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一种追踪稳态诱发电位时间演变的方法

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DOI：

10.3791/59898

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2019年5月25日

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1Advanced Center for Electrical and Electronic Engineering (AC3E), Universidad Técnica Federico Santa María, 2Department of Electronic Engineering, Universidad Técnica Federico Santa María, 3Neuroinformatics Department, Cuban Neuroscience Center, 4Centro de Investigación y Desarrollo en IngenierÍa, Universidad de Valparaíso

本文内容

摘要

介绍了一种用于评估神经对重复性外部刺激的神经同步化随时间演变的实验方案。通过采集相同实验条件下稳态记录并在时域内进行平均，绘制响应幅度随时间变化的曲线，以分析稳态动态特性。

摘要

神经同步是指神经活动与感觉刺激周期之间的同步现象。这种同步表现为稳态诱发电位的产生（即脑电图中与驱动刺激相位锁定的振荡）。传统上对稳态诱发电位振幅的解释，通常假设存在一个典型的、不随时间变化的神经响应，叠加随机的背景波动，因此通过对多次重复刺激呈现的信号进行平均，即可恢复出该典型响应。这种方法忽略了稳态响应的动态特性，例如在长时间刺激暴露下引发的适应现象。为了分析稳态响应的动态变化，可假设在相隔足够长时间的不同刺激运行中，响应振幅的时间演化过程是相同的。基于这一假设，本文提出了一种用于刻画稳态响应时间演化的分析方法。该方法在相同实验条件下采集足够多的记录数据，并对实验运行（记录）进行列向平均（即对不同运行进行平均，但不将各记录内的片段与前一片段进行平均）。列向平均使得对信噪比极高的稳态响应记录进行分析成为可能。因此，平均后的信号能够准确反映稳态响应的时间演化过程，并可在时域和频域中进行分析。本研究以稳态视觉诱发电位为例，详细描述了该方法的实施流程，并通过与用于分析神经同步的单次试验方法进行比较，评估了该方法的优势与局限性。

引言

从头皮记录时，脑电活动表现为随时间连续且有规律的电压变化。这种电活动称为脑电图（electroencephalogram, EEG），最早由汉斯·贝格尔（Hans Berger）在上个世纪二十年代末首次描述1。随后的一系列开创性研究将EEG描述为一种复合的时间序列，其中可观察到不同的节律性或重复性模式2,3,4。如今，EEG通常被划分为五个明确的频率波段：delta、theta、alpha、beta和gamma，这些波段与不同的感觉和认知过程相关。

多年来，利用脑电图（EEG）对脑震荡的研究仅限于分析持续活动的频谱，或由非周期性感觉事件引发的振荡活动变化。近几十年来，研究人员已开发出多种方法，用于调控持续的脑电振荡，并探索此类调控对感知与认知过程的影响，其中包括采用节律性感觉刺激以诱导神经同步化。神经同步化是指神经活动与感觉刺激的周期性特征之间实现同步的现象。该过程可引发稳态诱发电位（即与驱动刺激周期特性相锁时的脑电振荡）。稳态诱发电位通常通过视觉、听觉和振动触觉刺激诱发，所用方法包括以恒定频率呈现的瞬态刺激，或在感兴趣频率上进行振幅调制的连续刺激。体感稳态诱发电位（SSSEPs）是在重复性触觉刺激下记录得到的5,6，而视觉稳态诱发电位（SSVEPs）通常由周期性呈现的亮度闪烁、图片和面孔刺激诱发7,8。听觉稳态反应（ASSRs）则通常由一系列瞬态声学刺激，或由连续呈现的振幅调制音调所引发9,10。

从测得的脑电图（EEG）中提取稳态诱发电位，本质上依赖于对与刺激在时间上同步的连续EEG片段进行平均11。由于响应具有周期性，因此可在时域和频域中对其进行分析。经过频域变换后，感觉响应表现为在外源性刺激的呈现速率或调制频率及其相应谐波处出现的振幅峰值。这些步骤（时域平均及随后的频域变换）对于开发基于听觉稳态反应（ASSR）检测方法的临床听力测试至关重要12,13,14,15,16。

