本文介绍了一种基于单细胞落射荧光显微镜技术的实验方案，可高精度、高分类分辨率地定量测定水生真核捕食生物的摄食速率。
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摘要
摘要
阐明营养相互作用（如捕食及其影响）是许多生态学研究人员的常见任务。微生物群落的研究存在诸多局限性，确定捕食者、猎物及捕食速率往往十分困难。本文介绍了一种优化方法，该方法基于添加荧光标记的猎物作为示踪剂，可对水生真核捕食者的摄食速率进行可靠定量，并估算营养物质向更高营养级的转移情况。
引言
异养原核生物是水生系统中的关键生物组分，占浮游生物生物量的显著比例1,2,3。控制其丰度、多样性和活性的因素对于理解其在生物地球化学循环中的作用至关重要（即有机碳和其他营养物质的去向，以及能量从原核生物向更高营养级的传递）。原生动物的摄食是其中一个重要因素。异养纳米鞭毛虫和纤毛虫对细菌的摄食 对原核生物的丰度、群落功能、结构、多样性，甚至特定细菌类群的细胞形态和生长速率产生强烈的自上而下控制作用4,5,6。在某些系统中，原生生物是细菌死亡的主要原因6,7。
目前用于评估原生动物细菌摄食作用的标准方法已使用了一段时间，该方法涉及使用荧光标记的细菌（FLB）作为猎物类似物，并结合落射荧光显微镜技术。通过在选定的时间段内定量原生生物食物泡中被标记的猎物颗粒数量，可确定细胞特异性的摄食速率8。该方法具有多个优势：示踪剂被加入含有天然捕食者和猎物群落的自然样品中；在孵育前对样品的操作最少，添加的FLB示踪剂对样品的干扰最小，且孵育时间较短，从而确保在接近原位条件下获得可靠结果。另外，在以细菌摄食性原生生物或浮游动物数量较少的环境（例如远海海洋系统）中，可通过流式细胞术检测在长期（12–24小时）孵育实验中以低浓度（2%–3%示踪剂）添加至样品中的FLB的消失速率。随后，通过流式细胞术定量孵育开始和结束时FLB的数量（整合所有细菌摄食者的总体影响）（具体方法详见先前发表的研究9）。然而，该参数仅反映总的综合细菌摄食速率，无法直接归因于特定的原生生物或浮游动物摄食类群或物种。
总体而言，准确且具有生态学意义地量化水生环境中原生生物物种或形态型特异性的细菌死亡率具有挑战性。一些原生生物具有选择性摄食行为，而添加的荧光标记细菌（FLB）示踪剂的大小和细胞形态可能扭曲其自然摄食率10,11。此外，原生生物的活性和代谢对温度高度敏感12；因此，针对每种特定样品类型，所添加FLB示踪剂的用量必须谨慎调控（不仅需依据细菌的自然丰度、大小和形态，以及主要存在的噬菌性原生生物类型，还需考虑温度因素）。大多数研究集中于原生生物群体的整体摄食活性；然而，特定原生生物物种的噬菌行为通常具有更高的信息价值，可能更值得研究。在此情况下，需要了解样品中存在原生生物物种的分类学知识及其行为特征。因此，要获得归因于某一特定原生生物类群或物种的种特异性噬菌速率的可靠结果，往往需要投入大量时间和人力。
尽管存在这些困难，该方法仍是目前在自然环境中评估原生生物噬菌性的最适宜工具。本文介绍了一种在水生微生物生态学研究中使用荧光标记细菌（FLB）作为示踪剂的全面且易于遵循的方法。文中充分考虑了该方法所涉及的各种问题，并描述了改进后的实验流程，同时以两个来自不同环境及不同纤毛虫物种的实验作为示例。
第一项案例研究是在捷克共和国中营养水平的日莫夫水库（Římov water reservoir）的表水层环境中进行的，该环境中的食草生物和细菌丰度与大多数地表淡水水体相似（参见5,7）。第二项案例研究则在水生食虫植物 Utricularia reflexa 捕虫囊内的高度特化环境中开展，该环境含有极高数量的以混合营养方式摄食的纤毛虫（Tetrahymena utriculariae）以及细菌细胞。文中展示了在这两类样品中测定的细胞特异性摄食速率和细菌现存量的计算方法。随后讨论了结果的多种生态学解释，并最后提出了若干可能的后续研究方向。
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方案
