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体外实验研究肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用

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DOI：

10.3791/59907

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2019年8月1日

 , 
1Department of Neurology, University of California, San Francisco, 2Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 3Departments of Pediatrics and Neurological Surgery, University of California, San Francisco

本文内容

摘要

本文介绍了一种有效的体外实验方法，用于评估肿瘤细胞条件培养基吸引巨噬细胞的能力。

摘要

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在多种癌症的肿瘤组织中占细胞总数的很大比例。胶质母细胞瘤（GBM）是一种无法治愈的恶性脑肿瘤，其肿瘤质量中高达一半为TAMs。TAMs可表现为促肿瘤或抗肿瘤作用，具体取决于细胞内特定基因的激活状态。肿瘤中的基因突变通过调控细胞因子的表达，可影响TAMs向肿瘤微环境的募集。本文介绍一种基于细胞的定量检测方法，用于评估肿瘤细胞条件培养基对巨噬细胞的募集能力。该方法利用人巨噬细胞系MV-4-11，研究胶质母细胞瘤条件培养基对巨噬细胞的趋化作用，具有高重复性和低变异性。本方法产生的数据有助于更深入理解肿瘤与肿瘤微环境之间的相互作用。类似的方法也可用于评估肿瘤细胞与其他免疫细胞（包括T细胞和自然杀伤（NK）细胞）之间的相互作用。

引言

巨噬细胞是一类具有高度表型和功能异质性的免疫细胞1。它们在宿主防御系统、组织修复、发育过程以及肿瘤进展中发挥重要作用1。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是指存在于实体瘤微环境中的巨噬细胞。某些TAMs可通过抑制T细胞介导的细胞毒性作用、调控肿瘤微环境（TME）、促进血管生成、侵袭和转移来促进肿瘤生长2,3,4,5。TAMs是肿瘤微环境中最丰富的细胞类型之一，TAMs数量越多，通常与多种实体瘤患者生存率降低相关6。肿瘤细胞独特的遗传特征影响其招募巨噬细胞的能力。在胶质母细胞瘤（GBM）——一种目前无法治愈的侵袭性脑肿瘤中，巨噬细胞可占肿瘤总质量的近一半7。表皮生长因子受体（EGFR）及其截短突变体EGFRvIII的共扩增在GBM中常见，赋予肿瘤生长优势8。共表达EGFR和EGFRvIII的细胞比仅表达EGFR或EGFRvIII的细胞更能吸引巨噬细胞7。

趋化因子是一类小分子细胞因子，在调控肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞组成方面发挥重要作用6,9。人类细胞可表达超过50种细胞因子10。肿瘤中的免疫细胞浸润主要通过细胞因子与其受体之间的相互作用实现11。不同类型的免疫细胞表达特异性的趋化因子受体/趋化因子，并可被分泌特定趋化因子/趋化因子受体的细胞招募12。肿瘤细胞可通过上调某些趋化因子的表达，招募如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、调节性T细胞以及髓源性抑制细胞（MDSCs）等免疫细胞6。阻断肿瘤细胞分泌的特定趋化因子，可能是抑制免疫细胞向肿瘤组织浸润的一种有前景的策略。

本文介绍了一种利用含有趋化因子的肿瘤细胞条件培养基与巨噬细胞系，在体外评估肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用的实验方案。

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方案

1. 培养基制备

  1. 无血清干细胞培养基的制备
    1. 解冻50倍B27添加剂、表皮生长因子（EGF，20 μg/mL，溶于含0.1% BSA的10 mM乙酸中）和成纤维细胞生长因子（FGF，20 μg/mL，溶于含0.1% BSA的10 mM乙酸中）。
    2. 向500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）中加入500 μL EGF（终浓度20 ng/mL）、500 μL FGF（终浓度20 ng/mL）、10 mL 50倍B27添加剂以及5 mL 100倍青霉素/链霉素（Pen/Strep）。翻转瓶身4–6次以混匀，用500 mL 0.1 μm滤器过滤除菌。标记瓶身，并于4 °C保存。
      注意：该培养基于4 °C下可保存并使用长达一个月。
  2. 制备MV-4-11细胞培养基：向500 mL伊氏改良达尔伯克培养基（IMDM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）。翻转瓶身4–6次以混匀，用500 mL 0.1 μm滤器过滤除菌。标记瓶身，并于4 °C保存。
    注意：该培养基于4 °C下可保存并使用长达一个月。
  3. 制备肿瘤细胞维持培养基：向500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）。翻转瓶身4–6次以混匀，用500 mL 0.1 μm滤器过滤除菌。标记瓶身，并于4 °C保存。
    注意：该培养基于4 °C下可保存并使用长达一个月。

