一种用于分离、测序微小RNA并利用开源工具进行分析的完整流程

摘要

本文介绍了一种分步策略，用于分离小RNA、富集microRNA，并为高通量测序制备样品。随后，我们描述了如何使用开源工具对测序读长进行处理，并将其比对至microRNA序列。

摘要

据认为，所有人类转录本中有一半受到microRNA的调控。因此，定量microRNA的表达水平可以揭示疾病状态下潜在的分子机制，并提供治疗靶点和生物标志物。本文详细介绍了如何准确地定量microRNA。简而言之，该方法包括分离microRNA，将其连接至适用于高通量测序的接头，扩增最终产物，并构建样本文库。随后，我们解释如何将获得的测序读段比对到microRNA发夹结构上，进而进行定量、归一化以及差异表达分析。这一结合了实验流程与生物信息学分析的方法具有良好的通用性和稳健性，使研究人员能够从组织提取开始，最终完成microRNA的定量分析。

引言

微小RNA（microRNA）最早于1993年被发现¹，目前估计人类基因组中存在近2000种microRNA²。microRNA是一类长度通常为21–24个核苷酸的小分子非编码RNA，可在转录后水平调控基因表达，通常通过与靶基因3′非翻译区（3-UTR）中的互补位点结合，从而抑制蛋白质表达并促进mRNA降解。对microRNA进行定量分析有助于深入理解基因表达调控，目前已有多种针对microRNA的检测方法被开发出来³。

我们已开发出一种明确、可重复且经过长期验证的小RNA测序方案，并利用开源生物信息学工具对标准化测序读段进行分析。重要的是，该方案能够同时鉴定内源性microRNA以及外源导入的、可产生microRNA样分子的构建体，同时最大限度地减少比对到其他小RNA种类（包括核糖体RNA（rRNA）、tRNA来源的小RNA（tsRNA）、重复序列来源的小RNA以及mRNA降解产物）的读段数量。幸运的是，microRNA具有5'端磷酸化和3'端2-3个羟基的结构特征⁴，这一特性可用于将其与其他小RNA及mRNA降解产物区分开来。目前已有多种商业化的microRNA克隆与测序试剂盒，通常操作更快速且更易于多重检测；然而，由于试剂盒试剂具有专有性且经常更新，导致不同批次样本之间的比较变得困难。我们的策略通过丙烯酰胺和琼脂糖凝胶纯化步骤，优化了仅收集正确大小的microRNA的流程。在本方案中，我们还描述了使用开源工具将测序读段比对至microRNA的分析流程。无论使用者采用我们的文库制备方法还是商业试剂盒方法，本套操作说明对于生物信息学初学者而言都尤为实用。

本方案已在多项已发表的研究中得到应用。例如，该方案曾用于鉴定Dicer酶在茎环结构的内环上游两个核苷酸处切割小发夹RNA的机制——即所谓的"环计数规则"⁵。我们还采用这些方法鉴定由重组腺相关病毒载体（rAAVs）表达的递送小发夹RNA（shRNA）的相对丰度，以确定在出现与过量shRNA表达相关的肝毒性之前可耐受的shRNA表达阈值⁶。利用本方案，我们还鉴定了在肝脏中响应microRNA-122缺失的microRNA——microRNA-122是一种高度表达的肝特异性microRNA——同时表征了该microRNA的降解模式⁷。由于我们在大量实验中持续一致地使用该方案，能够对样本制备过程进行纵向观察，并发现不存在明显的批次效应。

分享本实验方案的目标是使用户能够利用价格合理的仪器和试剂，以及免费的生物信息学工具，在几乎任何组织或细胞系中实现高质量、可重复的microRNA定量分析。

方案

动物实验已获得华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的批准。

小RNA文库制备

1. RNA 提取

1. 使用标准RNA提取试剂或富集microRNA的试剂盒，从生物来源中提取RNA。对于组织样本，最好使用液氮速冻后在预冷的研钵中研磨成粉末的样品开始操作。
2. 使用能够定量RNA并提供RNA完整性数值（RIN）的仪器检测各样本的RNA完整性。RIN值应>7。

