蜱虫血淋巴的分析是研究某些病原体致病机制以及蜱虫对感染产生免疫应答的重要信息来源。本研究展示了如何将真菌繁殖体接种至饱血雌性微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）体内，并从中采集血淋巴。
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方法文章
披露用于无脊椎动物病理学研究的Metarhizium分生孢子注入微小牛蜱Rhipicephalus microplus及血淋巴采集方法
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摘要
摘要
蜱虫是专性吸血的体外寄生虫，其中微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）在兽医领域具有重要意义，因其可导致动物贫血、体重减轻、皮革品质下降，并且还可作为多种病原体的传播媒介。由于控制这些寄生虫的成本高昂、不当使用化学杀螨剂对环境造成危害，以及传统杀虫剂抗性不断增强，因此采用替代方法（例如利用昆虫病原真菌）来控制蜱虫已成为一种备受关注的策略。然而，目前极少有研究阐明蜱虫免疫系统如何应对这些昆虫病原体。因此，本实验方案介绍了两种将昆虫病原体接种至饱血雌蜱的方法，以及两种采集血淋巴和分离血细胞的技术。在雌蜱体壁腿部附着处进行病原接种，可避免损伤盖氏器官，从而更有利于评估雌蜱的生物学参数，而盾板与颚体之间的接种则常导致盖氏器官受损。从背侧采集血淋巴所获得的液体体积高于通过腿部采集的方法。蜱虫血淋巴采集与处理过程中存在若干局限性，包括：i）血细胞破裂率较高；ii）血淋巴易被破裂的中肠组织污染；iii）血淋巴回收量较低。当通过切断腿部采集血淋巴时，血淋巴需较长时间才能在腿部切口处积聚，这容易促进凝血过程的发生。此外，与背侧采集相比，腿部采集所获得的血细胞数量更少，尽管前一种方法被认为操作更为简便。深入了解由昆虫病原体介导的蜱虫免疫应答，有助于揭示其致病机制，并为开发新的蜱虫防控靶点提供依据。本文所述的接种操作所需技术资源极少，不仅可用于使蜱虫暴露于致病性微生物，也可广泛应用于其他实验条件下的研究。同样，蜱虫血淋巴的采集可作为开展多种生理学研究的第一步。
引言
牛蜱（Rhipicephalus microplus）是一种吸血性外寄生虫，对热带地区畜牧业造成巨大的负面影响。该蜱虫可传播多种病原体，如Babesia bovis、Babesia bigemina和Anaplasma marginale，加之其直接吸血造成的损害，可导致奶产量和肉产量下降、引发贫血，甚至最终导致死亡。据估计，该外寄生虫仅在巴西每年造成的经济损失达32.4亿美元1。目前亟需可持续的防控方法，而利用昆虫病原性因子被认为是一种有前景的替代策略，有助于减少化学 杀螨剂的使用2,3,4。
昆虫病原真菌，例如 Metarhizium 属真菌，是包括蜱虫在内的节肢动物的天然敌害，某些菌株可用作生物防治剂。这些病原体可通过表皮主动侵染宿主，并在其体内定植2,5,6。随着感染的发展，蜱虫免疫系统会介导细胞和体液免疫应答。已有研究报道，分析蜱虫血淋巴是评估病原体攻击后免疫应答的有效工具7,8。
节肢动物的免疫反应分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫涉及血凝过程以及抗菌蛋白/肽的产生，而细胞免疫反应则通过血细胞来完成。血细胞存在于所有节肢动物的血淋巴中，据报道在涉及先天免疫反应的研究中发挥重要作用9，因其与吞噬作用和包囊作用过程直接相关。因此，对血细胞的研究有助于探究细胞死亡通路，并深入理解自噬、凋亡和坏死等过程。在某些无脊椎动物（如双壳类）中，血细胞采集面临诸多限制，包括细胞破裂、获得的血淋巴体积小以及回收细胞浓度低10。在实际操作中，由于所采用方法的不同，常常获得较低浓度的细胞，从而直接影响细胞的定量与分析。
不同节肢动物血淋巴中循环的血细胞数量存在差异，且在同一物种中，由于性别、年龄以及节肢动物发育阶段等不同生理状态的影响，其数量也可能发生变化11。血细胞也可能附着于某些器官，在感染过程发生后才释放进入循环系统11。然而，大多数相关研究集中于昆虫，而关于蜱类的生理学和病理学研究仍相对较少。尽管病原体接种和蜱类血淋巴采集技术应用较少，但建立标准化方法有助于推动更精确的研究发展。
本研究旨在比较采集微小牛蜱（R. microplus）血淋巴及接种病原体的最常用方法，评估不同方法在获取血淋巴以及血细胞浓度方面的有效性。
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方案
本研究所使用的蜱虫来自位于里约热内卢联邦农村大学的人工饲养种群，该研究方法已获得脊椎动物动物使用伦理委员会（CEUA-IV/UFRRJ #037/2014）的批准。
1. 蜱虫吸血后的雌性成虫
- 采集蜱虫后，用自来水清洗饱血雌蜱，并将其浸入500 mL玻璃烧杯中的0.5%（v/v）次氯酸钠溶液中3分钟，以进行体壁消毒。图1），然后使用无菌纸巾将所有雌性小鼠擦干（图2).
