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方法文章

使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

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DOI：

10.3791/59914

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2020年1月30日

 , 
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

本文内容

摘要

本实验方案的目的是展示如何利用晶格光片显微镜对活细胞中表面受体的动力学过程进行四维可视化观察。此处展示的是CD4+原代T细胞上的T细胞受体。

摘要

细胞的信号传导与功能由其表面受体的动态结构及相互作用所决定。为了真正理解这些受体在原位的结构与功能关系，我们需要以足够的时空分辨率在活细胞表面对其进行可视化和追踪。本文展示了如何利用近期发展的晶格光片显微镜（Lattice Light-Sheet Microscopy, LLSM）对活细胞膜上的T细胞受体（T-cell receptors, TCRs）进行四维（4D，即空间与时间）成像。T细胞是适应性免疫系统的主要效应细胞之一，本文以T细胞为例，说明这些细胞的信号传导与功能由TCR的动态行为及其相互作用所驱动。. LLSM 能够实现前所未有的时空分辨率的四维成像。因此，该显微技术可广泛应用于生物学中不同类型细胞的表面或细胞内分子的研究。

引言

实时精确观测分子在三维细胞表面的转运和扩散动态一直是一个亟待解决的难题。显微技术始终需要在速度、灵敏度和分辨率之间进行权衡：若其中一项或两项达到最大化，第三项则必然受到限制。因此，由于细胞表面受体尺寸微小且运动速度极快，追踪其动态行为一直是细胞生物学领域面临的一项重大技术挑战。例如，已有许多研究采用全内反射荧光显微镜（TIRF）1,2,3，该技术具有较高的时间分辨率，但仅能成像T细胞膜的极薄区域（约100 nm），因而无法捕捉细胞更深处发生的事件。此外，这些TIRF图像仅能提供细胞的二维截面信息。相比之下，超分辨率成像技术，如随机光学重建显微镜（STORM）4、光激活定位显微镜（PALM）5和受激发射损耗显微镜（STED）6，能够突破光的阿贝衍射极限。这些技术具备高空间分辨率（约20 nm）4,5,6,7，但通常需要数分钟才能获取一幅完整的二维（2D）或三维（3D）图像，因而牺牲了时间分辨率。此外，依赖信号闪烁的STORM和PALM等技术在分子计数方面可能存在误差8,9。电子显微镜目前具有最高的分辨率（可达50 pm）10；还可通过聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）实现三维成像，达到最高3 nm（XY方向）和500 nm（Z方向）的分辨率11。然而，所有电子显微镜技术均需要苛刻的样品制备过程，且仅适用于固定后的细胞或组织，无法实现对活体样本的动态成像。

近年来，人们才开始开发出能够以高时空分辨率揭示活细胞在真实生理三维环境中表面及细胞内分子动态的技术。其中一种技术是晶格光片显微镜（Lattice Light-Sheet Microscopy, LLSM）12，该技术利用结构化光片显著降低光漂白效应。该技术由诺贝尔奖得主埃里克·贝齐格（Eric Betzig）于2014年开发，其高轴向分辨率、低光漂白和低背景噪声，以及能够同时对每个视野中数百个成像平面进行同步成像的能力，使LLS显微镜优于宽场、全内反射（TIRF）和共聚焦显微镜12,13,14,15,16,17,18,19。这种四维（x、y、z 和时间）成像技术虽然仍受限于衍射极限（约200 nm XYZ分辨率），但在三维空间采样中具有极高的时间分辨率（我们已实现约100 fps的帧率，每帧生成一幅三维重建的细胞图像，耗时0.85秒）。

LLSM 可广泛用于在单分子和单细胞水平上实时追踪任何细胞内任意分子的动态过程，尤其适用于免疫细胞等高度运动性细胞。例如，本文展示了如何利用 LLSM 可视化 T 细胞受体（TCR）的动态行为。T 细胞是适应性免疫系统的效应细胞，TCR 负责识别抗原呈递细胞（APC）表面展示的肽段-MHC（pMHC）配体，这一识别过程决定了 T 细胞的选择、发育、分化、命运及功能。该识别发生在 T 细胞与 APC 之间的接触界面上，导致受体局部聚集，形成所谓的免疫突触。尽管已知免疫突触中的 TCR 对 T 细胞效应功能至关重要，但 TCR 实时转运至突触的潜在机制仍不清楚。LLSM 使我们能够实时观察 TCR 在转运至突触前后，伴随 pMHC-TCR 相互作用而产生的动态变化（图 1）。因此，LLSM 可用于解答当前关于 TCR 形成动态的关键科学问题，并有助于揭示细胞如何区分自身抗原与外来抗原的机制。

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方案

本研究使用了芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准方案下的B10.A背景的5C.C7 TCR转基因RAG2基因敲除小鼠。

