从小鼠横纹肌肉瘤原代肿瘤细胞中分离肿瘤球并进行处理

摘要

本方案描述了一种可重复的小鼠横纹肌肉瘤原代细胞分离、肿瘤球形成与处理以及异体移植的方法，起始于肿瘤球培养物。

摘要

横纹肌肉瘤（RMS）是儿童中最常见的软组织肉瘤。尽管已有大量研究工作推动了与 RMS 相关的常见突变的鉴定，并实现了不同 RMS 亚型的区分，但在开发新型治疗方法以进一步改善预后方面仍面临重大挑战。尽管 RMS 可通过成肌标志物的表达来识别，但其细胞起源仍不明确，因此关于 RMS 起源于成肌细胞或非成肌细胞仍存在较大争议。本研究提供了一种用于小鼠 RMS 的肿瘤球体实验的可靠方法。该实验基于肿瘤细胞的功能特性，可用于鉴定肿瘤中具有致瘤功能的稀有细胞群体。文中还描述了检测重组蛋白、将转染方案与肿瘤球体实验相结合，以及评估参与肿瘤发生和生长的候选基因的操作流程。此外，还介绍了一种将肿瘤球体异体移植到受体小鼠体内的实验步骤，以在体内验证其致瘤功能。in vivo。总体而言，所述方法可对在不同背景下发生的 RMS 中的稀有致瘤细胞群体进行可靠鉴定与检测。最后，该方案还可作为药物筛选及未来治疗策略开发的平台。

引言

癌症是一种具有异质性的疾病；此外，同一种肿瘤在不同患者中可能呈现不同的基因突变，而在单个患者体内，肿瘤也由多种细胞群体组成¹。这种异质性为识别引发和推动癌症发展的细胞带来了挑战，但对这些细胞的特征进行表征对于开发有效的治疗手段至关重要。肿瘤传播细胞（tumor propagating cells, TPC）是一类稀有细胞群体，能够促进肿瘤的发展，这一概念此前已有广泛综述²。尽管TPCs已在多种癌症类型中被鉴定，但对于许多肿瘤类型而言，仍难以找到可用于可靠分离TPCs的分子标志物^{3,4,5,6,7,8,9}。因此，一种不依赖于分子标志物、而是基于TPC功能特性（如高自我更新能力以及在低黏附条件下生长的能力）的方法——即肿瘤球形成实验（tumorsphere formation assay）——可广泛应用于大多数肿瘤中TPCs的鉴定。重要的是，该方法还可用于TPCs的扩增，从而直接应....

方案

小鼠的饲养、处理和处死均按照桑福德伯纳姆普雷比斯医学发现研究所批准的IACUC方案进行。

1. 试剂准备

1. 准备 100 mL 细胞分离培养基：F10 培养基添加 10% 马血清（HS）。
2. 准备 50 mL 胶原酶 II 型溶液：将 1 g 胶原酶 II 型粉末溶解于 50 mL 细胞分离培养基中（注意每 1 mL 培养基中酶的单位数，因为不同批次的酶单位可能不同）。分装该溶液并储存于 -20 °C 冰箱中，待使用前取出。
   注意：每次使用前应对每一批次的胶原酶进行测试，因为不同批次间的酶活性可能存在差异。
3. 每份样品准备 10 mL 第二消化溶液：细胞分离培养基中含 100 单位/mL 胶原酶 II 型溶液和 2 单位/mL 新鲜称重的中性蛋白酶 II（dispase II）。使用前现配。
4. 准备 500 mL 肿瘤细胞培养基：DMEM 高糖培养基添加 20% FBS 和 1% 青霉素/链霉素（pen/strep）。
5. 准备 500 mL FACS 缓冲液：1x PBS 添加 2.5% v/v 正常山羊血清和 1 mM EDTA。
6. 准备 500 mL 肿瘤球培养基：DMEM/F12 培养基添加 1% 青霉素/链霉素（pen/strep）。使用前立即加入以下生长因子：1% N2 添加剂、10 ng/mL EGF 和 10 ng/mL β-FGF。