- 将雌性个体按体重均分为若干组（每组20只）：一组不进行任何处理，一组对照组接种5 µL 0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯水溶液（v/v），一组感染组接种5 µL浓度为1.0 × 107 芽生孢子/mL-1.
注意：仅使用未经处理的蜱虫进行体积和血细胞浓度测定。每组进行三次重复实验。
2. 在盾板与头壳之间接种病原体
注意：本研究中以昆虫病原真菌悬液为例。
- 将真菌芽生孢子悬浮于1 mL 0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯水溶液（v/v）中，并调整至终浓度为1.0 × 107 每毫升芽生孢子-1加入5 µL等分试样 绿僵菌 芽生孢子（图3) 悬液加至塑料石蜡膜表面。
注意： 绿僵菌 使用血球计数板调整芽生孢子悬液浓度. 为加快接种过程，可在塑料石蜡膜表面添加多个气泡，每个气泡对应5 µL。 - 使用1 mL超细胰岛素注射器和0.3 mm针头吸取悬浮液，并将其接种到蜱虫体内。使用前务必排尽注射器内的所有空气。
- 将5 µL真菌悬液接种于蜱雌虫盾板与颚体之间的部位。对照组雌虫接种5 µL不含真菌的0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯水溶液（v/v）。
注意：针头插入后，小孔处可能会有少量血淋巴出现。注意避免将空气接种入内。
3. 在蜱虫雌体身体与腿部大腿之间接种昆虫病原真菌
- 用真菌悬液接种雌虫（5 µL，浓度为1.0 x 107 每毫升芽生孢子-1使用1 mL超细胰岛素注射器连接0.3 mm针头，在腿部与雌虫体壁之间注射。对照组雌虫接种5 µL 0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯水溶液（v/v）。
注意：当 绿僵菌 在腿节与雌性蜱虫体壁之间进行芽生孢子接种时，针头插入后腿节处可能有少量血淋巴渗出。注意避免接种空气。
4. 背血淋巴采集
- 使用带翼输液器的橡胶部分、0.3 mm毛细管和带滤芯的吸头进行血淋巴采集。
- 用0.3 mm的针头破坏雌性蜱虫的背侧表皮。
- 破坏后，轻轻按压蜱虫身体的前部。观察到几乎透明的液体从破损处渗出。通过连接在带翼输液器橡胶部分上的带滤芯吸头和0.3 mm毛细管吸取液体，收集血淋巴。
注意：在固定蜱虫时不要用力按压其身体，以免破坏中肠并污染血淋巴。应等待通过轻柔按压即可排出无污染的液体后再进行采集。
5. 从蜱虫腿部采集血淋巴
- 固定蜱虫，用剪刀剪下其一条前腿的一部分。
注意：可剪取一条或多条腿，同一条腿也可多次剪取。 - 对蜱虫的后部身体施加轻柔压力。观察在切口处出现的透明液体气泡，并用毛细管收集，操作方法如步骤 4.3 所述。
注意：在固定蜱虫时切勿用力按压其身体，以免破坏中肠并污染血淋巴。应等待直至轻柔压力即可排出无污染的液体。
6. 血淋巴处理
- 采集血淋巴后，将其注入预先装有30 µL蛋白酶抑制剂混合液和82 µL生理缓冲液的1.5 mL微量离心管中。在整个血淋巴采集过程中，将微量离心管置于冰上保存。
- 离心样品（4 °C下，500 × g 离心3分钟）。血淋巴离心后将形成松散的血细胞沉淀。
注意：如需定量血淋巴，可通过测量微量离心管内的总体积，再减去蛋白酶抑制剂混合液和生理缓冲液的体积，从而计算获得的血淋巴体积。 - 小心移除上清液（无细胞血淋巴）。将细胞轻轻重悬于例如pH值调整为7.0–7.2的Leibovitz L-15培养基中。取10 µL重悬的血细胞悬液加入血球计数板，对血细胞进行计数。
7. 血细胞取样玻片制备
- 用剪刀剪下蜱虫的前肢。
- 轻轻按压蜱虫的后部体节，观察在切口处出现的透明液体小泡。
- 将血淋巴液滴直接涂于洁净的载玻片上，随后采用适当方法对细胞进行染色。
- 使用吉姆萨染色法染色血细胞时，先将载玻片上的血淋巴在空气中干燥30分钟，再于室温下用甲醇固定3分钟，然后在吉姆萨染液（与Sorensen缓冲液按1:9比例混合，pH 7.2）中室温染色30分钟。用流水冲洗载玻片以去除多余染液，自然晾干后在光学显微镜下以400倍放大观察细胞。