此外，对脑电图（EEG）片段进行传统的时域平均在分析生理过程（如稳态视觉诱发电位（SSVEP）的产生与消失）方面极为有用17,18。Wacker 等人19通过呈现连续的闪烁光刺激序列，并对记录中相应的片段进行平均，发现SSVEP的相位锁定指数在刺激开始后的前400毫秒内迅速上升，之后保持在较高水平。他们还报告指出，在刺激开始后700至1100毫秒之间建立了稳定的视觉同步。在刺激序列结束之后，一定程度的同步效应仍然持续，其持续时间约为振荡反应周期的三个周期17,19。这些现象被解释为所观察到的振荡的“启动/脱离”效应，这是人类视觉系统中非线性信息处理的结果17。另一种观点认为，在某些实验条件下，闪烁刺激可能在刺激序列开始时引发“开-反应”，在结束时引发“关-反应”，而非神经同步18。

对连续采集的脑电图（EEG）片段进行平均的主要假设是，EEG信号代表了感觉反应与背景噪声的线性叠加20。此外，假设振荡反应的幅度、频率和相位是稳定的，而背景噪声则被视为一种随机活动。然而，在这些假设不成立的情况下，经过多个片段计算得到的反应幅度并不一定对应于诱发电位的瞬时幅度。

最近有报道称，在大鼠脑干中产生的听觉稳态反应（ASSR）会对持续呈现的幅度调制音调产生适应现象（即反应幅度随时间呈指数下降）21,22。这种适应性被认为是一种神经机制，反映了对单调重复感觉刺激的新异性丧失，从而提高了对声学环境中重要变化的敏感性23,24。在听觉通路中，这种适应可能有助于在噪声环境中提升言语理解能力。此外，该过程可能还参与了现有机制，用于监测自身发声的听觉反馈，以调控言语的产生。

Van Eeckhoutte 等人通过分析人类 40 Hz ASSR 随时间的变化25，发现反应 幅度随时间呈显著但微小的下降趋势（基于组分析，假设随时间呈线性下降，约为 -0.0002 µV/s）。因此，这些作者得出结论：人类的 40 Hz ASSR 不会对刺激产生适应。在人类中，当分析 SSVEP 稳定性时，已观察到非平稳行为26。这些作者发现，在受试者中，仅有 30% 和 66.7% 的个体分别在 SSVEP 基频和第二谐波的幅度上表现出平稳性。尽管 SSVEP 两个频率成分的相位在时间上相对稳定，但仍表现出轻微的漂移26。

因此，尽管通过对相继获取的片段进行传统的时域平均可以研究神经跟随的稳态特性，但当研究重点为跟随效应的长期动态特性，或短时动态的平均过程受到长期动态干扰时，该方法需要加以修正。为了表征稳态反应的非稳态行为，在特定时间窗内计算的诱发电反应不应受到先前脑电片段计算结果的影响。换句话说，应从背景噪声中提取诱发电位，而无需将各个片段与先前的脑电段进行时域上的平均处理。

本研究提出了一种评估神经同步动态特性的方法。通过重复施加相同的刺激，连续记录稳态反应，且每次记录之间插入一段静息间隔，其时长为实验运行时长的三倍。假设在不同独立实验运行（独立记录）中生理反应的时间演化过程一致，则对记录数据按列进行平均。换句话说，将不同记录中对应相同时间位置的片段进行平均，而不对单次记录内的片段进行平均。因此，在任意刺激时间间隔计算得到的反应幅度均对应于诱发电位的瞬时幅度。根据实验目的，感觉反应可在时域中进行分析，也可转换至频域进行分析。无论何种情况，均可将幅度值随时间变化作图，以分析稳态反应的时间演化过程。通过将分析限定于记录数据的首个和末个片段，可评估稳态诱发电位的产生与消失过程。

神经同步的动态特性可以通过其他方法进行分析，例如在目标频率附近对单次试验测量数据进行窄带滤波，并通过低通滤波25和希尔伯特变换27计算功率信号的包络。与这些方法相比，对片段进行列向平均能够基于信噪比（SNR）更高的信号来计算稳态参数。近年来，卡尔曼滤波已成为估计40-Hz听觉稳态反应（ASSR）幅度的一种有前景的技术28,29,30。实施卡尔曼滤波可提高接近电生理阈值的稳态反应检测能力，并缩短听力测试所需时间29。此外，当使用卡尔曼滤波方法估计ASSR幅度时，无需假设响应是平稳的30。然而，目前仅有一项研究利用卡尔曼滤波分析了ASSR的时间演化过程25。该研究的结论是，40-Hz ASSR幅度在刺激期间保持稳定。因此，有必要在ASSR非平稳的条件下进一步验证卡尔曼滤波的效果。