2. 3' 接头连接

1. 在PCR条状管中配制连接反应体系，加入以下组分：11 μL RNA（1–3 μg，每个样品使用相同量）、1.5 μL无ATP的10×T4 RNA连接酶反应缓冲液、1 μL聚乙二醇（PEG）和0.5 μL 3'-接头（100 μM通用miRNA克隆接头）。
   注意：无ATP环境有助于富集miRNA，并减少mRNA降解产物的克隆。PEG作为分子拥挤剂，可促进连接反应的成功进行。通用miRNA克隆接头具有3'端阻断基团（氨基），以防止其自身连接、环化以及与RNA在5'端发生连接。
2. 将样品置于热循环仪中，95 °C 加热 30–40 秒，随后冰上冷却 1 分钟。加入 1 μL T4 RNA 连接酶 2，室温孵育 2 小时。在样品孵育期间，制备凝胶（步骤 2.3）。
   注意：室温孵育有助于防止接头-接头连接。我们亦已成功使用 T4 RNA 连接酶 1。
3. 制备30 mL含8 M尿素的15%聚丙烯酰胺凝胶（适用于20×20 cm凝胶）：14.4 g尿素，3 mL 10×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TBE）缓冲液，11.2 mL 40% 19:1丙烯酰胺溶液，以及H₂O至30 mL。溶液在42 °C下溶解效果最佳。灌胶前立即加入150 μL 10%过硫酸铵（APS）和30 μL四甲基乙二胺（TEMED）以启动聚合。
4. 将凝胶倒入塑料模具中，置于相距0.8 mm的玻璃板之间，并插入梳子。待凝胶完全凝固（约20分钟）后，向电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，并用移液器反复吹打清洗加样孔中残留的尿素。
5. 在未加样情况下以恒定375 V预电泳25分钟，使尿素进入凝胶，然后再次清洗加样孔。
   注意：根据所使用的电源和电泳系统的类型，可能需要降低电压值。
6. 样品完成连接后，向样品中加入15 μL丙烯酰胺上样缓冲液（体积比1:1），然后在PCR仪中95 °C变性5分钟。
7. 制备浓度为 25 ng/μL 的 37 和 44 bp 大小标记物，用一份丙烯酰胺上样缓冲液稀释。序列列于 表1.
8. 将样品上样至聚丙烯酰胺凝胶，每个样品之间至少留出一个空泳道。以不对称模式加载至少两组分子量标记物，每组20 μL，以便追踪凝胶方向。
9. 以恒定的375 V电压电泳15分钟，然后将电压提高至恒定的425 V继续电泳至结束。电泳至溴酚蓝距底部约1–4 cm处，耗时约2小时。
   注意：如有必要，可降低恒定电压并延长电泳时间，直至溴酚蓝迁移至距底部约1-4 cm处。
10. 使用玻璃板分离器将凝胶从玻璃板上取下，并将凝胶置于塑料文件保护袋上。将5 μL溴化乙锭溶于500 μL蒸馏水中，用移液器将其加入位于顶部浅蓝色标记带上方的加样孔中（参见 图1A).
    注意：使用溴化乙锭时需戴手套，并根据当地规定处理废弃物。静置5分钟。
11. 在紫外光（UV）下，使用洁净的刀片从每条泳道的上端标记到下端标记切下凝胶（参见 图1A). 转移至一块 4 × 4 cm 的实验室封膜上，然后将凝胶横向切割约 4 刀、纵向切割约 3 刀，得到 12 个小方块（参见 图1B).
12. 用移液器将 400 μL 0.3 M NaCl 滴加到密封膜方块上，并将凝胶碎片转移至 1.5 mL 硅化管中（参见 图1C在4 °C下于旋转摇床中孵育样品过夜。
    注意：其他低吸附的1.5 mL离心管可替代硅化处理的离心管。
13. 在 4 °C 下振荡至少 12 小时后，取出样品并置于冰上，同时准备一管 100% 乙醇。
14. 转移400 μL上清液至新离心管中，加入1 mL 100%乙醇和1 μL 15 mg/mL糖原共沉淀剂。尽可能收集全部上清液，必要时在4 °C离心后再次吸出残留液体。置于-80 °C 1小时，或-20 °C 2小时或更长时间。糖原共沉淀剂有助于提高沉淀物的可见性和回收率。
15. 在 4 °C 下以 17,000 x g 离心 g 静置20-30分钟。彻底去除乙醇残留，将沉淀物室温晾干5分钟。