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结果
本文介绍了应用于蜱虫的接种及血淋巴采集方法。在蜱雌虫腿部基节与虫体之间进行接种后，过程中可能会有少量液体（血淋巴）渗出；但需要注意的是，接种完成后，针尖或接种部位均无液体或组织残留，表明真菌悬浮液已完全注入。若接种操作正确，针头插入不会导致蜱雌虫立即死亡。然而，接种昆虫病原真菌后约48小时，蜱虫会死亡。在腿部基节与蜱雌虫体壁之间进行接种可能损伤蜱的内部器官，如中肠和马氏管；而在盾板与颚体之间接种时，则可能损伤盖氏器官。
在背侧取血淋巴液过程中，若针头破坏了蜱的中肠，则所获得的液体呈红色而非无色，表明血淋巴采集操作不当。此种情况下，血淋巴应予以弃去，因其已被肠内容物污染。
正确采集血淋巴对于顺利开展实验并获得可靠结果至关重要。当从切断的蜱虫腿部采集血淋巴时（n = 20只蜱虫，重量均匀），所获得的体积低于从背侧采集法获得的总血淋巴量（...
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讨论
当研究旨在通过实验性节肢动物模型来探究病原体的体内作用时，接种病原体非常有用，因为该方法可确保病原体进入宿主体内。该技术也可用于接种RNA干扰（RNAi）等分子。在盾板与头胸之间进行接种操作相对简便，但常会损伤盖氏器官，从而影响卵的存活能力12,13。盖氏器官在解剖位置上靠近头胸部前端，对蜱类产卵具有重要作用14。因此，若研究需要观察雌蜱的生物学参数，则在雌蜱腿部基节与体壁之间进行接种更为合适，可避免损伤盖氏器官。尽管腿部基节与蜱体之间的接种方法被认为操作难度较高，且容易损伤或暴露蜱的内部器官（如中肠和马氏管），但若操作得当，则不会破坏这些器官。
血淋巴分析对于理解节肢动物免疫系统以及病原体致病机制至关重要15,16。因此，蜱虫血淋巴可用于揭示蜱虫生理学特性、确认蜱虫感染能力、研究蜱虫与病原体之间的相互...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分由巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）资助，资助编号为001。CAPES为A.F. Marciano提供了博士奖学金。感谢巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）为J. Fiorotti提供博士奖学金。本研究还获得了里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究基金会（FAPERJ）和CNPq的项目资助。V.R.E.P. Bittencourt为CNPq研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 碱性次氯酸盐溶液 | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000036 | |
| 柔性橡胶 | BD | ||
| 吉姆萨染液 | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| 玻璃毛细管 | CTechGlass | CT95-02 | |
| 胰岛素注射器（针头） | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Gibco | 11415-064 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| 显微镜载玻片 | Kasvi | K5-7105 | |
| 微量离心管 | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| 血细胞计数板 | Kasvi | K5-0111 | |
| 青霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
参考文献
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