1. 样品采集
- 水库水样的采集：第一个案例研究（实验 I；自然原位捕食者和猎物丰度较低的系统）
- 从目标地点在适宜深度采集水样。将样品置于温度可控的冷藏箱中，箱内温度维持在现场温度（避免温度骤变；需注意原生生物的吸收速率具有温度依赖性），并在该条件下运送至实验室。
注意：我们的采样在中度富营养化的峡谷状日莫夫水库（南波希米亚，容积 34.5 x 106 m3最大深度43米，平均滞留时间100天，属双季混合型湖泊。采样点位于靠近大坝的30米水深处。使用2升弗里丁格采样器在0.5米水深采集混合水样。 - 尽快进入第1.2节。
- 从目标地点在适宜深度采集水样。将样品置于温度可控的冷藏箱中，箱内温度维持在现场温度（避免温度骤变；需注意原生生物的吸收速率具有温度依赖性），并在该条件下运送至实验室。
- 从食虫植物Utricularia reflexa的捕虫囊中收集液体： 第二个案例研究（Exp II；捕食者和猎物丰度均较高的系统，样本体积极小）
- 轻轻摇晃水中的植物，从培养容器中取出，置于吸水材料上以吸收多余水分。根据植物的强健程度和捕虫器的大小，选取8-10株植物个体。
- 通过计数带有捕虫器官的叶节，将每根茎分成大致相等的部分。每个茎段将用于采集代表幼年、中年和老年捕虫器的混合样品。
- 将一根细玻璃毛细管和一个Eppendorf管连接至蠕动泵用于样品收集。随后将毛细管尖端插入陷阱开口中，利用真空泵抽吸每个陷阱中的全部液体，直至剩余900 ± 100 µ每个陷阱年龄类别的陷阱液收集 L。
- 使用200的三个重复子样本 µ用于原生生物摄食实验的混合捕集液的L。立即按照第3节所述步骤处理。保存剩余部分 ±300 µ用于所有其他微生物组分（存在于液体中）分析的样品，具体如下（第2节）。
- 立即进入第2节。
2. 样品采集后的固定
- 实验 I 和 II：用甲醛固定水样或捕获液亚样品（分别约为 20 mL 和 0.3 mL），用于细菌计数（第 4 节），终浓度为 2%（体积比），固定时间至少 1 小时。
注意：操作甲醛时必须在通风橱中进行，且处理样品时应始终佩戴手套。
3. 样品过滤
- 样品稀释（实验 I）：水库水样无需稀释。（实验 II）：用无颗粒的超纯水将捕获液样品稀释10–100倍，以便在通过落射荧光显微镜计数前，使目标微生物在滤膜表面分布适宜。
- 使用过滤漏斗（直径25 mm），将1–2 mL（实验 I）水库水样或10–30 μL（实验 II）捕获液的分样过滤至黑色、孔径0.2 µm的滤膜上，用于细菌计数。
- 用DAPI（4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐，终浓度0.2%）染色滤膜4分钟。
注意：避免皮肤和操作表面污染，需佩戴手套。 - 将富集了微生物的滤膜置于载玻片上的一滴镜油（用于荧光显微镜观察）中。在滤膜中央再加一滴镜油，然后盖上盖玻片，确保镜油均匀分布。
- 此时，建议立即处理样品；或者，也可将样品在-20 °C冰箱中冷冻保存数周至数月，待后续分析。
4. 滤膜上细菌数量的计数
- 将载玻片置于落射荧光显微镜下（使用对应于DAPI荧光染料的滤光片组），并在其中一个目镜中放入10 × 10计数网格。将载玻片移动至一个随机位置。
- 在计数网格区域内（1000倍放大下）定量细菌细胞（蓝色荧光）。计数时包括跨越计数网格左侧和上侧边缘的细胞，而排除跨越右侧和下侧边缘的细胞。
- 移动至另一个随机位置，并在至少10–15个计数网格上重复计数，总计数达到500个细胞。
- 根据单个网格面积与滤膜有效过滤总面积之比，为所用显微镜和放大倍数建立转换系数。然后，将总计数的细胞数除以计数的网格数，得到每个网格的平均细菌数量。
- 将上述参数乘以已建立的转换系数，并根据过滤样品的体积将结果标准化为每毫升样品中的数量，从而获得每毫升样品中的总细菌丰度。
5. 确定原生生物丰度
