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利用自动化图像处理分析裂殖酵母和芽殖酵母中的脂滴含量

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DOI：

10.3791/59889

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2019年7月17日

 ,  ,  , 
1Faculty of Science, Charles University

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于 MATLAB 的自动化检测方法，用于对裂殖酵母和芽殖酵母细胞荧光显微镜图像中的脂滴进行定量描述。

摘要

脂质代谢及其调控是基础生命科学、应用生命科学和生物技术领域共同关注的重要课题。在这一领域中，多种酵母物种被用作脂质代谢研究的模型或用于工业级脂质生产。脂滴是高度动态的储存结构，其细胞内含量可作为反映脂质代谢状态的便捷指标。荧光显微镜技术是定量分析细胞内脂滴的首选方法，因其依赖于广泛可用的设备，并能够对单个脂滴进行分析。此外，显微图像分析可实现自动化，从而显著提高整体分析通量。本文介绍了一种针对三种模式酵母物种中单个脂滴进行自动检测与定量描述的实验与分析工作流程，这三种酵母分别为裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe和Schizosaccharomyces japonicus，以及芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae。使用BODIPY 493/503对脂滴进行荧光标记，同时在培养基中添加细胞不可渗透的荧光葡聚糖，以帮助识别细胞边界。细胞在绿色和蓝色通道中接受三维落射荧光显微成像，所得的z轴层扫图像由MATLAB分析流程自动处理。该流程输出以表格形式呈现的丰富定量数据，包括细胞内脂滴含量及单个脂滴的特征参数，适用于主流电子表格软件或统计分析软件的后续分析。我们还提供了在不同影响细胞脂质代谢条件下脂滴含量的示例分析。

引言

脂质在细胞能量代谢和碳代谢、膜组分的合成以及生物活性物质的生成中发挥着关键作用。脂质代谢会根据环境条件、营养物质的可利用性以及细胞周期阶段进行精细调控1。在人类中，脂质代谢与肥胖、2型糖尿病和癌症等疾病密切相关2。在工业领域，由酵母等微生物产生的脂质被视为一种有前景的可再生柴油燃料来源3。细胞将中性脂质储存在所谓的脂滴（LDs）中。这些在进化上保守的结构由三酰甘油、甾醇酯、外层的磷脂单层以及相关蛋白组成1。脂滴起源于内质网，表现出随细胞周期或生长阶段变化的动态特征，并在细胞脂质稳态中发挥重要作用1。在不同生长条件下检测脂质代谢或筛选突变体时，脂滴的数量和形态可作为便捷的替代指标。鉴于脂滴具有高度动态的特性，能够分析单个脂滴特性的技术在脂质代谢研究中尤其受到关注。

多种酵母物种已被用于描述脂质相关代谢途径及其调控机制，或在生物技术中用于生产有价值的化合物或燃料1。此外，对于模式酵母，如芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae 或进化关系较远的裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe，已有全基因组敲除菌株文库可供用于高通量筛选4,5。最近，已在 S. pombe 中描述了脂滴的组成与动态变化6,7,8,9，并在新兴的模式酵母 Schizosaccharomyces japonicus 中分离出与脂质代谢相关的突变体10。

目前有多种技术可用于研究脂滴（LD）的含量与动态变化。大多数方法采用亲脂性染料对脂滴进行染色，例如尼罗红（Nile Red）或BODIPY 493/503。其中后者具有更窄的激发和发射光谱，并对中性脂质（即脂滴）相较于磷脂（细胞膜）具有更高的特异性11。荧光光度法和流式细胞术已成功应用于多种真菌物种，用于揭示影响储存脂质含量的基因和生长条件12,13,14,15。尽管这些方法适用于高通量应用，但无法测量单个细胞内脂滴的数量和形态，而这些参数在不同生长条件和基因型之间可能存在显著差异。相干拉曼散射或数字全息显微术是无需标记的检测方法，可提供脂滴水平的数据，但需要专用且昂贵的设备16,17,18。相比之下，荧光显微镜可在利用常规仪器和图像分析软件的基础上，提供有关脂滴含量的详细信息。目前已存在多种分析流程，其在从图像数据中识别细胞/脂滴方面的复杂程度和自动化水平各不相同，并针对不同细胞类型进行了优化，例如含有较大脂滴的后生动物细胞19,20,21，或出芽酵母17,22,23。其中一些方法仅适用于二维图像（例如最大投影图像），可能无法可靠地描述细胞内的脂滴含量。据我们所知，目前尚无针对裂殖酵母显微图像数据进行脂滴含量和形态分析的工具。开发自动化且稳健的脂滴水平分析方法将提高检测灵敏度和统计功效，并为多种酵母物种中的中性脂质含量提供丰富的信息。