尽管耗时较长，但列平均法是一种无需模型的方法，不需要初始值和/或对噪声行为的先验定义。此外，由于该方法不涉及收敛时间，列平均法可能更可靠地表征神经同步化的起始过程。因此，使用列平均法获得的结果可作为利用卡尔曼滤波分析神经同步化动态特性的基准真值。

本方案的描述基于稳态视觉诱发电位（SSVEP）的示例。然而，需要注意的是，此处介绍的方法不依赖于特定模态，因此具有模态无关性 也可用于分析稳态诱发电位（SSSEP）和听觉稳态反应（ASSR）的时间演变。

方案

本研究经智利瓦尔帕莱索大学研究与伦理委员会批准（评估声明编号 CEC170-18），符合国家关于涉及人类受试者研究的指导方针。

1. 准备

  1. 欢迎受试者。
  2. 说明研究的目的和意义，介绍相关技术细节，并全面回答所有问题。
  3. 明确告知受试者可根据个人意愿在任何时间中断实验过程。
  4. 请志愿者阅读知情同意书并签署相应文件。若未获得知情同意，应立即中断实验过程。

2. 受试者准备

  1. 让受试者坐在实验室椅子上，保持舒适姿势。
    1. 使用乙醇（95%溶液）清洁头皮，以去除覆盖在头皮表面的死皮细胞和皮脂层。此步骤对于降低电极与头皮之间的阻抗至关重要。
  2. 使用卷尺测量头围，以确定应使用的电极帽尺寸。
    1. 让受试者佩戴电极帽，并指导其正确且舒适地佩戴。
    2. 使用卷尺测量鼻根点（Nz，鼻额缝的中点，可通过双眼之间及鼻梁上方的凹陷处识别）与枕外隆凸（Iz，枕骨隆起处）之间的距离。
    3. 使用卷尺测量左右耳前点（即耳廓前方稍凹陷处）之间的距离。
    4. 调整电极帽的位置，使前几步中定义的假想线交点与头部顶点对齐。调整后确保受试者感到舒适。
  3. 根据实验设计的电极位置，在电极插槽中注入导电凝胶。
    1. 按照国际10-20系统31使用64个头皮位置，以便后续利用本方案结果进行源定位分析。如有需要，也可使用更多电极位置（如128个）。
    2. 若不计划进行源定位分析，可采用临床或便携式设置（仅使用少量电极）。使用枕区位置记录稳态视觉诱发电位（SSVEP），颞区位置记录听觉稳态反应（ASSR），顶区位置记录体感稳态诱发电位（SSSEP）。
    3. 将电极插入电极插槽中，并确保电极标签与电极帽上的位置标签一致。
    4. 引导志愿者进入实验房间（最好为屏蔽且隔音的房间），让受试者在房间内坐在椅子上，保持舒适姿势。
  4. 若计划使用物理参考电极（不同于头皮电极）对脑电记录进行重参考（见步骤3.8.1），则需在鼻部和耳垂放置外部电极。
  5. 在眶周区域放置外部电极。
    1. 在面颊及额头区域、眉毛上方约1 cm处放置电极，用于记录眨眼信号（见步骤2.6.1）。
    2. 在眼外眦处、中线上方或下方约1 cm处放置电极，用于记录眼球运动（见步骤2.6.1）。
      注意：在步骤3.8.5中，将使用眼电图（EOG）去除由眨眼和眼球运动引起的脑电伪迹。
  6. 开启脑电采集系统，若使用低阻抗系统记录脑电，则检查各电极阻抗，并根据制造商说明进行必要调整。阻抗应保持在10 kΩ以下32.
    1. 让受试者眨眼并朝不同方向移动眼睛，以确认眼电图（EOG）信号被正确记录。
  7. 为分析稳态视觉诱发电位（SSVEP）的动态特性，调整屏幕在垂直方向的位置，使其与受试者的视线角度匹配。调暗房间灯光至舒适水平，并将屏幕亮度调节至受试者可耐受的最高舒适水平。
    1. 为分析听觉稳态反应（ASSR）的动态特性，正确插入耳机并使用合适的泡沫耳塞，确保耳机贴合耳道。检查声音是否以预期强度输出（例如，心理物理上的舒适水平33）。