- 使用戊二醛（终浓度1%，更适合含有叶绿素颗粒的样品，可在固定后数天至数周内处理）或采用下述的福尔马林-硫代硫酸盐脱色法，对水样（实验I）或捕获液（实验II）的子样品进行固定。
注意：两种保存技术均可防止原生生物食物泡中摄取的物质被排出8。 - 关于福尔马林-硫代硫酸盐脱色法，向20 mL/200 µL的水样/捕获液子样品（分别为实验I/实验II）中加入100 µL/1 µL的卢戈氏碘液。
- 立即加入0.5 mL/50 µL硼酸盐缓冲福尔马林，随后加入20 µL/2 µL的3%硫代硫酸钠溶液（分别为实验I/实验II）。
注意：硫代硫酸钠可使卢戈氏碘液的黄色褪去，从而便于在落射荧光显微镜下观察细胞8。 - 将已知体积的样品（根据目标原生生物数量而定）过滤至孔径为1 µm的黑色聚碳酸酯滤膜上。
- 使用计数网格（见上文），在600倍放大倍数下计数至少200个细胞，以估算原生生物物种的数量。
- 在过滤漏斗中通过低真空将样品体积抽滤至约2 mL。随后释放负压，加入DAPI荧光染料（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐13，终浓度0.2%），染色2分钟。
6. 浮游生物样品中纤毛虫群落结构的确定
注意：淡水生境中的纤毛虫群落具有高度多样性14,15,16,18，其显微鉴定具有挑战性。将纤毛虫类群划分为功能类群10,14,16,17，有助于更详细地分析不同纤毛虫类群作为浮游细菌食性生物的生态功能。
- 通过结合以下方法评估纤毛虫群落结构：
- 在落射荧光显微镜下观察经DAPI染色的样品（通过大小和形态各异的宏核与微核发出的强荧光定位纤毛虫细胞），并结合荧光标记细菌（FLB8；详见下文）的摄食情况，追踪纤毛虫摄食细菌的能力。
- 在特定情况下进行活体样品观察17,19。有关上述方法及用于将纤毛虫划分为不同分类类群的标准的更多细节，请参见以往的研究文献16,17。
注：已有研究指出，在纤毛虫中，嗜虫科（Stichotrichia）中的杂食性种类（如 Halteria 和 Pelagohalteria 属）以及寡毛目（Oligotrichia）中的 Rimostrombidium spp. 是绝大多数淡水生境中浮游细菌最重要的浮游消费者10,17,18。
7. 纤毛虫摄食速率的估算
- 根据平均示踪物（即FLB）数量的变化，计算纤毛虫对细菌的摄食速率8 每纤毛虫在孵育时间（5-15 分钟）内的摄食速率及添加的荧光标记细菌（FLB）示踪剂用量，最多计入 占细菌总数的5%至15%。
- 为比较不同原生生物种类的摄取速率，需将摄取速率标准化为每小时每纤毛虫所摄取的细菌数量，计算依据为实际的孵育时间以及添加的示踪荧光标记细菌（FLB）的比例。
注意：用于估算自然样品中单细胞或物种特异性及总体细菌摄食率的FLB方法应用的一般流程如图所示 图1. - 从淡水环境本土细菌菌株制备荧光标记细菌（FLB）8
- 选择合适大小（平均细胞体积 = MCV）和形态的细菌，以有效模拟所研究水生系统中浮游细菌/细菌细胞的典型尺寸。
注意：对于实验 I，使用来自研究地点的属的分离株混合物 Limnohabitans 和 多核杆菌属 使用了典型的湖泊和池塘中丰度较高的浮游细菌20有关菌株形态和大小的详细信息，请参见先前的出版物3,17,18,21. - 通过离心（5,000 x g）从培养物中收获细菌细胞 g) 在对数生长后期静置培养 15 分钟，并按产生 MCV 的数值比例混合 ± 混合液中细胞的 SD，对应于所选位置细菌的典型 MCV。
- 将沉淀重悬于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS；pH = 9）中。
- 向磷酸盐-生理盐水缓冲液中的细胞悬液加入 2 mg 黄绿色荧光染料 5-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基荧光素（DTAF，可结合蛋白质），并在 60 °C 下孵育 °C 水浴 2 小时。