我们开发了一种用于分析酵母细胞三维荧光显微图像中脂滴（LD）含量的工作流程。活细胞分别用BODIPY 493/503和Cascade Blue葡聚糖染色，以可视化脂滴并确定细胞边界。细胞被固定在玻璃载玻片上，并使用标准的落射荧光显微镜进行z轴层扫成像。随后，图像由基于MATLAB（一种广泛使用的商业统计分析软件包）开发的自动化流程进行处理。该流程包括图像预处理、分割（区分细胞与背景，去除死细胞）以及脂滴识别。最终以表格形式提供丰富的脂滴水平数据，例如脂滴大小和荧光强度，这些数据可兼容主流电子表格软件工具。该工作流程已成功用于确定氮源可利用性对S. pombe24脂质代谢的影响。本文进一步在S. pombe、S. japonicus和S. cerevisiae中验证该工作流程的功能，采用影响细胞脂滴含量的培养条件或突变体进行演示。

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方案

1. 溶液与培养基的制备

  1. 配制脂质染色液。
    1. 配制脂质染色储备液：将10 mg BODIPY 493/503溶解于10 mL无水DMSO中（终浓度为1 mg/mL）。建议将一整瓶10 mg的BODIPY 493/503全部溶解，以避免称量过程中样品损失。
      注意：DMSO可穿透皮肤，操作时请佩戴适当的个人防护装备。
    2. 通过将100 µL的1 mg/mL BODIPY 493/503储备液与900 µL无水DMSO混合，配制工作用脂质染色液（终浓度为0.1 mg/mL）。
    3. 将储备液和工作液分装后，于-20 °C保存。
      注意：溶解后的BODIPY 493/503在-20 °C下可稳定保存数年，但需避光并防止受潮。
  2. 为细胞边界可视化配制储备液：将一整瓶25 mg级联蓝葡聚糖（Cascade Blue dextran）溶解于2.5 mL去离子水中（终浓度为10 mg/mL）。将储备液分装后，避光保存于-20 °C。
  3. 为显微镜载玻片包被液配制溶液：将5 mg大豆凝集素溶解于5 mL去离子水中（终浓度为1 mg/mL）。将凝集素溶液分装后，保存于-80 °C。
    注意：凝集素溶液在-80 °C下可稳定保存数年；正在使用的分装样品可短期存放于-20 °C。
  4. 配制培养基。
    1. 配制400 mL用于S. pombe和S. japonicus的复杂型YES培养基：在500 mL瓶中，将2 g酵母提取物和0.1 g SP补充剂（如营养缺陷型突变株需要）溶解于340 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入60 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20% (w/v)葡萄糖溶液。
    2. 配制400 mL用于S. pombe和S. japonicus的化学限定EMM培养基：在500 mL瓶中，将4.9 g不含葡萄糖的EMM肉汤溶解于360 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入40 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20% (w/v)葡萄糖溶液。
      注意：有关S. pombe和S. japonicus培养的一般指南，请分别参见文献25和26。
    3. 配制300 mL用于Saccharomyces cerevisiae的复杂型YPAD培养基：在500 mL瓶中，将3 g酵母提取物、6 g蛋白胨和30 mg硫酸腺嘌呤溶解于270 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入30 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20% (w/v)葡萄糖溶液。
    4. 配制300 mL用于S. cerevisiae的化学限定基本培养基：在500 mL瓶中，将2 g酵母氮源基础培养基（不含氨基酸）溶解于270 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入30 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20% (w/v)葡萄糖溶液。
      注意：有关S. cerevisiae培养的一般指南，请参见文献27。