3. 脑电图采集与预处理

  1. 根据实验设计设定刺激参数。有关软件的详细信息，请参阅刺激系统制造商提供的用户手册。
    注意：关于用于生成稳态视觉诱发电位（SSVEP）和听觉稳态反应（ASSR）的刺激的全面解释，请分别参见 Norcia 等人8 和 Rance34。
  2. 在实验主题为视觉同步时，指导受试者注意刺激。
    1. 在实验主题为听觉同步时，播放带有字幕但关闭声音的电影。
      注意：播放无声电影可在维持受试者觉醒水平的同时，使其注意力偏离声学刺激25。
  3. 刺激呈现时间应超过 90 秒，以研究 SSVEP 和 ASSR 在人类及动物模型中的时间演变过程21,22,25,26。
    注意：若已开展预实验，可呈现较短持续时间的刺激。
  4. 若仅测试一种实验条件，则在刺激后暂停 2 分钟。与受试者互动以检查其警觉状态。
    注意：暂停时间取决于刺激持续时间。暂停时间设置为刺激间隔的 3 倍以上，可确保前一次刺激引发的反应不受先前刺激的影响。若受试者提出要求，可允许更长的暂停时间。
    1. 当测试不同实验条件时，每次刺激后至少暂停 10 秒，因为交替进行刺激与 10 秒暂停已被建议用于减少额外适应效应并缩短实验总时长25。
  5. 重复刺激呈现步骤（步骤 3.3–3.4）至少 30 次，以确保在对片段进行平均处理后（步骤 4.4）获得高信噪比的测量结果。
  6. 使用标准程序记录脑电图（EEG）35。为每次实验运行创建独立的 EEG 文件。
    注意：有关软件的详细信息，请参阅采集系统的用户手册。
  7. 监测 EEG 记录，根据 α 活动水平及眨眼伪迹出现的频率判断是否进入睡眠期。当检测到 α 活动水平升高且眨眼频率降低时，表明受试者出现困倦，应暂停实验。若检测到睡眠期，则将该次实验运行从后续分析中剔除。
    1. 按照实验所用采集软件用户手册中的说明，在每次实验运行结束时计算稳态反应的幅值。
    2. 通过比较每次实验运行结束时获得的稳态反应幅值，监测受试者的注意力水平。将首次实验运行中获得的稳态幅值设为参考幅值。
    3. 设定剔除阈值（即反应幅值较参考幅值下降 5%）。当稳态反应幅值达到剔除标准时，剔除该次实验运行。
    4. 在完成实验设计中预设的运行次数后，结束实验会话。
  8. 根据制造商说明，使用标准 EEG 处理流程35对 EEG 数据进行离线预处理，具体步骤如下：
    1. 使用平均参考（所有记录电极的平均值）或部分电极的平均值对记录数据重新参考。也可使用物理参考（例如步骤 2.4 中描述的放置于鼻尖和耳垂的外部电极）。
    2. 若 EEG 采集过程中使用了径向坐标系统，则将电极坐标转换至国际 10-20 系统。有关转换细节，请参阅制造商手册。
    3. 对 EEG 信号进行 0.5–300 Hz 的带通滤波。如有必要，设置陷波滤波器（中心频率为 50 Hz 或 60 Hz）。
    4. 对 EEG 信号进行降采样，以减少用于去除眼动伪迹的算法（步骤 3.8.5）的运行时间。
      注意：512 Hz 的采样频率足以分析频率低于 40 Hz 的脑振荡35。
    5. 去除眼动伪迹。
      注意：可采用多种技术实现此目的（详见 Urigüen 和 Garcia-Zapirain35 对伪迹去除算法的综述）。其中，独立成分分析（ICA）是最广泛应用的方法之一，已被集成于多种商业及开源分析软件中37,38,39。
    6. 将 EEG 数据按刺激时间锁定分段为多个片段（epochs）。根据实验目的选择片段长度。
      注意：片段应足够长，以便在频域中对稳态反应进行具有足够谱分辨率的分析。
    7. 此阶段不要运行伪迹剔除算法来检测和剔除含伪迹的片段。
      注意：在此阶段剔除片段会导致在组织数据集以进行列向平均处理（步骤 4.2 和 4.4）时引入误差。伪迹剔除算法将在后续处理步骤中实施（步骤 4.1.4）。
    8. 运行去趋势（DC-detrend）功能，计算单个 EEG 片段中的直流趋势并予以校正。
    9. 运行基线校正功能，以校正记录的基线。选择刺激前时间窗长度超过 200 ms。
      注意：基线校正包括对选定时间区间内的数据求平均值，该平均值针对每个通道计算，并从每个片段中的每个数据点中减去。

