本文介绍了一种有效的体外实验方法，用于评估肿瘤细胞条件培养基吸引巨噬细胞的能力。
本文内容
摘要
摘要
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在多种癌症的肿瘤组织中占细胞总数的很大比例。胶质母细胞瘤（GBM）是一种无法治愈的恶性脑肿瘤，其肿瘤质量中高达一半为TAMs。TAMs可表现为促肿瘤或抗肿瘤作用，具体取决于细胞内特定基因的激活状态。肿瘤中的基因突变通过调控细胞因子的表达，可影响TAMs向肿瘤微环境的募集。本文介绍一种基于细胞的定量检测方法，用于评估肿瘤细胞条件培养基对巨噬细胞的募集能力。该方法利用人巨噬细胞系MV-4-11，研究胶质母细胞瘤条件培养基对巨噬细胞的趋化作用，具有高重复性和低变异性。本方法产生的数据有助于更深入理解肿瘤与肿瘤微环境之间的相互作用。类似的方法也可用于评估肿瘤细胞与其他免疫细胞（包括T细胞和自然杀伤（NK）细胞）之间的相互作用。
引言
巨噬细胞是一类具有高度表型和功能异质性的免疫细胞1。它们在宿主防御系统、组织修复、发育过程以及肿瘤进展中发挥重要作用1。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是指存在于实体瘤微环境中的巨噬细胞。某些TAMs可通过抑制T细胞介导的细胞毒性作用、调控肿瘤微环境（TME）、促进血管生成、侵袭和转移来促进肿瘤生长2,3,4,5。TAMs是肿瘤微环境中最丰富的细胞类型之一，TAMs数量越多，通常与多种实体瘤患者生存率降低相关6。肿瘤细胞独特的遗传特征影响其招募巨噬细胞的能力。在胶质母细胞瘤（GBM）——一种目前无法治愈的侵袭性脑肿瘤中，巨噬细胞可占肿瘤总质量的近一半7。表皮生长因子受体（EGFR）及其截短突变体EGFRvIII的共扩增在GBM中常见，赋予肿瘤生长优势8。共表达EGFR和EGFRvIII的细胞比仅表达EGFR或EGFRvIII的细胞更能吸引巨噬细胞7。
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方案
1. 培养基制备
- 无血清干细胞培养基的制备
- 解冻50倍B27添加剂、表皮生长因子（EGF，20 μg/mL，溶于含0.1% BSA的10 mM乙酸中）和成纤维细胞生长因子（FGF，20 μg/mL，溶于含0.1% BSA的10 mM乙酸中）。
- 向500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）中加入500 μL EGF（终浓度20 ng/mL）、500 μL FGF（终浓度20 ng/mL）、10 mL 50倍B27添加剂以及5 mL 100倍青霉素/链霉素（Pen/Strep）。翻转瓶身4–6次以混匀，用500 mL 0.1 μm滤器过滤除菌。标记瓶身，并于4 °C保存。
注意：该培养基于4 °C下可保存并使用长达一个月。
- 制备MV-4-11细胞培养基：向500 mL伊氏改良达尔伯克培养基（IMDM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）。翻转瓶身4–6次以混匀，用500 mL 0.1 μm滤器过滤除菌。标记瓶身，并于4 °C保存。
注意：该培养基于4 °C下可保存并使用长达一个月。 - 制备肿瘤细胞维持培养基：向500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）。翻转瓶身4–6次以混匀，用500 mL 0.1 ....
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结果
结果通常以柱状图形式展示（示例见图1）。480/520值较高的样本表明条件培养基具有较强的巨噬细胞趋化能力。根据实验需求，可设置额外的对照组。例如，可使用中和抗体处理条件培养基，以消除巨噬细胞的趋化作用，并进行相同的检测。也可向条件培养基中添加额外的趋化因子（如CCL2），作为阳性对照。
图1：共表达EGFR和EGFRvIII的U87细胞的条件培养基比表达对照载体或单独表达EGFR/EGFRvIII的U87细胞更能吸引巨噬细胞。 本图改编自A.......
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讨论
在本实验方案中，有几个关键步骤：1）Transwell 小室的选择。对于 MV-4-11 细胞系，5 μm 的 Transwell 小室效果良好。然而，对于其他细胞系（如常用的单核细胞系 THP-1），可能需要使用不同孔径的小室。2）由于不同细胞系的生长速度不同，需根据细胞数量调整条件培养基的体积。为此，可在相同实验条件下孵育无细胞的培养基，用于稀释条件培养基。3）FBS 含有细胞因子，因此在上室中接种 MV-4-11 细胞时，必须使用无血清培养基。若在此步骤中使用 FBS，有时将无法观察到细胞迁移现象。
研究人员可根据不同应用修改该实验方案。例如，可使用其他肿瘤细胞替代上述示例中所用的脑肿瘤细胞系，包括原代患者来源的异种移植培养物或小鼠细胞。巨噬细胞系也可根据具体需求，替换为来自患者或小鼠的原代巨噬细胞或单核细胞。一个重要的注意事项是，研究人员需选择同一物种的细胞，以确保获得最佳结果。尽管巨噬细胞趋化通路在进化上高度保守，但不同物种间蛋白质序列和结构的差异可能为实验结果的解读带来额外的复杂性。
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在.......
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披露
William A. Weiss 是 StemSynergy Therapeutics 的联合创始人。Zhenyi An 无任何利益冲突需要披露。
致谢
基金支持：Z. An 获得了 Alex’s Lemonade Stand Foundation、美国脑肿瘤协会、NIH T32CA108462 以及部分由 Sandler Foundation 资助的突破性生物医学研究计划的支持。W. Weiss 获得了 NIH 基金 R01CA221969、R01NS091620、P50CA097257、U01CA217864、P30CA82103；Samuel G. Waxman 癌症研究基金会；以及 Evelyn 和 Mattie Anderson 讲席基金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 μm 过滤杯 | 赛默飞世尔科技 | 566-0010 | |
| 0.45 μm 滤膜单元 | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL 血清移液管 | 奥林巴斯塑料制品 | 12-104 | |
| 15 mL 无菌离心管 | 奥林巴斯塑料制品 | 28-103 | |
| 1 mL 移液器吸头 | ART分子生物产品 | 2779-RI | |
| 2 mL 吸液移液管 | Falcon | 357558 | |
| 24孔板 | Millipore | ECM507 | ECM507 的组成部分，也可单独购买 |
| 4x 裂解缓冲液 | Millipore | ECM507 | ECM507 的组成部分，也可单独购买 |
| 5 μm Transwell 小室 | Millipore | ECM507 | ECM507 的组成部分，也可单独购买 |
| 75 cm2 烧瓶 | 康宁 | 430641U | |
| Accutase | 创新细胞技术 | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant染料 | Millipore | ECM507 | ECM507 的组成部分，也可单独购买 |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 台盼蓝 | 伯乐（Bio-Rad） | 1450021 |
参考文献
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front....
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