- 孵育结束后，将细胞离心沉淀，弃去DTAF溶液，再用PBS洗涤并离心3次。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 20 mL PP 中i-生理盐水缓冲液
- 涡旋FLB悬浮液，并用移液器将1.5 mL等分试样加入2 mL冻存管中，然后于-20℃冷冻保存 °C）在PP中i-saline 缓冲液中，直至使用。
- 预过滤 PPi-生理盐水缓冲液通过0.2 µm 聚碳酸酯滤膜，用于下一步骤。
- 为确定FLB浓度，转移少量等分试样（通常为20-40 μL） µL）至 2 mL 无颗粒的 PPi-生理盐水缓冲液，以30 W超声数次，每次2秒，随后过滤至0.2 µm 聚碳酸酯黑色滤膜，用于在落射荧光显微镜下（1,000倍放大）结合DTAF光学滤光片设置（448 nm/520-540 nm）进行计数。
- 选择合适大小（平均细胞体积 = MCV）和形态的细菌，以有效模拟所研究水生系统中浮游细菌/细菌细胞的典型尺寸。
- 纤毛虫摄食细菌的示踪技术估算方法
- 对于自然浮游生境中的摄食实验，将300 mL样品加入已充分冲洗的1 L锥形瓶中，并在原位温度下孵育15分钟（以使原生生物从操作应激中恢复）。
- 加入FLB示踪剂，使其占总细菌数量的5%–15%，具体添加量需根据季节和水温而定。
注意：纤毛虫物种特异性摄取率存在非常广泛的季节性变化，其跨度可达多个数量级（即从101-104 细菌 纤毛虫-1 每小时10,16,17,18,22,23,24. - 在纤毛虫摄取率较高且发生频率增加的时期（通常在夏季），还需进行一组平行培养实验，添加极少量的荧光标记细菌（FLB），仅占总细菌量的2%–4%，以避免示踪用FLB过度填充纤毛虫的食物泡（参见示例于 图2).
- 将纤毛虫/浮游生物样品与FLB共同孵育5-15分钟。
- 样品固定的方案有两种，可防止原生生物食物泡中摄入的物质被排出8. 通过添加1%戊二醛终止孵育（终浓度，适用于含有叶绿素颗粒（如藻类）的样品）。或者，使用100 µL/10 µL 碘溶液加入 20 mL/200 µL 水样/捕获液分样，立即加入 0.5 mL/10 µL 硼酸盐缓冲福尔马林，然后 200 µL/2 µ3% 硫代硫酸钠溶液，体积为 L（实验 I / 实验 II，分别对应）。
- 加入固定剂后，将样品在4℃避光静置至少1小时。 °C 以确保纤毛虫细胞的充分保存。
- 取4-30 mL/10-30的天然浮游生物子样品 μL（分别为实验I/实验II；体积取决于纤毛虫丰度），并用DAPI染色（终浓度0.2% wt/vol；详情见上述步骤3.2）。
- 通过 1 次 µ使用黑色滤膜并通过落射荧光显微镜观察，计数纤毛虫（600倍放大），并统计摄入的荧光标记细菌（FLB）示踪剂数量（主要在1000倍放大下进行），具体操作详见先前发表的文献。2,17在保存后的7天内检查样品。
- 为估算原生动物总摄食率/物种特异性摄食率，将所有纤毛虫或特定纤毛虫物种的平均摄取速率乘以原位丰度。
- 以下以捷克共和国Římov水库的原位数据为例，说明单细胞摄取速率的计算方法：
- 假设细菌浓度为 3.55 x 106 细菌/mL，并添加示踪剂FLB至终浓度为0.25 × 106 FLB/mL，总和为 3.8 × 106 每毫升细菌数（总细菌颗粒数，即天然细菌 + 荧光标记细菌 = 100% 的捕食颗粒），表示自然样品中可供吞噬性原生生物利用的细菌数量。
注意：所添加的FLB示踪剂占总细菌颗粒的6.58%（按0.25/0.038计算）。每个FLB的平均数量 Halteria sp. 在5分钟孵育时间内为6.2 FLB。 - 为将摄取量标准化为每小时，使用以下计算：(6.2 × 12)/(6.58/100) = 每小时1131个细菌 Halteria 细胞/小时
注意：有关单个吸收速率分布的更多示例， Halteria 在不同的水温、示踪荧光标记细菌（FLB）添加量（百分比）以及与FLB孵育时间条件下检测到的sp. 图3.