4. 响应幅度的计算

  1. 输入计算稳态响应所需的参数（图1A）。
    注意：用于处理数据的内部代码可在 <https://figshare.com/ projects/Steady-state_visually_evoked_potentials_SSVEP_elicited_in_humans_by_continuos_light_modulated_in_amplitude_at_10Hz/62573> 免费获取。更多操作说明请参阅代码内的帮助文本。同样，本研究中使用的一部分数据也可获取。
    1. 输入实验的记录次数（实验运行次数）。
    2. 输入用于分割单个记录的片段长度（epoch长度）。
    3. 输入实验的采样频率。
    4. 选择伪迹剔除算法，以检测并剔除包含伪迹的片段。可选的判据包括：1）梯度（连续两个采样点之间的绝对差值），2）最大-最小值（片段内最大与最小振幅之差），以及 3）振幅（片段内绝对最大值和最小值）。
    5. 运行处理代码。
      注意：选择此选项后，步骤4.2–4.7将自动执行。如需，也可手动运行这些步骤。
  2. 将片段重新排列为一个具有 n 行和 m 列的数据矩阵，其中 n 表示记录次数（实验运行次数），m 表示片段数量（图1B）。
  3. 对片段进行加权，以减弱运动和肌电伪迹的影响。
    注意：加权后的脑电片段通过将每个电压采样点除以其所属片段的振幅方差获得，因此方差被用作振幅变异性的度量和加权因子40。
  4. 对数据集按列进行平均。具体方法是对不同记录中对应相同时间窗口的片段在时域上进行平均。
    注意：此步骤可实现对信噪比（SNR）显著提高的记录中稳态振幅的计算。
  5. 导出平均后得到的时间序列，以便在外部软件中进一步分析同步化的时间演化过程。
    1. 使用快速傅里叶变换（FFT）计算按列平均后每个片段的稳态响应振幅。
      注意：FFT长度应与单个片段的长度一致。是否采用窗函数技术并非强制要求。稳态响应的振幅定义为在感觉刺激振幅调制频率处获得的频谱振幅。
  6. 在响应频率两侧各取若干个FFT频点进行矢量平均，以计算残余噪声水平（RNL）。两侧FFT频点的数量应对应约3 Hz的频带宽度。
    注意：稳态响应具有高度的频率特异性，使其响应振幅独立于频率相近的背景振荡，而这些背景振荡在相对较窄的频带内呈均匀分布41,42,43。
  7. 绘制稳态响应振幅和RNL随列索引（即采集的片段序号）变化的曲线，以探究刺激期间稳态响应的演化过程。

结果

采用持续40秒的视觉刺激诱发稳态视觉诱发电位（SSVEP），其中光强由频率为10 Hz、调制深度为90%的正弦波进行调制。刺激由位于50 cm × 50 cm黑色屏幕中央的四个发光二极管（LED）提供，LED排列成边长为5 cm的正方形的四个顶点。当受试者距离屏幕70 cm时，LED组成的正方形区域所对应的视觉角度约为4°。LED屏幕采用基于USB的微控制器开发系统，并结合四个直径为10 mm的超高亮度白色LED制成。通过脉冲宽度调制（PWM）技术控制供给LED的功率，该技术可在设定频率下调节LED的光强，并生成最终的正弦包络。PWM频率设为40 kHz，以避免产生可感知的闪烁效应。

