一种用于分离、测序微小RNA并利用开源工具进行分析的完整流程

摘要

本文介绍了一种分步策略，用于分离小RNA、富集microRNA，并为高通量测序制备样品。随后，我们描述了如何使用开源工具对测序读长进行处理，并将其比对至microRNA序列。

摘要

据认为，所有人类转录本中有一半受到microRNA的调控。因此，定量microRNA的表达水平可以揭示疾病状态下潜在的分子机制，并提供治疗靶点和生物标志物。本文详细介绍了如何准确地定量microRNA。简而言之，该方法包括分离microRNA，将其连接至适用于高通量测序的接头，扩增最终产物，并构建样本文库。随后，我们解释如何将获得的测序读段比对到microRNA发夹结构上，进而进行定量、归一化以及差异表达分析。这一结合了实验流程与生物信息学分析的方法具有良好的通用性和稳健性，使研究人员能够从组织提取开始，最终完成microRNA的定量分析。

引言

微小RNA（microRNA）最早于1993年被发现¹，目前估计人类基因组中存在近2000种microRNA²。microRNA是一类长度通常为21–24个核苷酸的小分子非编码RNA，可在转录后水平调控基因表达，通常通过与靶基因3′非翻译区（3-UTR）中的互补位点结合，从而抑制蛋白质表达并促进mRNA降解。对microRNA进行定量分析有助于深入理解基因表达调控，目前已有多种针对microRNA的检测方法被开发出来³。

我们已开发出一种明确、可重复且经过长期验证的小RNA测序方案，并利用开源生物信息学工具对标准化测序读段进行分析。重要的是，该方案能够同时鉴定内源性microRNA以及外源导入的、可产生microRNA样分子的构建体，同时最大限度地减少比对到其他小RNA种类（包括核糖体RNA（rRNA）、tRNA来源的小RNA（tsRNA）、重复序列来源的小RNA以及mRNA降解产物）的读段数量。幸运的是，microRNA具有5'端磷酸化和3'端2-3个羟基的结构特征⁴，这一特性可用于将其与其他小RNA及mRNA降解产物区分开来。目前已有多种商业化的microRNA克隆与测序试剂盒，通常操作更快速且更易于多重检测；然而，由于试剂盒试剂具有专有性且经常更新，导致不同批次样本之间的比较变得困....

方案

动物实验已获得华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的批准。

小RNA文库制备

1. RNA 提取

1. 使用标准RNA提取试剂或富集microRNA的试剂盒，从生物来源中提取RNA。对于组织样本，最好使用液氮速冻后在预冷的研钵中研磨成粉末的样品开始操作。
2. 使用能够定量RNA并提供RNA完整性数值（RIN）的仪器检测各样本的RNA完整性。RIN值应>7。

2. 3' 接头连接

1. 在PCR条状管中配制连接反应体系，加入以下组分：11 μL RNA（1–3 μg，每个样品使用相同量）、1.5 μL无ATP的10×T4 RNA连接酶反应缓冲液、1 μL聚乙二醇（PEG）和0.5 μL 3'-接头（100 μM通用miRNA克隆接头）。
   注意：无ATP环境有助于富集miRNA，并减少mRNA降解产物的克隆。PEG作为分子拥挤剂，可促进连接反应的成功进行。通用miRNA克隆接头具有3'端阻断基团（氨基），以防止其自身连接、环化以及与RNA在5'端发生连接。
2. 将样品置于热循环仪中，95 °C 加热 30–40 秒，随后冰上冷却 1 分钟。加入 1 μL T4 RNA 连接酶 2，室温孵育 2 小时。在样品....

结果

文库构建过程中各步骤的示意图
小RNA提取、测序及比对的整体示意图如下所示。 图2.
从一只雄性小鼠和一只雌性小鼠采集肝脏样本，并在液氮中速冻。提取总RNA，并对其质量和浓度进行评估。

小RNA测序可获得足量用于测序的RNA
以两次独立RNA提取所得的3 μg RNA作为小RNA测序的起始材料。将样品在丙烯酰胺凝胶上电泳，并根据对应于17–28 nt RNA的大小标记之间切胶回收（图1A）。将凝胶条切割成小片段用于RNA提取（图1B），随后转移至低吸附性1.5 mL离心管中（图1C）。将条形码bc7和bc17（.......

讨论

尽管microRNA在20多年前已被发现¹³，microRNA测序过程仍然繁琐，且需要专用设备，这阻碍了实验室常规采用内部实验方案¹⁴。其他技术可同时检测microRNA，例如microRNA微阵列和多重表达检测面板；然而，这些方法存在局限性，仅能定量其探针集合中包含的microRNA。因此，它们无法获得小RNA测序的重要优势，例如新microRNA的鉴定以及microRNA异构体（可能具有重要生物学功能的核苷酸变异形式）的发现^6,7,15。

在启动新实验时，使用商业供应商的产品通常最为简便，因为它们提供技术支持且易于使用。目前市面上有多种可用于 microRNA 测序的商业产品，这些产品支持多重测序，从而在处理大量样本（>100）时减轻工作负担。这些商业试剂盒在持续改进中，这既是优势也是劣势。一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 bp DNA 标准分子量标记	NEB	N3231
19:1 双丙烯酰胺	Millipore Sigma	A9926
25 bp DNA 阶梯分子量标记	Promega	G4511
酸性酚/氯仿	ThermoFisher	AM9720
丙烯酰胺 RNA 上样染料	ThermoFisher	R0641
过硫酸铵（APS）	Biorad	161-0700
Bioanalyzer 仪器	Agilent	G2991AA	用于评估 RNA 质量和浓度
氯仿	Fisher Scientific	C298-500
乙醇（100%）	Sigma	E7023
Gel Loading Buffer II	ThermoFisher	AM8547
GlycoBlue	ThermoFisher	AM9516	蓝色有助于观察沉淀
HCl	Sigma	320331
KOH	Sigma	P5958
Maxi Vertical Gel Box 20 × 20 cm	Genesee	45-109
miRVana microRNA 提取试剂盒	ThermoFisher	AM1560
miSeq 系统	Illumina	SY-410-1003	用于生成小 RNA 测序数据
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Nusieve 低熔点琼脂糖	Lonza	50081
Parafilm（实验室封口膜）	Millipore Sigma	P7793
聚乙二醇 8000	NEB	包含于 M0204 中
ProtoScript II 第一链 cDNA 合成试剂盒	NEB	E6560S
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
Qubit 荧光计	ThermoFisher	Q33226	用于定量 DNA 浓度
Qubit RNA HS 检测试剂盒	ThermoFisher	Q32855
剃刀刀片	Fisher Scientific	12640
硅化低吸附 1.5 ml 离心管	Fisher Scientific	02-681-331
T4 RNA 连接酶 1	NEB	M0204
T4 RNA 连接酶 2，截短型 K227Q	NEB	M0351S
TapeStation	Agilent	G2939BA	用于评估 RNA 质量和浓度
Taq DNA 聚合酶	NEB	M0273X
TEMED	Biorad	161-0800
Tris 碱 pH 7.5	Sigma	10708976001
Tris-EDTA 缓冲液	Sigma	T9285
Trizol	ThermoFisher	15596026
UltraPure 溴化乙锭（10 mg/ml）	Invitrogen	15585-011
通用 miRNA 克隆接头	NEB	S1315S
尿素	Sigma	U5378