2. 细胞培养

  1. 将 S. pombe 或 S. japonicus 培养至对数生长期或早期静止期。
    1. 早晨，用新鲜的裂殖酵母生物量接种5 mL YES培养基，在32 °C下振荡培养（180 rpm）数小时。
      注意：所有培养均应使用体积为培养液体积10倍的锥形瓶，以确保充分通气。一些实验室倾向于在30 °C下培养裂殖酵母，但32 °C的培养温度可缩短倍增时间，且对细胞无不利影响，从而减少实验所需的总时间25,28。
    2. 同一天的晚些时候（培养至少6小时后），用新鲜YES培养基将培养物稀释至最终培养体积为10 mL，使其在次日早晨达到所需的光密度（OD）（或细胞数/mL），并在32 °C下振荡培养（180 rpm）。了解所用每种菌株的倍增时间有助于准确确定稀释倍数（使用公式1）。
      figure-protocol-1
      其中 Vculture 为稀释所需的前培养体积，Vfinal 为新培养物的总体积（标准培养为10 mL），ODfinal 为次日早晨需达到的目标OD值，ODcurrent 为当前测得的前培养OD值，t 为细胞生长至收获时的时间，tlag 为延滞期持续时间（取决于实验室条件，需通过实验确定），tDT 为菌株的倍增时间。
      注意：若需分析对数生长期细胞，应避免前培养物进入静止期，因为这会显著改变细胞生理状态（包括脂滴含量），并持续影响后续数代细胞。
    3. 成像当天早晨，若培养物的OD略高于所需值（针对对数生长期细胞），则用新鲜YES培养基稀释，并继续培养至少两个以上的倍增时间，然后再进行脂滴染色。否则直接进入染色步骤（第3节）。
  2. 将 S. cerevisiae 培养至对数期和静止期。
    1. 下午，用少量新鲜的芽殖酵母生物量接种10 mL YPAD培养基，于30 °C振荡（180 rpm）过夜培养。
    2. 成像当天早晨，将培养物用YPD培养基稀释至OD 0.1，总体积为10 mL，并继续培养至所需OD值（例如，对数期为OD 1）。任何培养稀释操作均按步骤2.1.2所述进行。随后进行染色（第3节）。

3. 脂滴染色

  1. 为每个待成像的样品准备一个显微镜盖玻片。使用水平放置的移液器吸头长边将1 µL的载玻片包被溶液均匀涂布于洁净的盖玻片上。待包被溶液完全干燥后，将盖玻片存放于无尘环境中。
    注意：如有需要，可在使用前对载玻片和盖玻片进行清洗。清洗步骤包括：用洗洁精洗涤，用水冲洗，3%盐酸中浸泡过夜，再用蒸馏水洗涤。清洗后的载玻片和盖玻片应保存在纯乙醇中直至使用。
  2. 根据需要测定细胞培养物的OD值或细胞浓度（细胞数/mL），尽量使所有测试菌株达到相近数值，以确保实验条件具有可比性。
  3. 将每种细胞培养物各取1 mL加入1.5 mL微量离心管中。仅针对S. cerevisiae，加入5 µL载玻片包被溶液，短暂涡旋混匀，并在30 °C下振荡孵育5分钟。
  4. 向每份细胞培养物分装液中加入1 µL脂质染色液，短暂涡旋混匀；随后加入10 µL细胞边界可视化溶液，再次短暂涡旋混匀。
    注意：请勿预先配制两种染料的混合溶液，否则会导致BODIPY 493/503的荧光淬灭。
  5. 通过离心（1,000 × g，3分钟，室温）收集细胞，并移除大部分上清液（约950 µL）。用残留的上清液重悬细胞沉淀。
  6. 取2 µL浓缩的细胞悬液滴加至凝集素包被的盖玻片上，然后将其置于洁净的显微镜载玻片上。细胞应形成单层分布。尽快进行显微镜观察（第4节），以尽量减少成像过程中的人工假象；每次处理的样品最多不超过两个。