共获得30次记录，每条记录被分割为4秒的片段。因此，得到一个包含10列（每条记录中的脑电图片段数量）和30行（记录次数，即实验运行次数）的数据集。

与刺激时间锁定的神经振荡在进行列平均后变得明显（图2）。值得注意的是，可在对应第1列的轨迹中观察到产生稳态视觉诱发电位（SSVEP）的时间区间。在该列中，除绘制了刺激开始后前0.8 s的神经同步化过程外，还包含了刺激前0.2 s的基线期。因此，此处描述的方法可用于表征：1）神经同步化建立后振荡反应的动力学特征；以及2）神经振荡的启动过程。此外，刺激结束后记录的一个或多个时段数据也可纳入数据矩阵中，以研究刺激终止后稳态反应的消退过程。

在对列进行逐列平均时，稳态视觉诱发电位（SSVEP）的平均振幅（通过应用快速傅里叶变换FFT计算得到的10 Hz处的频谱振幅）在列的前几个片段平均过程中下降，并在此后趋于稳定（图3A）。该结果与先前研究分析连续采集的片段在平均过程中听觉稳态反应（ASSR）演变趋势的结果一致21,22,40,43,44。在平均过程中，反应振幅的变化通常归因于未平均噪声在初始片段计算的反应振幅中占比较高，随着平均过程的进行，噪声影响逐渐减弱13,44,45,46,47。值得注意的是，随着平均过程的推进，SSVEP振幅的变异性显著降低。

我们还在对各个周期进行列向平均时分析了测量结果的相对噪声水平（RNL）（图3B）。RNL是在SSVEP频率两侧的一个窄频带（3 Hz）内计算的。尽管在分析SSVEP时这种处理并不常见，但在ASSR测量中，对神经锁相频率周围一定数量的频带进行矢量平均是估算RNL的标准方法41,42,43。正如预期，随着平均周期数的增加，RNL逐渐降低，并在处理约20个周期后达到渐近水平。与分析SSVEP幅值时观察到的结果不同，随着平均周期数的增加，RNL的标准差保持相对恒定，这表明实验过程中记录条件是稳定的。

上述结果确定了在对各个周期进行列方向平均时，测量结果的峰值信噪比（pSNR）的变化情况（图3C）。此处将该术语定义为反应信号（SSVEP）的平方幅值与参考噪声水平（RNL）的平方幅值之比（以dB为单位）。随着平均周期数的增加，pSNR随之升高，直至平均周期数达到约18个为止。进一步增加平均周期数对信号质量无显著影响。随着平均周期数的增加，pSNR的变异性降低。

最后，SSVEP 振幅与 RNL 的动态变化如图 4所示。这些时间演化曲线是通过将列向平均 epoch 后计算得到的响应参数随列数（即时间）变化绘图而获得的。正如 Labecki 等人26所证明的，SSVEP 的动态在不同受试者之间可能存在显著差异。由于图 4中展示的结果仅来自单一个体，因此无法进行推广。在该受试者中，SSVEP 的振幅表现出相对复杂的行为（图 4A）。在刺激开始后的前 12 秒内（对应于 3 个 epoch 的持续时间），响应振幅逐渐增加。随着刺激持续，SSVEP 在接下来的 12 秒内持续下降，之后则保持相对稳定。这些结果无法通过 RNL 的行为来解释，因为该参数在刺激期间保持相对恒定（图 4B）。刺激开始后 SSVEP 振幅的增加在图 2所示的迹线中明显可见，可归因于神经同步化的稳定过程，即整合机制的作用。随后振幅的下降则提示 SSVEP 对持续刺激产生了适应。然而，这些假设需要在具有适当样本量的对照实验中进一步验证。

数据分析的代码设置以及跨时段和运行次数的时间序列平均示意图，用于统计研究。
图1：提取稳态反应振幅时间演变的关键步骤。（A）处理代码的截图，其中定义了分析参数。（B）代表性示意图，展示数据集的组织方式。图中表示一个由10个时段共30次记录组成的数据矩阵。第一列突出显示了按列方向对时段进行平均的过程。垂直线表示平均运算的方向。请点击此处查看该图的放大版本。

脑电图信号分析，时间段内的波形模式，折线图，脑活动测量，时间（秒）
图2：列方向上对时间段进行平均时，稳态视觉诱发电位（SSVEP）波形的变化。 通过以10 Hz的频率持续进行光刺激（振幅调制），诱发出相应的脑电响应。图中每一行显示的是对之前所有记录数据进行平均后得到的波形（即第1行为首次记录的结果，第5行为前5次记录平均后的波形，最后一行为所有记录的平均结果）。随着平均次数的增加，每一列中SSVEP的波形变得更加可靠。为了清晰展示（使SSVEP的振荡更易观察），仅显示每个时间段的前1秒。数据集中第一列的波形除外，其额外显示了刺激前0.2秒的基线期。 请点击此处查看该图的放大版本。

