荧光标记细菌作为示踪剂揭示水生生态系统中有机碳流动的新途径

摘要

本文介绍了一种基于单细胞落射荧光显微镜技术的实验方案，可高精度、高分类分辨率地定量测定水生真核捕食生物的摄食速率。

摘要

阐明营养相互作用（如捕食及其影响）是许多生态学研究人员的常见任务。微生物群落的研究存在诸多局限性，确定捕食者、猎物及捕食速率往往十分困难。本文介绍了一种优化方法，该方法基于添加荧光标记的猎物作为示踪剂，可对水生真核捕食者的摄食速率进行可靠定量，并估算营养物质向更高营养级的转移情况。

引言

异养原核生物是水生系统中的关键生物组分，占浮游生物生物量的显著比例^1,2,3。控制其丰度、多样性和活性的因素对于理解其在生物地球化学循环中的作用至关重要（即有机碳和其他营养物质的去向，以及能量从原核生物向更高营养级的传递）。原生动物的摄食是其中一个重要因素。异养纳米鞭毛虫和纤毛虫对细菌的摄食 对原核生物的丰度、群落功能、结构、多样性，甚至特定细菌类群的细胞形态和生长速率产生强烈的自上而下控制作用^4,5,6。在某些系统中，原生生物是细菌死亡的主要原因^6,7。

目前用于评估原生动物细菌摄食作用的标准方法已使用了一段时间，该方法涉及使用荧光标记的细菌（FLB）作为猎物类似物，并结合落射荧光显微镜技术。通过在选定的时间段内定量原生生物食物泡中被标记的猎物颗粒数量，可确定细胞特异性的摄食速率⁸。该方法具有多个优势：示踪剂被加入含有天然捕食者和猎....

方案

1. 样品采集

1. 水库水样的采集：第一个案例研究（实验 I；自然原位捕食者和猎物丰度较低的系统）
   1. 从目标地点在适宜深度采集水样。将样品置于温度可控的冷藏箱中，箱内温度维持在现场温度（避免温度骤变；需注意原生生物的吸收速率具有温度依赖性），并在该条件下运送至实验室。
      注意：我们的采样在中度富营养化的峡谷状日莫夫水库（南波希米亚，容积 34.5 x 10⁶ m³最大深度43米，平均滞留时间100天，属双季混合型湖泊。采样点位于靠近大坝的30米水深处。使用2升弗里丁格采样器在0.5米水深采集混合水样。
   2. 尽快进入第1.2节。
2. 从食虫植物Utricularia reflexa的捕虫囊中收集液体： 第二个案例研究（Exp II；捕食者和猎物丰度均较高的系统，样本体积极小）
   1. 轻轻摇晃水中的植物，从培养容器中取出，置于吸水材料上以吸收多余水分。根据植物的强健程度和捕虫器的大小，选取8-10株植物个体。
   2. 通过计数带有捕虫器官的叶节，将每根茎分成大致相等的部分。每个茎段将用于采集代表幼年、中年和老年捕虫器的混合样品。
   3. 将一根细玻璃毛细管和一个Eppendorf管连接至蠕动泵用于样品收集。随后将毛细管尖端插入陷阱开口中，利用真空泵抽吸每个陷阱中的....

结果

示例实验 I 在捷克南波希米亚的Římov水库进行，该水库是一个天然水体，其中天然原位捕食者和猎物的丰度较低。文中报告了杂食性纤毛虫Halteria grandinella的代表性数据，该物种是广泛存在且高效摄食微小型浮游生物（<2 µm）颗粒的纤毛虫^{10,16,17,18,22}。图3展示了来自Římov水库的Halteria sp. 每个细胞所摄取FLB数量的箱线图（图3A），并将其换算为每小时细菌摄食速率（图3.......

讨论

解析水生系统中的营养级相互作用一直具有挑战性²⁸，尤其是在涉及原生生物及其猎物——细菌的纳米级浮游生物尺度上。当研究涉及营养吸收途径及其定量时，由于生物相互作用的高度复杂性，原本在较高营养级中成功应用的方法（例如稳定同位素标记法）往往难以适用。本实验方案展示了利用落射荧光显微镜结合荧光标记细菌作为示踪剂的优势，可用于追踪并半定量/估算碳流（细菌猎物：多种原生生物摄食者，包括混合营养型摄食者²⁹）在微生物食物网基础环节的传递路径。该方法的优势之一在于单细胞水平的高准确性，另一优势则在于能够以前所未有的分辨率解析摄食者群落结构，并区分不同的功能类群、物种（实验I），甚至同一物种的不同亚群（实验II）。

实验方案中的关键步骤
本方案中有若干关键步骤，可确保该方法的优势得到充分发挥。首先，在实验开始前对研究环境有基本了解总是有益的。这包括对环境中潜在的摄食者种类与丰度、细菌猎物的大小以及猎物分布进行显微观察，具体包括两个方面：1）水体中的垂直分布（例如，从表水层到深.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2-µm 孔径滤膜	SPI 供应，https://www.2spi.com/	B0225-MB	黑色聚碳酸酯核孔膜滤膜，直径需与所用过滤装置匹配
5-(4,6-二氯-2-三嗪基)氨基荧光素（DTAF）	任何品牌
可调体积移液器	任何品牌，各种规格
离心	22 000 × g
冻存管	任意品牌，2 mL 规格
DAPI（4´,6-二氨基-2´-苯基吲哚二盐酸盐	任何品牌		1 mg ml-1
落射荧光显微镜	400 倍至 1000 倍的放大倍数
	适用于观察 DAPI 和 DTAF 范围的滤光片
	目镜中的计数网格
过滤装置	通常直径为25 mm
甲醛	显微镜品牌
戊二醛	显微镜品牌
显微镜用浸油	低荧光特异性油
Lugol´s溶液	任何品牌或参见评论		配制碱性Lugol溶液，步骤如下：溶液1——溶解  10 g 碘化钾溶于 20 ml 去离子水，然后加入 5 g 碘。溶液 2 — 加入 5 g 醋酸钠  加入50 ml超纯水中。将溶液2加入溶液1中，并充分混匀。
甲醇稳定的福尔马林	任何可用于显微镜观察的品牌
显微镜载玻片和盖玻片	任何用于显微镜观察的品牌
用于稀释样品的MQ水	任何品牌
磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH = 9）	任何品牌		0.05 M Na2高倍物镜4- 氯化钠溶液，调节至 pH 9
PPi-生理盐水缓冲液	任何品牌		0.02 M Na4P2O7- NaCl 溶液。加入 0.53 g Na4P2O7 至 100 ml 去离子水，加入 0.85 g NaCl
采样装置	适用于获取代表性样本		例如用于湖泊浮游生物的弗里丁格采样器
硫代硫酸钠溶液	任何品牌		3% 溶液用于本方案
超声波破碎仪	任何品牌		30 W
涡旋	任何品牌允许  溶质与样品的充分混匀
水浴锅	任何可将温度维持在60的品 °C