3. 5' 连接子连接

1. 用移液器加入6.5 μL无核酸酶水重悬沉淀。先让沉淀在水中静置几分钟有助于重悬。
2. 离心收集沉淀并用水重悬后，加入0.5 μL 100 μM 5'-接头（含条形码；见表1）、1 μL T4 RNA连接酶缓冲液、1 μL 10 mM ATP和1 μL PEG。90 °C加热30秒，然后置于冰上。加入1 μL T4 RNA连接酶1，室温孵育2小时。
3. 加入400 μL 0.3 M NaCl，随后加入400 μL酸性酚/氯仿。涡旋振荡30秒至1分钟（溶液将呈现浑浊），然后在4 °C下以最大速度（约17,000 × g）离心10–15分钟。吸取上层液体转移至新的1.5 mL离心管中。
   注意：避免吸取下层液体。
4. 加入350 μL氯仿，短暂涡旋，然后在4 °C下以最大速度（约17,000 × g）离心10分钟。吸取上层液体转移至新的1.5 mL离心管中。加入1.5 μL糖原共沉淀剂和1 mL 100%乙醇。
   注意：同样避免吸取下层液体。
5. 短暂涡旋后，置于-80 °C至少1小时，或-20 °C过夜。

4. 逆转录（RT）

1. 开启42 °C加热模块。将样品在4 °C、约17,000 × g 条件下离心20–30分钟。彻底去除上清液，让沉淀在空气中干燥5分钟。
2. 将沉淀样品重悬于8.25 μL无核酸酶水中，然后加入：0.5 μL 100 μM的RT引物（表1）以及5 μL cDNA合成试剂盒中的2× RT反应混合液。在42 °C孵育3分钟。
3. 向每个样品中加入1.5 μL 10× RT酶，在PCR仪中于42 °C孵育30分钟。孵育结束后，置于-20 °C保存或直接进行水解与中和步骤。
   注意：步骤4.2和4.3可使用多种逆转录（RT）试剂盒。
4. 进行碱性水解与中和：配制1 mL 150 mM氢氧化钾（KOH）溶液（含150 μL 1 M KOH、20 μL 1 M Tris碱溶液（pH 7.5）和830 μL H₂O），以及1 mL 150 mM盐酸（HCl）溶液（含150 μL 1 M HCl和850 μL H₂O）。
5. 在加入样品前，确定中和KOH溶液所需的HCl体积。通常，约20–24 μL HCl可中和25 μL KOH溶液。使用pH试纸检测混合液，确保pH值处于合适范围（pH 7.0至9.5）。
6. 向样品中加入25 μL 150 mM KOH溶液，于95 °C孵育10分钟以进行水解。
7. 向样品中加入步骤4.4中确定的150 mM HCl体积，使最终样品pH值介于7.0至9.5之间，完成中和。

5. PCR 扩增

1. 中和后，准备PCR反应：29.5 μL 水、5 μL 10x Taq 缓冲液、1 μL dNTP、2 μL 25 μM 正向引物（表1）、2 μL 25 μM 反向引物（表1）、0.5 μL Taq 酶，以及 10 μL 来自步骤 4.6 的反转录 cDNA。
2. 进行以下PCR反应：94 °C 预变性 2 分钟，然后进行 20 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 45 秒、50 °C 退火 75 秒、72 °C 延伸 60 秒。
3. 使用步骤 5.2 中 PCR 产物的 5 μL 进行第二次 PCR 反应，再进行约 2–4 个循环。反应体系如下：34.8 μL 水、5 μL 10x Taq 缓冲液、1 μL dNTP、1 μL 25 μM 正向引物（表1）、1 μL 25 μM 反向引物（表1），以及 0.2 μL Taq DNA 聚合酶。热循环参数与步骤 5.2 中所述相同。
   注意：进行两次 PCR 反应（第一次 20 个循环，第二次仅增加 2–4 个循环）的目的是确保扩增的 cDNA 量处于动态范围之内（即未达到饱和水平）。