稳态视觉诱发电位、相对噪声水平、峰值信噪比与平均后的时间窗；图示脑电研究中的信号分析。
图3：按列平均时间窗过程中响应与记录参数的变化。（A）稳态视觉诱发电位（SSVEP）振幅的演变。（B）相对噪声水平（RNL）的变化。（C）峰值信噪比（pSNR）的变化。黑色线条表示每列（n = 10）所得的平均值，灰色阴影区域表示±一个标准差所覆盖的范围。请点击此处查看该图的放大版本。

显示微伏单位下脑电信号振幅随时间变化的SSVEP与RNL图，实验分析。
图4：由振幅调制为10 Hz的持续视觉刺激诱发的稳态视觉诱发电位（SSVEP）的时间演变。（A）SSVEP振幅的时间进程。（B）RNL的时间进程。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究描述了一种用于分析振荡性脑反应动态特征的实验方法。该方法包括获取足够数量的相同实验条件下独立实验运行数据，并对不同记录中对应相同时间窗口的时域平均片段进行列向平均（columns-wise averaging） 图1B）。在平均数据中计算得到的振幅代表振荡反应的瞬时振幅。将这些振幅随时间（或数据集中的列数）作图，可分析与刺激时间锁定的振荡反应随时间的演变过程。该方法是对 Ritter 等人提出的方法的改进。23 用于分析瞬态皮层诱发电位的适应性。该方法已被用于分析听觉诱发电位在两者的动态变化中。 人类24 和动物模型20,21.

从方法学角度来看，用于诱发稳态反应的参数组合以及从背景噪声中提取神经反应的参数组合，对于分析稳态诱发电位的时间演化过程至关重要22。本实验中所采用的刺激时长（40 s）是基于预实验结果选定的。该刺激时长足以分析大鼠脑干中产生的听觉稳态反应（ASSR）的适应过程21,22。此外，刺激时长应超过稳态视觉诱发电位（SSVEPs）的渐近瞬时频带功率达到稳定状态所需的时间（参见 Labecki 等人26中的图1）。然而，在某些情况下，SSVEPs 的渐近瞬时频带功率可能在超过 60 秒后才达到稳定（参见 Labecki 等人26中的图2）。因此，建议开展小样本预实验以确定刺激的刺激时长。否则，建议使用超过 90 秒的刺激时长，以实现对反应时间演化的完整表征。在连续记录之间设置足够长的间歇，意味着可将连续的实验运行视为统计上相互独立的（即对同一变量进行的不同、独立测量）。据我们所知，目前尚未开展实验以分析运行间最佳间歇时长（即确保各次运行相互独立所需的最短间歇）。采用至少为刺激时长 3 倍以上的间歇标准，是一种足够保守的策略，可确保在任意一次运行中记录到的稳态反应不受前一次刺激的影响。

近期，有研究提出采用交替刺激（实验条件）的方式以减少实验运行之间的暂停时间，从而避免额外的适应效应25。同样，本实验方案中所采用的实验运行次数（30次）较为保守，因为通常在平均约20次实验运行后即可达到渐近的RNL和pSNR。当刺激位于反应动态范围的中上区域（高感觉水平）时，可能需要较少的运行次数即可分析诱发电反应的动力学特征。然而，在测试不同实验条件的情况下，保持相同的实验运行次数对于不同条件之间（例如，不同感觉水平）的比较至关重要。

除了对片段进行列向平均外，通过在感兴趣频率附近的窄频带内对单次试验测量数据进行滤波，并利用低通滤波计算功率信号的包络，也可分析振荡性诱发电位的动态特性26。类似地，已有研究采用单次试验分析来表征稳态视觉诱发电位（SSVEP）进入稳定状态前的过渡期48，以及响应稳定阶段期间SSVEP的振幅和相位变化49。尽管单次试验分析能够分辨响应振幅的相对较快波动，但以特定块间间隔分隔的区块设计用于分析平均响应时，仅能反映诱发电位振幅的长期变化50,51。对片段进行列向平均介于上述两种方法之间。将平均信号通过快速傅里叶变换（FFT）转换至频域，意味着以片段长度为分辨率来分析响应的动态特性。在本例中，SSVEP每4秒报告一次。虽然4秒的分辨率足以描述持续数十秒以上的时间尺度上的动态过程（例如SSVEP）26，但在原始记录中使用部分重叠的时间片段可更精细地刻画稳态响应的时间演化过程25。