结果

肿瘤球检测
为获得肿瘤组织中细胞群体的最大异质性，对细胞分离方法进行了优化。首先，由于分离的组织在形态上存在差异区域，为提高分离出均一稀有细胞群体的概率，需从肿瘤的多个区域进行取样（图1A，左侧第一张图）。其次，在机械解离采集的样本时，应保持组织切碎后的大小均一，尽管不同样本之间可能存在不同的组织硬度（图1A，左侧第三和第四张图）。根据起始材料的不同（肿瘤侵袭性、小鼠年龄与基因型、肿瘤位置），细胞在经历分离过程中的机械应力后恢复时间可能有所差异，通常为3–7天（图1A，右侧最后一张图）。为提高细胞存活率和生长能力，应在分离后的第二天更换培养基，之后每2天更换一次。这有助于清除分离过程中积累的碎片和死亡细胞，避免其对细胞活力造成影响。肿瘤球形成实验应在细胞至少传代一次后开始，以确保细胞在悬浮培养条件下具有最佳的活力（

讨论

已采用多种方法从肿瘤异质性细胞群体中分离和鉴定肿瘤起始细胞（TPCs）：肿瘤克隆形成实验、荧光激活细胞分选（FACS）分离以及肿瘤球形成实验。肿瘤克隆形成实验最早于1971年被描述，最初用于干细胞研究，之后才逐渐应用于癌症生物学^29,30。该方法基于肿瘤干细胞在软琼脂培养中不受限制地增殖的内在特性³¹。自建立以来，该方法已广泛应用于癌症研究的多个领域，包括肿瘤细胞异质性研究、激素治疗对细胞生长的影响以及肿瘤耐药性研究³¹。迄今为止，该实验仍被用于多种类型癌症的肿瘤起始细胞鉴定³²。

FACS 分离依赖于对目标细胞表面存在的分子标志物的先验知识。该方法已被广泛用于从液体和实体肿瘤中分离肿瘤起始细胞（TPC）。例如，人类急性髓系白血病（AML）起始细胞的首次鉴定是由 Dr. Dick 的研究团队完成的，他们利用 FACS 分选和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase 细胞解离试剂	Gibco	A1110501	用于解离贴壁细胞和解离肿瘤球
Celigo	Nexcelom	Celigo	基于微孔板的图像细胞仪，适用于贴壁细胞和悬浮细胞
胶原酶 II 型	Life Technologies	17101015	组织消化酶
Dispase II 蛋白酶	Life Technologies	17105041	组织消化酶
DMEM 高糖培养基	Gibco	11965092	肿瘤细胞培养基的组分
DMEM/F12 培养基	Gibco	11320033	肿瘤球培养基的组分
EDTA	ThermoFisher	S312500	FACS 缓冲液的组分
重组小鼠 EGF 蛋白	Gibco	PMG8041	肿瘤球培养基的组分
FACSAria II 流式细胞仪	BD Biosciences	650033	荧光激活细胞分选仪
胎牛血清	Omega Scientific	FB-11	肿瘤细胞培养基的组分
Fluriso（异氟烷）麻醉剂	MWI Vet Supply	502017	动物用麻醉试剂
FxCycle Violet 染色剂	Life Technologies	F10347	区分活细胞与死细胞
山羊血清	Life Technologies	16210072	FACS 缓冲液的组分
Ham's F10 培养基	Life Technologies	11550043	FACS 缓冲液的组分
马血清	Life Technologies	16050114	细胞分离培养基的组分
Lipofectamine 3000 转染试剂	ThermoFisher	L3000015	转染试剂
Matrigel 基底膜基质	Corning	CB40234	为移植细胞提供支持
N-2 补充剂（100X）	Gibco	17502048	肿瘤球培养基的组分
新霉素-多粘菌素 B 硫酸盐-杆菌肽锌眼膏	MWI Vet Supply	701008	眼部药膏
PBS	Gibco	10010023	FACS 缓冲液的组分，用于细胞洗涤
pEGFP-C1	Addgene	6084-1	GFP 质粒
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140163	肿瘤球和肿瘤细胞培养基的组分
重组人 βFGF-基础型	Peprotech	10018B	肿瘤球培养基的组分
重组小鼠 Flt-3 配体蛋白	R&D Systems	427-FL-005	重组蛋白
台盼蓝	ThermoFisher	15250061	区分活细胞与死细胞