蜱虫血淋巴的分析是研究某些病原体致病机制以及蜱虫对感染产生免疫应答的重要信息来源。本研究展示了如何将真菌繁殖体接种至饱血雌性微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）体内，并从中采集血淋巴。
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方法文章
披露用于无脊椎动物病理学研究的Metarhizium分生孢子注入微小牛蜱Rhipicephalus microplus及血淋巴采集方法
本文内容
摘要
摘要
蜱虫是专性吸血的体外寄生虫，其中微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）在兽医领域具有重要意义，因其可导致动物贫血、体重减轻、皮革品质下降，并且还可作为多种病原体的传播媒介。由于控制这些寄生虫的成本高昂、不当使用化学杀螨剂对环境造成危害，以及传统杀虫剂抗性不断增强，因此采用替代方法（例如利用昆虫病原真菌）来控制蜱虫已成为一种备受关注的策略。然而，目前极少有研究阐明蜱虫免疫系统如何应对这些昆虫病原体。因此，本实验方案介绍了两种将昆虫病原体接种至饱血雌蜱的方法，以及两种采集血淋巴和分离血细胞的技术。在雌蜱体壁腿部附着处进行病原接种，可避免损伤盖氏器官，从而更有利于评估雌蜱的生物学参数，而盾板与颚体之间的接种则常导致盖氏器官受损。从背侧采集血淋巴所获得的液体体积高于通过腿部采集的方法。蜱虫血淋巴采集与处理过程中存在若干局限性，包括：i）血细胞破裂率较高；ii）血淋巴易被破裂的中肠组织污染；iii）血淋巴回收量较低。当通过切断腿部采集血淋巴时，血淋巴需较长时间才能在腿部切口处积聚，这容易促进凝血过程的发生。此外，与背侧采集相比，腿部采集所获得的血细胞数量更少，尽管前一种方法被认为操作更为简便。深入了解由昆虫病原体介导的蜱虫免疫应答，有助于揭示其致病机制，并为开发新的蜱虫防控靶点提供依据。本文所述的接种操作所需技术资源极少，不仅可用于使蜱虫暴露于致病性微生物，也可广泛应用于其他实验条件下的研究。同样，蜱虫血淋巴的采集可作为开展多种生理学研究的第一步。
引言
牛蜱（Rhipicephalus microplus）是一种吸血性外寄生虫，对热带地区畜牧业造成巨大的负面影响。该蜱虫可传播多种病原体，如Babesia bovis、Babesia bigemina和Anaplasma marginale，加之其直接吸血造成的损害，可导致奶产量和肉产量下降、引发贫血，甚至最终导致死亡。据估计，该外寄生虫仅在巴西每年造成的经济损失达32.4亿美元1。目前亟需可持续的防控方法，而利用昆虫病原性因子被认为是一种有前景的替代策略，有助于减少化学 杀螨剂的使用2,3,4。
昆虫病原真菌，例如 Metarhizium 属真菌，是包括蜱虫在内的节肢动物的天然敌害，某些菌株可用作生物防治剂。这些病原体可通过表皮主动侵染宿主，并在其体内定植2,5,6。随着感染的发展，蜱虫免疫系统会介导细胞和体液免疫应答。已有研究报道，分析蜱虫血淋巴是评估病原体攻....
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方案
本研究所使用的蜱虫来自位于里约热内卢联邦农村大学的人工饲养种群，该研究方法已获得脊椎动物动物使用伦理委员会（CEUA-IV/UFRRJ #037/2014）的批准。
1. 蜱虫吸血后的雌性成虫
- 采集蜱虫后，用自来水清洗饱血雌蜱，并将其浸入500 mL玻璃烧杯中的0.5%（v/v）次氯酸钠溶液中3分钟，以进行体壁消毒。图1），然后使用无菌纸巾将所有雌性小鼠擦干（图2).
- 将雌性个体按体重均分为若干组（每组20只）：一组不进行任何处理，一组对照组接种5 µL 0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯水溶液（v/v），一组感染组接种5 µL浓度为1.0 × 107 芽生孢子/mL-1.
注意：仅使用未经处理的蜱虫进行体积和血细胞浓度测定。每组进行三次重复实验。
2. 在盾板与头壳之间接种病原体
注意：本研究中以昆虫病原真菌悬液为例。
- 将真菌芽生孢子悬浮于1 mL 0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯水溶液（v/v）中，并调整至终浓度为1.0 × 107 每毫升芽生孢子-1加入5 µ....
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结果
本文介绍了应用于蜱虫的接种及血淋巴采集方法。在蜱雌虫腿部基节与虫体之间进行接种后，过程中可能会有少量液体（血淋巴）渗出；但需要注意的是，接种完成后，针尖或接种部位均无液体或组织残留，表明真菌悬浮液已完全注入。若接种操作正确，针头插入不会导致蜱雌虫立即死亡。然而，接种昆虫病原真菌后约48小时，蜱虫会死亡。在腿部基节与蜱雌虫体壁之间进行接种可能损伤蜱的内部器官，如中肠和马氏管；而在盾板与颚体之间接种时，则可能损伤盖氏器官。
在背侧取血淋巴液过程中，若针头破坏了蜱的中肠，则所获得的液体呈红色而非无色，表明血淋巴采集操作不当。此种情况下，血淋巴应予以弃去，因其已被肠内容物污染。
正确采集血淋巴对于顺利开展实验并获得可靠结果至关重要。当从切断的蜱虫腿部采集血淋巴时（n = 20只蜱虫，重量均匀），所获得的体积低于从背侧采集法获得的总血淋巴量（.......
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讨论
当研究旨在通过实验性节肢动物模型来探究病原体的体内作用时，接种病原体非常有用，因为该方法可确保病原体进入宿主体内。该技术也可用于接种RNA干扰（RNAi）等分子。在盾板与头胸之间进行接种操作相对简便，但常会损伤盖氏器官，从而影响卵的存活能力12,13。盖氏器官在解剖位置上靠近头胸部前端，对蜱类产卵具有重要作用14。因此，若研究需要观察雌蜱的生物学参数，则在雌蜱腿部基节与体壁之间进行接种更为合适，可避免损伤盖氏器官。尽管腿部基节与蜱体之间的接种方法被认为操作难度较高，且容易损伤或暴露蜱的内部器官（如中肠和马氏管），但若操作得当，则不会破坏这些器官。
血淋巴分析对于理解节肢动物免疫系统以及病原体致病机制至关重要15,16。因此，蜱虫血淋巴可用于揭示蜱虫生理学特性、确认蜱虫感染能力、研究蜱虫与病原体之间的相互.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分由巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）资助，资助编号为001。CAPES为A.F. Marciano提供了博士奖学金。感谢巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）为J. Fiorotti提供博士奖学金。本研究还获得了里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究基金会（FAPERJ）和CNPq的项目资助。V.R.E.P. Bittencourt为CNPq研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 碱性次氯酸盐溶液 | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000036 | |
| 柔性橡胶 | BD | ||
| 吉姆萨染液 | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| 玻璃毛细管 | CTechGlass | CT95-02 | |
| 胰岛素注射器（针头） | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Gibco | 11415-064 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| 显微镜载玻片 | Kasvi | K5-7105 | |
| 微量离心管 | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| 血细胞计数板 | Kasvi | K5-0111 | |
| 青霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
参考文献
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon<....
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重印与许可