4. 显微镜设置与成像

  1. 优化成像条件。
    注意：    显微镜的设置需要长时间暴露于强光源下，这可能会对样品造成损伤并导致结果偏差。因此，应使用专用的样品载玻片来设置成像条件，该载玻片将不再用于后续的脂滴（LD）定量分析。
    1. 使用相差或微分干涉对比（DIC）模式对细胞进行聚焦。
      注意：可采集相差或DIC图像作为参考，但在自动图像分析步骤中不会使用这些图像。
    2. 设置z轴层叠（z-stack）参数以覆盖整个细胞体积。总垂直距离取决于细胞大小；光学切片层数取决于物镜的数值孔径（z轴方向上的点扩散函数）。设置焦点相对于中心焦平面进行移动。
      注意：最佳切片层数通常由显微镜控制软件自动确定，无需手动计算。S. pombe的典型细胞宽度为3–5 µm，S. japonicus为4–7 µm，S. cerevisiae为3–7 µm。
    3. 为成像脂滴（LDs），在绿色荧光通道中设置光照强度和曝光时间（BODIPY的激发和发射最大值分别为493 nm和503 nm）。
      注意：BODIPY 493/503是一种非常明亮的荧光染料；然而，在过强光照下可能迅速发生光漂白。此外，活细胞中的脂滴具有移动性，因此应尽量缩短曝光时间，并首先完整采集绿色荧光通道的z轴层叠图像（在切换至蓝色通道之前），以避免运动模糊伪影。同时，需考虑相机信号强度的线性范围，避免出现饱和像素。
    4. 为成像细胞边界，在蓝色荧光通道中设置光照强度和曝光时间（Cascade Blue葡聚糖的激发和发射最大值分别为400 nm和420 nm）。
      注意：蓝色通道的信号强度用于图像分割，但不直接用于脂滴定量分析。因此，该通道的最佳设置对整体分析并非至关重要。
    5. 如有可能，在显微镜控制软件中建立自动化的实验工作流程，以便在标准化条件下高效地对多个样品进行成像。
  2. 成像条件优化完成后，对用于定量分析的样品进行成像。按照步骤4.1所述，对细胞进行聚焦，并在绿色和蓝色荧光通道中成像。
    注意：所有图像必须使用完全相同的设置采集，以确保样品间的可比性。每个样品应采集多个视野图像，以获得可靠且具代表性的数据。
  3. 将蓝色和绿色荧光通道的z轴层叠图像保存为16位多层TIFF文件（即每个视野生成两个文件）。在相应文件名中包含“green”或“blue”字样。随后进行图像分析（第5节）。

5. 图像分析

  1. 目视检查所获取图像的质量。
    1. 在 ImageJ29,30 或其他合适的图像分析软件中打开显微图像。
    2. 剔除在采集过程中有大量细胞发生移动（从而产生模糊伪影）的图像序列。
    3. 剔除蓝色通道中包含强荧光非细胞颗粒的图像序列（例如载玻片或盖玻片上的污物、培养基中的杂质）。
      注意：蓝色通道中非常明亮的非细胞物体可能会导致细胞检测伪影，或干扰其邻近区域细胞的检测。
    4. 剔除含有大量死细胞的图像序列（即与活细胞相比蓝色荧光增强的细胞）。
      注意：样品中存在少量死细胞通常不会造成问题，这些细胞会在分析过程中被自动排除；但偶尔一些死亡或濒死细胞可能被分割算法误识别为活细胞，从而影响最终结果的准确性。
  2. 在 MATLAB 软件中分析图像。
    1. 创建一个主文件夹，并将所有 MATLAB 脚本复制到该目录。
    2. 创建一个子文件夹（“pombe”、“cerevisiae”或“japonicus”），并将输入的 TIFF 图像文件复制到该目录。
    3. 启动 MATLAB，打开脚本 MAIN.m 并运行。在菜单中选择待分析的酵母物种，开始图像处理。
      注意：细胞和脂滴（LD）检测所需的某些参数已针对特定物种预设，其余参数则在图像处理过程中自动确定。预设值是通过实验经验确定的，取决于多个因素，例如物镜放大倍数、相机类型与灵敏度以及成像设置。如有需要，用户可编辑脚本文件以修改特定于生物体的预设参数，使其更符合实验条件。具体而言，在细胞识别过程中，可接受的对象大小由“minArea”和“maxArea”参数定义，对象边界内填充体积的最小比例由“Solidity”参数定义。在脂滴识别中，亮度阈值由“th”参数设定（其值主要受图像位深度和荧光信号强度影响），最大可接受脂滴大小由“MaxArea”参数设定。
    4. 使用电子表格编辑器或统计软件按需检查和处理输出文件；该工作流程生成以分号分隔的 CSV 文件，以及包含已识别细胞对象和脂滴的分割 TIFF 文件。
      注意：该工作流程将图像分割为背景和细胞对象，其中每个细胞对象可能由多个相邻细胞组成。因此，“xxxx_cells.csv”文件中的输出并不代表单细胞数据，仅可用于计算单位细胞体积的指标。