2. 细胞制备

第1天：

  1. 解冻肿瘤细胞
  2. 将肿瘤细胞维持培养基（如步骤1.3所述）在37 °C水浴中预热20分钟。
  3. 从液氮罐中取出冷冻保存的U87、U87:EGFR、U87:EGFRvIII和U87:EGFR+EGFRvIII细胞，在37 °C水浴中快速解冻2分钟。
    注意：从液氮罐中取细胞时需格外小心。根据需要佩戴具有隔热功能的手套和护目镜。
  4. 用70%乙醇喷洒细胞培养超净台表面，并用纸巾擦拭去除表面残留的乙醇。
  5. 用70%乙醇喷洒含有细胞的冻存管和培养基瓶，再用纸巾擦拭其表面残留的乙醇，然后将其移入细胞培养超净台内。
  6. 将5 mL肿瘤细胞维持培养基移入一支无菌的15 mL离心管中。将装有肿瘤细胞的冻存管轻轻颠倒4–6次以混匀内容物，然后将全部细胞悬液转移至该15 mL离心管中，再次轻轻颠倒离心管4–6次以充分混匀。
  7. 在4 °C条件下以200 × g离心5分钟，随后吸除上清液。
  8. 用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，在4 °C条件下以200 × g离心5分钟，吸除上清液。
  9. 将细胞重悬于12 mL肿瘤细胞维持培养基（如步骤1.3所述）中，轻轻吹打3–5次以混匀，然后将细胞悬液转移至T75细胞培养瓶中。
  10. 将细胞置于37 °C、含5% CO2的培养箱中培养。将剩余的肿瘤细胞维持培养基放回4 °C冰箱保存。

第2天：

  1. 在显微镜下观察细胞。如有需要，更换培养基。细胞在培养中应以单层形式生长。

第3天：

  1. 复苏 MV-4-11 细胞
    1. 将 MV-4-11 培养基（如步骤 1.2 所述）在 37 °C 水浴中预热 20 分钟。
      注意：可根据具体研究需求，将 MV-4-11 细胞替换为原代巨噬细胞或其他巨噬细胞系。
    2. 从液氮罐中取出冻存的 MV-4-11 细胞，在 37 °C 水浴中快速解冻 2 分钟。
      注意：从液氮罐中取细胞时需格外小心，必要时佩戴耐热手套和护目镜。
    3. 用 70% 乙醇喷洒细胞培养超净台表面，并用纸巾擦拭去除表面残留的乙醇。
    4. 用 70% 乙醇喷洒含有细胞的冻存管和培养基瓶，再用纸巾擦拭表面残留的乙醇，然后将其移入细胞培养超净台内。
    5. 将 5 mL MV-4-11 培养基（如步骤 1.2 所述）移入一支无菌 15 mL 离心管中。将含有肿瘤细胞的冻存管轻轻颠倒 4–6 次以混匀，然后将全部细胞悬液转移至该离心管中，再轻轻颠倒离心管 4–6 次以充分混匀。
    6. 在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，吸弃上清液。
    7. 用 10 mL PBS 重悬细胞，于 4 °C 以 200 × g 离心 5 分钟，吸弃上清液。
    8. 用 12 mL MV-4-11 培养基（如步骤 1.2 所述）重悬细胞，轻柔吹打 3–5 次混匀，将细胞悬液转移至 T75 细胞培养瓶中。
    9. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
  2. 传代肿瘤细胞
    1. 将无血清干细胞培养基（如步骤 1.1 所述）在 37 °C 水浴中预热 20 分钟。
    2. 用 70% 乙醇喷洒细胞培养超净台表面，并用纸巾擦拭去除表面残留的乙醇。从冰箱中取出细胞解离液，用 70% 乙醇喷洒培养基和细胞解离液瓶，再用纸巾擦拭表面残留的乙醇，然后将其移入细胞培养超净台内。
      注意：细胞解离液（accutase）无需预先加热。
    3. 将细胞培养瓶从培养箱中转移至细胞培养超净台内，吸弃原有培养基，向瓶中加入 2 mL 细胞解离液。
      注意：加入 accutase 前是否用 PBS 洗涤为可选步骤。
    4. 将培养瓶置于超净台中，每隔 1 分钟观察一次肿瘤细胞是否变圆。一旦细胞变圆，轻敲培养瓶侧壁以促进细胞脱落。
    5. 向培养瓶中加入 8 mL 无血清干细胞培养基，吹打混匀 3 次，将细胞悬液转移至一支无菌 15 mL 离心管中。在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，吸弃上清液。
    6. 用 10 mL PBS 重悬细胞，吹打 3–5 次混匀，在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，吸弃上清液。
      注意：此步骤为可选步骤。
    7. 用 10 mL 无血清干细胞培养基（如步骤 1.1 所述）重悬细胞，吹打 3–5 次混匀。取 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝溶液混合，再取 10 μL 混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定活细胞数量。
    8. 用无血清干细胞培养基（如步骤 1.1 所述）将细胞密度调整至 2.5 × 105 个/mL，每孔接种 2 mL 细胞悬液至 6 孔细胞培养板中。每种细胞接种 3 个孔（设三复孔）。同时，准备 6 个孔，每孔加入 2 mL 无血清干细胞培养基（不含细胞）。
      注意：这些样本将用于：1）作为阴性对照；2）根据细胞数量调整条件培养基的体积。
    9. 将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中，培养 24 小时。