6. 琼脂糖凝胶纯化

1. 使用低熔点琼脂糖制备4%琼脂糖凝胶。将40 μL或更多的PCR产物与上样染料一同上样至凝胶中，并同时加载100 bp和25 bp的DNA大小标记物。
   注意：25 bp的DNA ladder有助于区分扩增产物与接头-接头连接产物。低熔点琼脂糖凝胶的制备需比常规琼脂糖凝胶更加小心，应严格遵循制造商提供的说明。
2. 进行凝胶回收时，选择在凝胶上可见但未饱和的循环数（通常为22–24个循环）。若同时运行多个样品，应选择条带强度相近的条带。
3. 切取位于125 bp条带上方的条带（即25 bp ladder中较深的条带；参见图1D）。使用凝胶回收试剂盒，根据4%凝胶的条件按照制造商说明加入相应的缓冲液，然后在室温下振荡以溶解琼脂糖。
   注意：在55 °C下溶解会增加接头-接头连接的可能性。
4. 按照制造商提供的凝胶回收说明操作，用30 μL洗脱缓冲液或水进行洗脱。如果凝胶上产物信号较弱，可将洗脱体积减少至20 μL。
5. 采用高灵敏度方法测定cDNA浓度，并准备用于测序的样本文库。文库制备的具体步骤取决于所使用的测序类型。
   注意：测序文库的最低要求通常为10 μL、10 μM的产物。若浓度过低，可将样品合并后进行乙醇沉淀，以达到所需的文库浓度。
6. 使用现有设备对样品进行测序。常见示例为使用支持50 bp单端读长的试剂盒进行测序，获得约1500万至2500万条测序读长，输出格式为FASTQ。

小RNA序列比对与生物信息学分析

7. 数据上传

1. 下载每次测序运行生成的 FASTQ 文件。从 miRbase.org 下载 microRNA 发夹序列列表^8,9,10。
2. 在 www.usegalaxy.org 注册 Galaxy 账户，并将序列读段的 FASTQ 文件上传至该账户。
3. 将条形码序列的文本文件（例如作为文本文件提供的 barcodes.txt）上传至 Galaxy 账户（见补充表 1）。
4. 从 miRBase.org 等数据库将 microRNA 发夹序列的 FASTA 文件上传至 Galaxy 账户。小鼠（mousehairpins.fa）和人（humanhairpins.fa）microRNA 前体示例分别见补充表 2和补充表 3。

8. 接头去除、条形码分选和修剪

1. 在左侧标签页中，导航至 基因组文件操作 > FASTA/FASTQ > 剪切接头序列。
2. 在FASTA 或 FASTQ 格式的输入文件中，从下拉列表中选择 FASTQ 文件。将最小序列长度更改为 18。将来源更改为输入自定义序列。输入CTGTAGGC。保留所有其他默认参数。点击执行。
   注意：短于 18 个核苷酸的序列读段难以唯一比对到 microRNA，且通常包含大量降解产物。
3. 在左侧标签页中，导航至基因组文件操作 > FASTA/FASTQ > 条形码拆分器。
   注意：Galaxy 功能和标题会定期更新，因此可能需要使用搜索功能来查找等效工具或其位置。使用索引引物的商业试剂盒通常已按条形码分好类，因此如果起始材料为商业试剂盒，则此步骤及条形码剪切步骤均非必需。
4. 对于使用的条形码，选择barcodes.txt文件。对于待拆分文库，使用上一步生成的剪切后的数据文件。在允许的错配数中输入1。点击执行。
5. 剪切前 4 个核苷酸：导航至文本操作 > 剪切首尾字符。对于输入数据集，点击文件夹图标，该图标代表一个数据集集合。选择包含标签条形码拆分器处理的数据的样本批量文件。在从开头剪切至该位置中输入5。在输入数据集是否为 FASTQ 格式？中选择是。点击执行。执行过程可能需要数分钟。

9. 将测序读段比对至微小RNA

1. 在 Galaxy 中，导航至 基因组学分析 > RNA-Seq > Sailfish 转录本定量¹¹。
2. 对于问题从历史记录中选择参考转录组，或使用内置索引？，选择使用历史记录中的一个。在下拉列表中输入已上传的文件 mousehairpins.fa。在 FASTA/Q 文件中，点击文件夹图标以使用数据集集合，并选择包含对集合进行修剪的文件。点击执行。执行过程可能需要数分钟。
3. 在右侧的历史记录标签页中，点击Sailfish 对集合的分析…，该列表包含 19 个项目。逐个点击每个单独文件，并点击磁盘图标将其保存到本地计算机。单独下载的文件首先需要解压缩，且可能需要重新保存为 .txt 扩展名，以便导入电子表格。
4. 打开每个电子表格文件，将NumReads列重命名为对应的处理条件。将各列合并，生成一个矩阵，其中第一列为 microRNA，后续各列为各处理条件下的读段数。
5. 为计算每个处理条件下差异表达的 microRNA，使用原始 microRNA 读段数文件作为输入，导入如 DESeq2¹² 等程序。DESeq2 在 Galaxy 中位于基因组学分析 > RNA-seq > DESeq2 标签页中。
6. 将原始读段数转换为标准化的 microRNA 读段数。通过以下计算，将读段数根据文库的测序深度进行标准化：[(原始读段数 / microRNA 总读段数) × (1,000,000 – 被计数的 microRNA 数量) + 1]。
   注：该计算可得到标准化的每百万映射 microRNA 读段数（RPM），可用于不同数据集和生物学条件间的比较。输出为制表符分隔的文件。Sailfish 提供了tpm输出列，但该值根据 microRNA 发夹结构长度进行了标准化，在本情境中无需使用。
7. 如有需要，可使用自定义输入序列（例如载体序列）重复比对，以鉴定映射到递送载体（如 shRNA）的读段。