- 假设细菌浓度为 3.55 x 106 细菌/mL，并添加示踪剂FLB至终浓度为0.25 × 106 FLB/mL，总和为 3.8 × 106 每毫升细菌数（总细菌颗粒数，即天然细菌 + 荧光标记细菌 = 100% 的捕食颗粒），表示自然样品中可供吞噬性原生生物利用的细菌数量。
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结果
示例实验 I 在捷克南波希米亚的Římov水库进行，该水库是一个天然水体，其中天然原位捕食者和猎物的丰度较低。文中报告了杂食性纤毛虫Halteria grandinella的代表性数据，该物种是广泛存在且高效摄食微小型浮游生物（<2 µm）颗粒的纤毛虫10,16,17,18,22。图3展示了来自Římov水库的Halteria sp. 每个细胞所摄取FLB数量的箱线图（图3A），并将其换算为每小时细菌摄食速率（图3...
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讨论
解析水生系统中的营养级相互作用一直具有挑战性28，尤其是在涉及原生生物及其猎物——细菌的纳米级浮游生物尺度上。当研究涉及营养吸收途径及其定量时，由于生物相互作用的高度复杂性，原本在较高营养级中成功应用的方法（例如稳定同位素标记法）往往难以适用。本实验方案展示了利用落射荧光显微镜结合荧光标记细菌作为示踪剂的优势，可用于追踪并半定量/估算碳流（细菌猎物：多种原生生物摄食者，包括混合营养型摄食者29）在微生物食物网基础环节的传递路径。该方法的优势之一在于单细胞水平的高准确性，另一优势则在于能够以前所未有的分辨率解析摄食者群落结构，并区分不同的功能类群、物种（实验I），甚至同一物种的不同亚群（实验II）。
实验方案中的关键步骤
本方案中有若干关键步骤，可确保该方法的优势得到充分发挥。首先，在实验开始前对研究环境有基本了解总是有益的。这包括对环境中潜在的摄食者种类与丰度、细菌猎物的大小以及猎物分布进行显微观察，具体包括两个方面：1）水体中的垂直分布（例如，从表水层到深...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了捷克科学基金会研究项目13-00243S和19-16554S的资助，分别授予K. Š.和D. S.。本文还得到了欧洲区域发展基金在研究、开发与教育运行计划下资助的项目"生物操纵作为改善水库水质的工具”（项目编号CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2-µm 孔径滤膜 | SPI 供应，https://www.2spi.com/ | B0225-MB | 黑色聚碳酸酯核孔膜滤膜，直径需与所用过滤装置匹配 |
| 5-(4,6-二氯-2-三嗪基)氨基荧光素（DTAF） | 任何品牌 | ||
| 可调体积移液器 | 任何品牌，各种规格 | ||
| 离心 | 22 000 × g | ||
| 冻存管 | 任意品牌，2 mL 规格 | ||
| DAPI（4´,6-二氨基-2´-苯基吲哚二盐酸盐 | 任何品牌 | 1 mg ml-1 | |
| 落射荧光显微镜 | 400 倍至 1000 倍的放大倍数 | ||
| 适用于观察 DAPI 和 DTAF 范围的滤光片 | |||
| 目镜中的计数网格 | |||
| 过滤装置 | 通常直径为25 mm | ||
| 甲醛 | 显微镜品牌 | ||
| 戊二醛 | 显微镜品牌 | ||
| 显微镜用浸油 | 低荧光特异性油 | ||
| Lugol´s溶液 | 任何品牌或参见评论 | 配制碱性Lugol溶液，步骤如下：溶液1——溶解 10 g 碘化钾溶于 20 ml 去离子水，然后加入 5 g 碘。溶液 2 — 加入 5 g 醋酸钠 加入50 ml超纯水中。将溶液2加入溶液1中，并充分混匀。 | |
| 甲醇稳定的福尔马林 | 任何可用于显微镜观察的品牌 | ||
| 显微镜载玻片和盖玻片 | 任何用于显微镜观察的品牌 | ||
| 用于稀释样品的MQ水 | 任何品牌 | ||
| 磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH = 9） | 任何品牌 | 0.05 M Na2高倍物镜4- 氯化钠溶液，调节至 pH 9 | |
| PPi-生理盐水缓冲液 | 任何品牌 | 0.02 M Na4P2O7- NaCl 溶液。加入 0.53 g Na4P2O7 至 100 ml 去离子水，加入 0.85 g NaCl | |
| 采样装置 | 适用于获取代表性样本 | 例如用于湖泊浮游生物的弗里丁格采样器 | |
| 硫代硫酸钠溶液 | 任何品牌 | 3% 溶液用于本方案 | |
| 超声波破碎仪 | 任何品牌 | 30 W | |
| 涡旋 | 任何品牌允许 溶质与样品的充分混匀 | ||
| 水浴锅 | 任何可将温度维持在60的品 °C |
参考文献
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