3. 体外巨噬细胞趋化实验

  1. 条件培养基的制备
    1. 将肿瘤细胞维持培养基（如步骤1.3所述）在37 °C水浴中预热20分钟。
    2. 用70%乙醇喷洒细胞培养超净台表面，并用纸巾擦拭去除表面的70%乙醇。从冰箱中取出细胞解离溶液。将培养基瓶和细胞解离溶液瓶用70%乙醇喷洒，用纸巾擦拭瓶身表面后移入细胞培养超净台内。
    3. 从培养箱中取出6孔板。小心地将条件培养基用移液器转移至15 mL无菌离心管中，将离心管置于冰上。将“仅培养基”对照孔中的培养基转移至另一支15 mL无菌离心管中。
      注意：在此步骤前，务必在显微镜下检查细胞是否已贴壁。若未贴壁，可在步骤2.4.8中使用包被板以促进贴附，或在细胞计数步骤中包含悬浮细胞。
    4. 向6孔板的每个孔中加入0.5 mL细胞解离溶液。每隔1分钟检查肿瘤细胞是否变圆。一旦细胞变圆，轻轻敲击孔板侧壁以帮助细胞脱落。
    5. 向孔中加入2.5 mL肿瘤细胞维持培养基，上下吹打3次混匀，然后将细胞转移至15 mL无菌离心管中。取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝溶液混合。取10 μL混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定活细胞数量。
    6. 根据细胞数量，使用无血清干细胞培养基调整条件培养基体积（37 °C孵育过夜）。例如，若A孔的活细胞数量是细胞最少孔的3倍，则将其条件培养基按1:3稀释。此步骤用于控制因细胞增殖速率差异带来的影响。
      注意：使用无血清干细胞培养基并在37 °C孵育过夜的原因是为了控制培养基在长时间37 °C暴露下可能发生的成分变化。
    7. 将条件培养基经0.45 μm滤膜过滤，过滤后的培养基置于冰上。
      注意：此步骤可去除条件培养基中的细胞及细胞碎片。
  2. MV-4-11细胞的制备
    1. 将不含FBS的IMDM培养基在37 °C水浴中预热20分钟。
    2. 用70%乙醇喷洒细胞培养超净台表面，并用纸巾擦拭去除表面的70%乙醇。将培养基瓶用70%乙醇喷洒，擦拭瓶身表面后移入细胞培养超净台内。
    3. 将MV-4-11细胞培养瓶移入细胞培养超净台。吸取10 mL细胞悬液至15 mL无菌离心管中。取10 μL细胞与10 μL台盼蓝溶液混合。取10 μL混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定活细胞数量。在4 °C条件下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。
    4. 用10 mL PBS重悬细胞，在4 °C条件下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。
    5. 用不含FBS的IMDM培养基重悬细胞，调整细胞终浓度为1×106 个细胞/mL。
      注意：此处所用巨噬细胞的数量可根据实验需要进行调整。
  3. Transwell迁移实验
    注意：本步骤可使用细胞迁移检测试剂盒，或分别购买试剂与Transwell小室。针对MV-4-11细胞，应选择孔径为5 μm的Transwell小室。检测巨噬细胞迁移时，可直接计数下室中的巨噬细胞数量，或采用比色法/荧光法检测。本文以比色法为例进行说明。
    1. 将24孔板、Transwell小室及试剂恢复至室温。
    2. 将上述制备的MV-4-11细胞悬液各250 μL加入Transwell小室内。
    3. 向24孔板的下室中加入400 μL条件培养基或“仅培养基”对照（经37 °C孵育过夜，作为阴性对照）。每种肿瘤细胞系或对照组均设三个重复。避免小室与条件培养基之间产生气泡，气泡会阻碍巨噬细胞向底部孔室迁移。
    4. 将24孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4小时。
      注意：孵育时间可根据实验需要调整。可在显微镜下观察迁移至下室的细胞。
    5. 轻轻敲击小室内壁使小室脱离，随后弃去小室。由于MV-4-11细胞为悬浮生长，此处无需使用细胞解离液或胰酶处理。
    6. 轻轻吹打孔内细胞悬液上下3次混匀，取225 μL细胞悬液转移至适用于荧光检测的黑色壁96孔板中。
    7. 将CyQuant染料用4倍裂解缓冲液按1:75稀释，短暂涡旋混匀后离心。向96孔板每孔加入75 μL染料溶液，在室温下孵育15分钟。
    8. 使用荧光酶标仪，设置激发波长480 nm、发射波长520 nm检测荧光强度。
    9. 通过扣除空白值并相对于对照肿瘤细胞系进行归一化处理来分析数据。

