使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

摘要

本实验方案的目的是展示如何利用晶格光片显微镜对活细胞中表面受体的动力学过程进行四维可视化观察。此处展示的是CD4⁺原代T细胞上的T细胞受体。

摘要

细胞的信号传导与功能由其表面受体的动态结构及相互作用所决定。为了真正理解这些受体在原位的结构与功能关系，我们需要以足够的时空分辨率在活细胞表面对其进行可视化和追踪。本文展示了如何利用近期发展的晶格光片显微镜（Lattice Light-Sheet Microscopy, LLSM）对活细胞膜上的T细胞受体（T-cell receptors, TCRs）进行四维（4D，即空间与时间）成像。T细胞是适应性免疫系统的主要效应细胞之一，本文以T细胞为例，说明这些细胞的信号传导与功能由TCR的动态行为及其相互作用所驱动。. LLSM 能够实现前所未有的时空分辨率的四维成像。因此，该显微技术可广泛应用于生物学中不同类型细胞的表面或细胞内分子的研究。

引言

实时精确观测分子在三维细胞表面的转运和扩散动态一直是一个亟待解决的难题。显微技术始终需要在速度、灵敏度和分辨率之间进行权衡：若其中一项或两项达到最大化，第三项则必然受到限制。因此，由于细胞表面受体尺寸微小且运动速度极快，追踪其动态行为一直是细胞生物学领域面临的一项重大技术挑战。例如，已有许多研究采用全内反射荧光显微镜（TIRF）^1,2,3，该技术具有较高的时间分辨率，但仅能成像T细胞膜的极薄区域（约100 nm），因而无法捕捉细胞更深处发生的事件。此外，这些TIRF图像仅能提供细胞的二维截面信息。相比之下，超分辨率成像技术，如随机光学重建显微镜（STORM）⁴、光激活定位显微镜（PALM）⁵和受激发射损耗显微镜（STED）⁶，能够突破光的阿贝衍射极限。这些技术具备高空间分辨率（约20 nm）^4,5,6,7，但通常需要数分钟才能获取一幅完整的二维（2D）....

方案

本研究使用了芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准方案下的B10.A背景的5C.C7 TCR转基因RAG2基因敲除小鼠。

1. 收获并激活T细胞

注意：本实验方案的这一部分基于先前的实验方案，详见参考文献^20,21。

1. 根据批准的IACUC方案，对一只10至12周龄、任一性别的5C.C7转基因小鼠（体重约20-25 g）实施安乐死（例如，使用CO₂麻醉舱后行颈椎脱位）。
2. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体，浸湿毛发后移入BSL-2生物安全柜中。
3. 将小鼠置于右侧，用手术剪在体腔上做一小切口。使用手术镊取出脾脏，并根据需要使用手术剪剪除结缔组织。
4. 将脾脏置于70 µm孔径的细胞筛网上，用1 mL注射器活塞背面碾压破碎。用完全RPMI培养基（含10%胎牛血清[FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、50 µM 2-巯基乙醇的RPMI）充分冲洗滤过。
5. 将脾细胞单细胞悬液在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
   注意：此时沉淀应呈红色。
6. 用5 mL红细胞裂解缓冲液重悬脾细胞，孵育5分钟后加入5 mL完全RPMI终止反应。

结果

本文介绍了使用晶格层光显微镜分离、制备和成像小鼠原代5C.C7 T细胞的方法。在第3节中，正确对齐显微镜并每天采集点扩散函数（PSF）以用于数据采集后的去卷积处理至关重要。在图2中，我们展示了显微镜对齐过程中应观察到的正确对齐图像。图2A和图2B分别显示了在荧光素成像时正确的光路和光束对齐状态。物镜扫描在XZ和YZ投影中应呈现一个尽可能对称的大X形图案；同时应将其调整为尽可能小的X形（图2C）。这主要通过调节发射物镜的环形校正 collar 实现。Z轴振镜扫描在XZ和XY方向上应显示一个椭圆形，并在两侧各有一个单独的点（XZ方向为上下，YZ方向为左右）（图2D）。这主要通过手动或使用软件中的电动调节功能来调整.......

讨论

本方案已针对在所用LLSM仪器上分离自5C.C7转基因小鼠的CD4⁺ T细胞进行了优化，因此其他细胞系统和LLSM设备可能需要进行不同的优化。然而，该方案展示了4D成像的强大能力，因其可在生理条件下以最小的形变对整个细胞表面受体的动力学行为进行定量分析。因此，该技术具有广泛的未来应用前景。

一个关键步骤是让细胞沉降到合适的浓度。如果过多的抗原呈递细胞（APC）沉降到盖玻片上并过于密集，则很难找到仅与单个APC相互作用的T细胞。当T细胞形成多个突触时，数据的追踪和解释会变得非常复杂。同样，如果APC数量过少，也难以观察到T细胞形成突触。在我们的实验条件下，让50,000个细胞沉降10分钟可达到理想的密度。然而，若使用贴壁细胞体系，则可避免这一问题。可将细胞与盖玻片共同在培养箱中培养至所需的汇合度。

类似地，注入系统的T细胞数量取决于浴槽的体积以及细胞可扩散的距离。本实验所用的LLSM系统包含一个12 mL和一个2.5 mL的浴槽，而此前的系统仅配备一个10 mL的浴槽。我们使用12 mL浴槽进行原始荧光素成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD	309659	用于 T 细胞收获
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	用于 T 细胞培养
5 mm 圆形盖玻片	World Precision Instruments	502040	用于成像
70 µm 无菌细胞筛	Corning	7201431	用于 T 细胞收获
Alexa Fluor 488 抗小鼠 TCR β 链抗体	BioLegend	109215	用于成像
胎牛血清（FBS）	X&Y Cell Culture	FBS-500	用于 T 细胞培养
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	用于 T 细胞收获的密度梯度试剂
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	F6377	用于显微镜校准
FluoSpheres 羧基修饰微球	Thermo Fisher Scientific	F8810	用于显微镜校准
Imaris	Bitplane	N/A	追踪软件；其他可选追踪软件包括 Amira 或 Trackmate（Fiji）。
晶格光片显微镜	3i	N/A	所使用的显微镜
Leibovitz's L-15 培养基，无酚红	Thermo Fisher Scientific	21083027	用于成像
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030-081	用于 T 细胞培养
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy 由霍华德·休斯医学研究所 Janelia 研究园区授权使用。请联系 innovation@janelia.hhmi.org 获取访问权限。其他去卷积和去拼接方法可在 Fiji、Slidebook、Amira 等图像处理软件中获得。https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
飞蛾细胞色素 C（MCC），序列 ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	定制合成	用于 T 细胞收获
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122_3683884612	用于 T 细胞培养
聚-L-赖氨酸	Phenix Research Products	P8920-100ML	用于成像
红细胞裂解缓冲液	eBioscience	00-4300-54	用于 T 细胞收获
重组小鼠 IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	用于 T 细胞培养
RPMI 1640 培养基	Corning	MT10040CV	用于 T 细胞培养
Slidebook	3i	N/A	LLSM 成像软件
外科解剖工具	Nova-Tech International	DSET10	用于 T 细胞收获
T-25 培养瓶	Eppendorf	2231710126	用于 T 细胞培养
Thermo Scientific Pierce Fab 微量制备试剂盒	Thermo Fisher Scientific	44685	用于制备 Fab 片段