结果

文库构建步骤示意图
小RNA提取、测序及比对的整体流程示意图见图2。
采集一只雄性与一只雌性小鼠的肝脏样本，并立即在液氮中速冻。提取总RNA，并对其质量和浓度进行评估。

小RNA测序可获得足量用于测序的RNA
以两次独立RNA提取所得的各3 μg RNA作为小RNA测序的起始材料。将样品在丙烯酰胺凝胶上电泳，并根据对应于17–28 nt RNA的大小标记之间进行切胶回收（图1A）。将凝胶切成小片段以进行RNA提取（图1B），随后转移至低吸附性的1.5 mL离心管中（图1C）。将条形码bc7和bc17（表1

讨论

尽管microRNA在20多年前已被发现¹³，microRNA测序过程仍然繁琐，且需要专用设备，这阻碍了实验室常规采用内部实验方案¹⁴。其他技术可同时检测microRNA，例如microRNA微阵列和多重表达检测面板；然而，这些方法存在局限性，仅能定量其探针集合中包含的microRNA。因此，它们无法获得小RNA测序的重要优势，例如新microRNA的鉴定以及microRNA异构体（可能具有重要生物学功能的核苷酸变异形式）的发现^6,7,15。

在启动新实验时，使用商业供应商的产品通常最为简便，因为它们提供技术支持且易于使用。目前市面上有多种可用于 microRNA 测序的商业产品，这些产品支持多重测序，从而在处理大量样本（>100）时减轻工作负担。这些商业试剂盒在持续改进中，这既是优势也是劣势。一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 bp DNA 标准分子量标记	NEB	N3231
19:1 双丙烯酰胺	Millipore Sigma	A9926
25 bp DNA 阶梯分子量标记	Promega	G4511
酸性酚/氯仿	ThermoFisher	AM9720
丙烯酰胺 RNA 上样染料	ThermoFisher	R0641
过硫酸铵（APS）	Biorad	161-0700
Bioanalyzer 仪器	Agilent	G2991AA	用于评估 RNA 质量和浓度
氯仿	Fisher Scientific	C298-500
乙醇（100%）	Sigma	E7023
Gel Loading Buffer II	ThermoFisher	AM8547
GlycoBlue	ThermoFisher	AM9516	蓝色有助于观察沉淀
HCl	Sigma	320331
KOH	Sigma	P5958
Maxi Vertical Gel Box 20 × 20 cm	Genesee	45-109
miRVana microRNA 提取试剂盒	ThermoFisher	AM1560
miSeq 系统	Illumina	SY-410-1003	用于生成小 RNA 测序数据
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Nusieve 低熔点琼脂糖	Lonza	50081
Parafilm（实验室封口膜）	Millipore Sigma	P7793
聚乙二醇 8000	NEB	包含于 M0204 中
ProtoScript II 第一链 cDNA 合成试剂盒	NEB	E6560S
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
Qubit 荧光计	ThermoFisher	Q33226	用于定量 DNA 浓度
Qubit RNA HS 检测试剂盒	ThermoFisher	Q32855
剃刀刀片	Fisher Scientific	12640
硅化低吸附 1.5 ml 离心管	Fisher Scientific	02-681-331
T4 RNA 连接酶 1	NEB	M0204
T4 RNA 连接酶 2，截短型 K227Q	NEB	M0351S
TapeStation	Agilent	G2939BA	用于评估 RNA 质量和浓度
Taq DNA 聚合酶	NEB	M0273X
TEMED	Biorad	161-0800
Tris 碱 pH 7.5	Sigma	10708976001
Tris-EDTA 缓冲液	Sigma	T9285
Trizol	ThermoFisher	15596026
UltraPure 溴化乙锭（10 mg/ml）	Invitrogen	15585-011
通用 miRNA 克隆接头	NEB	S1315S
尿素	Sigma	U5378