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结果

整个流程在图1中以裂殖酵母为例进行了总结（芽殖酵母的实验流程类似），下文我们提供了如何利用该流程在不同条件下研究三种不同酵母物种中脂滴（LD）含量的示例，这些条件已知会影响细胞内的脂滴含量。每个示例代表一次独立的生物学实验。

figure-results-1
图1：实验与分析工作流程示意图。 以裂殖酵母的工作流程为例展示。 请点击此处查看该图的放大版本。

首先，我们分析了 S. pombe 细胞（

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讨论

了解脂质代谢及其调控机制对于基础生物学以及临床和生物技术应用都具有重要意义。脂滴（LD）含量是反映细胞脂质代谢状态的一个便捷指标，其中荧光显微镜是测定脂滴含量的主要方法之一。本方案可实现对三种不同且形态各异的酵母物种中单个脂滴的自动检测与定量描述。据我们所知，目前尚无针对裂殖酵母的类似工具。用于图像处理的 MATLAB 脚本作为补充文件提供，同时也可通过 Figshare 数据库获取（DOI 10.6084/m9.figshare.7745738），其中包括本文所有的原始和处理后的图像数据及表格数据、CSV 输出文件的详细说明，以及用于下游数据分析和可视化的 R 脚本。此外，最新版本的 MATLAB 脚本也可从 GitHub 获取（https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis）。

成功的脂滴（LD）分析在很大程度上依赖于所获得的原始荧光图像的质量。为了使分割算法达到最佳性能，显微镜观察应使用无尘的洁净玻璃载片，细胞应形成单层（每个视野中的实际细胞数量并非关键参数），且不应含有大量死细胞。此外，z轴层析成像应从细胞焦平面略下...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了查理大学基金 PRIMUS/MED/26、GAUK 1308217 和 SVV 260310 的资助。我们感谢 Ondřej Šebesta 在显微成像及图像分析流程开发方面的帮助。我们感谢 ReGenEx 实验室提供的 S. cerevisiae 菌株，以及 JapoNet 和 Hironori Niki 实验室提供的 S. japonicus 菌株。ppc1-88 菌株由日本酵母遗传资源中心提供。共聚焦与荧光显微镜实验在共聚焦与荧光显微镜实验室完成，该实验室由欧洲区域发展基金和捷克共和国国家预算共同资助（项目编号：CZ.1.05/4.1.00/16.0347 和 CZ.2.16/3.1.00/21515）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 位单色 CCD 相机 Hamamatsu ORCA C4742-80-12AGHamamatsu 或同等产品
腺嘌呤半硫酸盐，≥99%MerckA9126-25G 
BODIPY 493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并）Thermo Fisher ScientificD3922用于中性脂质染色
D-(+)-葡萄糖，≥99.5%MerckG7021 
葡聚糖，级联蓝，分子量 10,000，阴离子型，可与赖氨酸交联固定Thermo Fisher ScientificD1976用于细胞负染色
二甲基亚砜，≥99.5%MerckD4540或更高纯度，保存于分子筛中以保持无水状态
不含葡萄糖的 EMM 培养基FormediumPMD0405也可由单一组分自行配制培养基
Fiji/ImageJ 软件NIH 或同等软件；用于显微图像数据的目视检查
高精度盖玻片，22 mm × 22 mm，1.5 号VWR630-2186可使用任何 1.5 号盖玻片
MATLAB 图像处理工具箱，版本 10.0Mathworks  
大豆凝集素（Glycine max 来源）MerckL1395用于细胞在载玻片上的固定
MATLAB 软件，版本 9.2Mathworks  
显微镜载玻片，26 mm × 76 mm，厚度 1 mmKnittel GlassL762601.2使用适配显微镜载物台的任意载玻片，接种细胞前需彻底清洗
配备自动 Z 轴物镜移动功能的 Olympus CellR 显微镜Olympus 或同等设备
五通道滤光片组SemrockF66-985明场、绿色和蓝色通道已足够
MATLAB 信号处理工具箱，版本 7.4Mathworks  
SP 补充剂FormediumPSU0101 
可运行 MATLAB 的普通办公计算机   
MATLAB 统计与机器学习工具箱，版本 11.1Mathworks  
微生物学用通用蛋白胨 M66Merck1070431000 
UPLSAPO 60XO 物镜Olympus 或同等物镜
酵母提取物FormediumYEA03 
不含氨基酸的酵母氮源基础FormediumCYN0405 

参考文献

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