）（见表1，表2），和表3）然后用移液器轻轻搅拌溶液。
      注:对于MDH释放测定，使用Triton X-100（最终浓度为0.5%[v/v]）作为最大酶释放的正控制。
   5. 在设置为 30°C 的温水浴中，孵育含有线粒体悬浮液 30 分钟的孵育管。
   6. 测量线粒体 MDH 版本和 ROS 内容，如第 6.2 和 6.3 节所述。
2. 线粒体 MDH 释放测定
   1. 将孵育的线粒体在16，000 x g下分离15分钟，然后仔细收集产生的上生子，以根据第4节所述对线粒体MDH的活性进行清点。
   2. 计算 MDH 释放作为最大效果 （Triton X-100） 的一小部分，如下所示:

3. 线粒体 ROS 测量
   注:线粒体ROS含量测定与氧化敏感氟原体二氢氯甲酸二乙酸二乙酸^{酯（DCFDA）22。}
   1. 为线粒体 ROS 测量准备解决方案。通过在甲醇中溶解（新鲜制备）和200 mM琥珀酸酯溶液，通过在DW中溶解制备50μMDCFDA溶液。
   2. 移液器 191 μL 孵育线粒体均质到 96 孔板的每个孔中，并加入 4 μL 的 50 μM DCFDA（1 μM 最终浓度）和 5 μL 200 mM 琥珀酸酯（5 mM 最终浓度）。
   3. 在30°C的温水浴中孵育板30分钟，同时轻轻搅拌。
   4. 将板加载到荧光板读取器中并测量荧光强度，激发速度为 485 nm，发射速度为 530 nm。

7. 统计分析

1. 使用三联测定至少执行 2 倍或 3 倍的所有实验，并进行适当的统计测试。在这里，结果以均值 = SD 的形式呈现，并利用学生的配对t检验来计算统计显著性。小于 0.01 和 0.05 的 P 值被视为具有统计显著性（\p < 0.05;#p < 0.01）。

Results

该协议描述了一个模型，用于研究淀粉样纤维蛋白与大鼠脑线粒体作为体外生物模型的相互作用。对于线粒体制剂，15%（v/v）密度梯度培养基用于去除骨髓，作为脑组织的主要^污染14。如图1A所示，在30，700 x g处离心产生了两个不同的物质带，即骨髓（作为波段1的主要成分）和带2，它们含有丰富的线粒体分数。

通过修改Sims^{和Anderson14}描述的协议，制备了含有突触和非突触线粒体的线粒体悬浮液。为了制备纯非突触线粒体，西姆斯和安德森之前详细叙述了^协议14。在离心的最后一步，添加了10mg/mL无脂肪酸BSA，以获得牢固的线粒颗粒（图1A）。通过测量Triton X-100在膜中断和酶释放之前和之后的分离线粒体中的MDH活性，通过测...

Discussion

大量的实验结果支持了纤维细胞聚集体细胞毒性与其与生物^膜4、5相互作用和渗透的能力显著相关的假设。然而，大多数数据都基于人工脂质双层，不一定反映生物膜的内在特性，生物膜是具有多种磷脂和蛋白质的异构结构。本文以脑线粒体作为体外生物膜，介绍了一个在膜水平上研究纤维集体细胞毒性的模型。

在实验中，重要的是快速工作，并保持所有在冰上准备功能活跃的线粒体与完整的膜。此外，线粒体浓度（基于总蛋白质测量）是影响膜-淀粉样纤维蛋白相互作用的重要因素;因此，它必须在整个协议中保持不变。在本研究中，线粒体制剂含有突触和非突触线粒体。对于纯非突触线粒体制剂，应使用40%、23%和15%（v/v）密度梯度介质，如Sims^{和Anderson14}所述。由于线粒体是具有良好特征膜的细胞器，它可以作为一个非常有用的生物模型系统，在分子研究中与膜层淀粉样细胞毒性机制有关（特别是与膜层淀粉样细胞毒性机制有关）的神经退行性疾病）。该协议允许通过观察位于不同隔...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸	Sigma	35845
硫酸铵	Merck	1012171000
Black 96 孔板	康宁
黑色 透明底 96 孔板	康宁
牛胰岛素	Sigma	I6634
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma	A2153
BSA 基本不含脂肪酸	Sigma	A6003
离心机	Sigma
晶莹剔透的密封胶带	康宁
CuSO4	Sigma	451657
透析袋（切掉 2 KDa）	Sigma	D2272
Dounce 均质器	Potter Elvehjem
EDTA	Sigma	E9884
荧光读板器	BioTek
荧光分光光度计	Cary Eclipse VARIAN
Folin	Merck	F9252
甘氨酸	Sigma	G7126
断头台	伊朗制造
盐酸	默克 默克	H1758
鸡蛋清溶菌酶 （HEWL）	Sigma	L6876
Na2CO3	西格玛	S7795
NaH2PO4	西格玛	S7907
NaOH	默克	S8045
草酰乙酸	Sigma	O4126
Percoll	GE Healthcare
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma	CS0030
PMSF	Sigma	P7626
酒石酸钾钠	Sigma	217255
石英比色	Sigma
分光光度计	分析仪	jena SPEKOL 2000 型号
珀酸盐	Sigma	S2378
蔗糖	Merck	1076871000
Thermomixer	依潘多夫
硫黄素 T	Sigma	T3516
Tris-HCl	默克	1082191000
Triton X-100	Sigma	T9284
胰蛋白胨	QUELAB
水浴	膜
酵母提取物	QUELAB
β-NADH	Sigma	N8129