通过对各时段进行列向平均后获得的稳态反应的动态特征，主要反映了在平均后的脑电图（EEG）片段中同步的振荡活动的演变过程（即能够通过平均保留下来的活动）。因此，该方法可行性的一个主要问题是，由于不同独立实验运行之间（即不同记录之间）神经振荡相位的变化，可能导致反应幅度的衰减。这一问题需要通过实验加以验证。然而，已有证据表明，脑振荡反应的相位变异性低于预期。事实上，多项研究报道了人类80 Hz听觉稳态反应（ASSR）相位具有规律性47,48,49。当基于振荡活动的相位来估计潜伏期时，已观察到声刺激的强度和载波频率对听觉反应潜伏期具有可预测的影响（即随着强度和载波频率的增加，潜伏期缩短）52,53,54。此外，当从ASSR相位估计潜伏期时，还观察到了典型的成熟相关振幅变化以及听力水平从左到右的不对称性47,55,56,57,58。Labecki 等人26在使用单次试验分析描述稳态视觉诱发电位（SSVEP）的时间演化过程时发现，尽管同一受试者内各次试验间反应幅度的变异性较高，但相位的变异性则显著更低。

根据Labecki等人的观察26 ，建议至少对50次试验进行平均，以获得反应平均功率包络的可靠估计。这些结果表明，即使在单次试验中计算反应的幅度，仍需对包络进行平均，才能报告可信的结果。此外，Labecki等人26报告的稳态视觉诱发电位（SSVEP）幅度的试次间变异性提示，在单次试验中计算该参数可能受到背景噪声的显著影响。结合图2中呈现的信噪比变化趋势，对平均信号而非单次试验进行响应计算，可显著减少为获得可靠测量所需处理的脑电（EEG）片段数量。此外，Labecki等人26获得的相位低变异性结果支持了本文所采用的按列对片段进行平均的方法，是计算振荡性诱发电位动态特征的有效手段。

在不同水平上对数据进行平均会导致对结果的不同解释。关于振荡诱发电位，在对独立运行的数据进行时域平均后计算反应幅度，意味着仅分析时间锁定的振荡（即那些能够通过平均保留下来的振荡）。该方法可能会滤除有关单个试验中反应动态的有用信息。然而，它能保证测量具有足够高的信噪比。当反应接近电生理阈值时，这一特性可能尤为重要，因为在信噪比较低的情况下，可能难以检测到同步化反应的出现。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Lucía Zepeda、Grace A. Whitaker 和 Nicolas Nieto 在视频制作方面的贡献。本工作部分由 CONICYT 的 BASAL FB0008、MEC 80170124 项目以及博士生奖学金 21171741 项目资助，同时也得到了美国国立卫生研究院耳聋及其他交流障碍国家研究所的支持，资助编号为 P50DC015446。本内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
有源电极 BiosemiP32-1020-32ACMS (ABC)用于通道 1-32
有源电极 BiosemiP32-1020-32A (ABC)用于通道 33-64
有源电极 Biosemi8 x TP FLAT外部电极
Active-Two 采集系统Biosemi版本 7.0脑电采集系统
酒精Salcobrand编号： 3309011用于清洁头皮
64通道电极帽 BiosemiCAP MS xx yy电极帽 
64通道电极帽 BiosemiCAP ML xx yy电极帽 
导电膏BiosemiSIGNA BOX12导电凝胶
笔记本电脑AsusCore i7 1TB DD + 128GB SSD 8GB RAM 用于刺激的计算机
笔记本电脑AsusCore i7 1TB DD + 128GB SSD 8GB RAM 用于记录的计算机
LED 屏幕自制-该屏幕由四个发光二极管（LED）组成，位于一块 50×50 cm 黑色屏幕的中心，呈 5×5 cm 正方形的四个顶点排列
无菌纱布Salcobrand编号： 8730277用于清洁头皮

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