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结果

结果通常以柱状图形式展示（示例见图1）。480/520值较高的样本表明条件培养基具有较强的巨噬细胞趋化能力。根据实验需求，可设置额外的对照组。例如，可使用中和抗体处理条件培养基，以消除巨噬细胞的趋化作用，并进行相同的检测。也可向条件培养基中添加额外的趋化因子（如CCL2），作为阳性对照。

显示EGFR实验荧光水平的柱状图；在EGFR+EGFRvIII条件下较高。
图1：共表达EGFR和EGFRvIII的U87细胞的条件培养基比表达对照载体或单独表达EGFR/EGFRvIII的U87细胞更能吸引巨噬细胞。 本图改编自A...

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讨论

在本实验方案中，有几个关键步骤：1）Transwell 小室的选择。对于 MV-4-11 细胞系，5 μm 的 Transwell 小室效果良好。然而，对于其他细胞系（如常用的单核细胞系 THP-1），可能需要使用不同孔径的小室。2）由于不同细胞系的生长速度不同，需根据细胞数量调整条件培养基的体积。为此，可在相同实验条件下孵育无细胞的培养基，用于稀释条件培养基。3）FBS 含有细胞因子，因此在上室中接种 MV-4-11 细胞时，必须使用无血清培养基。若在此步骤中使用 FBS，有时将无法观察到细胞迁移现象。

研究人员可根据不同应用修改该实验方案。例如，可使用其他肿瘤细胞替代上述示例中所用的脑肿瘤细胞系，包括原代患者来源的异种移植培养物或小鼠细胞。巨噬细胞系也可根据具体需求，替换为来自患者或小鼠的原代巨噬细胞或单核细胞。一个重要的注意事项是，研究人员需选择同一物种的细胞，以确保获得最佳结果。尽管巨噬细胞趋化通路在进化上高度保守，但不同物种间蛋白质序列和结构的差异可能为实验结果的解读带来额外的复杂性。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在...

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披露

William A. Weiss 是 StemSynergy Therapeutics 的联合创始人。Zhenyi An 无任何利益冲突需要披露。

致谢

基金支持：Z. An 获得了 Alex’s Lemonade Stand Foundation、美国脑肿瘤协会、NIH T32CA108462 以及部分由 Sandler Foundation 资助的突破性生物医学研究计划的支持。W. Weiss 获得了 NIH 基金 R01CA221969、R01NS091620、P50CA097257、U01CA217864、P30CA82103；Samuel G. Waxman 癌症研究基金会；以及 Evelyn 和 Mattie Anderson 讲席基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 μm 过滤杯赛默飞世尔科技566-0010
0.45 μm 滤膜单元MilliporeSLHA033SS
10 mL 血清移液管奥林巴斯塑料制品12-104
15 mL 无菌离心管奥林巴斯塑料制品28-103
1 mL 移液器吸头ART分子生物产品2779-RI
2 mL 吸液移液管Falcon357558
24孔板MilliporeECM507ECM507 的组成部分，也可单独购买
4x 裂解缓冲液MilliporeECM507ECM507 的组成部分，也可单独购买
5 μm Transwell 小室MilliporeECM507ECM507 的组成部分，也可单独购买
75 cm2 烧瓶康宁430641U
Accutase创新细胞技术AT-104
B27Gibco12587-010
CyQuant染料MilliporeECM507ECM507 的组成部分，也可单独购买
DMEMGibco11965-092
DMEM:F12Gibco10565-018
EGFPeprotechAF-100-15
FBSGibco26140
FGFPeprotech100-18B
IMDMGibco12440-053
PBSGibco14190-144
青霉素-链霉素Gibco15140-122
台盼蓝伯乐（Bio-Rad）1450021

参考文献

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MV 4 11 CyTOF

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