1. 收获并激活T细胞

注意：本实验方案的这一部分基于先前的实验方案，详见参考文献20,21。

  1. 根据批准的IACUC方案，对一只10至12周龄、任一性别的5C.C7转基因小鼠（体重约20-25 g）实施安乐死（例如，使用CO2麻醉舱后行颈椎脱位）。
  2. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体，浸湿毛发后移入BSL-2生物安全柜中。
  3. 将小鼠置于右侧，用手术剪在体腔上做一小切口。使用手术镊取出脾脏，并根据需要使用手术剪剪除结缔组织。
  4. 将脾脏置于70 µm孔径的细胞筛网上，用1 mL注射器活塞背面碾压破碎。用完全RPMI培养基（含10%胎牛血清[FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、50 µM 2-巯基乙醇的RPMI）充分冲洗滤过。
  5. 将脾细胞单细胞悬液在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
    注意：此时沉淀应呈红色。
  6. 用5 mL红细胞裂解缓冲液重悬脾细胞，孵育5分钟后加入5 mL完全RPMI终止反应。
  7. 将脾细胞单细胞悬液再次在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
    注意：此时沉淀应为白色，而非红色。
  8. 用5 mL完全RPMI重悬沉淀。
  9. 转移至T-25培养瓶中，并加入10 µM飞蛾细胞色素C（MCC，序列ANERADLIAYLKQATK）。将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中过夜培养。
  10. 次日，加入重组小鼠IL-2，使其终浓度达到100 U/mL。
  11. 在随后几天内持续观察，并在培养基变黄时及时更换新鲜培养基。若细胞在黄色培养基中无人看管超过48小时，将发生死亡。细胞收获后6-10天即可使用。

2. 准备细胞

  1. 将直径5 mm的圆形盖玻片与0.1%多聚赖氨酸（poly-L-lysine）在室温下孵育10分钟，吸除溶液后自然晾干。
  2. 使用密度梯度试剂（见材料表）分离死细胞，并分别获得1 × 106个T细胞和1 × 106个抗原呈递细胞（APC，即CH27细胞21,22，已转导表达胞质mCherry蛋白）。
    注意：细胞计数使用血细胞计数板进行。
    1. 向15 mL锥形管中加入3 mL密度梯度试剂，小心地将细胞悬液沿管壁逐滴加入。切勿混匀。在4 °C下以930 × g离心10分钟，加减速设置为慢速/慢速。小心吸取位于完全培养基与密度梯度试剂之间的薄层中间细胞层，将每种细胞分别收集至不同的锥形管中。
      注意：为确保成像所需细胞数量，需准备比实际需求更多的细胞，因为在该过程中平均会损失约50%的细胞。用于分离的细胞量越多，从密度梯度中收获细胞越容易。我们通常使用4–8 mL的每种细胞以确保细胞充足。如有需要，可在该步骤前进行细胞计数以确定所需体积。多余的细胞应放回各自原代培养瓶中。
    2. 将T细胞和CH27细胞分别用5 mL完全RPMI培养基洗涤三次（300 × g，5分钟）。每次洗涤后弃去上清液。每管细胞重悬于1 mL完全RPMI培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
  3. 将1 × 106个APC重悬于500 µL完全RPMI培养基中，加入10 µM MCC肽段，在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。用500 µL完全RPMI培养基洗涤三次（300 × g，5分钟），每次洗涤后弃去上清液。
  4. 将1 × 106个T细胞重悬于500 µL完全RPMI培养基中，向500 µL细胞悬液中加入2 µg抗TCRβ Alexa488标记的Fab片段（克隆号H57）。在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。用500 µL完全RPMI培养基洗涤三次（300 × g，5分钟），每次洗涤后弃去上清液。
    注意：为避免二价抗TCR抗体交联T细胞受体，使用Fab制备试剂盒（见材料表）将二价抗体切割为单价Fab片段（此步骤为可选）。
  5. 将两种细胞分别重悬于500 µL成像培养基中（不含酚红的Leibovitz's L-15培养基，含10% FBS、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺）。

3. 进行 LLSM 日常校准

注意：（重要）本对准方案基于所使用的 LLSM 仪器（参见材料表）。每台 LLSM 可能存在差异，需要采用不同的对准策略，尤其是自行搭建的系统。请执行相应的常规对准操作，然后继续进行第 4 节。

  1. 向LLSM浴槽（约10 mL体积）中加入10 mL水和30 µL荧光素（1 mg/mL储备液），按下“图像”（主页）将物镜移至成像位置，观察单个贝塞尔激光束的图案。使用导引和预设的兴趣区域（ROI）对激光束进行对准，使光束呈现为在各个方向上均对称且细窄的图案。
    1. 该光束在寻像相机中也应显示为聚焦状态。使用两个镜片倾斜调节器、顶部千分尺、聚焦装置和发射物镜环进行调节。正确的对准光束参见图2A,B。
  2. 用至少200 mL水清洗浴槽和物镜，彻底去除荧光素。
  3. 在成像介质中对标准荧光微珠进行成像（通过将微珠用聚-L-赖氨酸固定在5 mm盖玻片上制备，参见材料表；该样品可预先制备并重复使用），以获得成像介质中的物理点扩散函数（PSF）。
    注意：后续处理时视野中只能有一个微珠，因此应尽量寻找视野中孤立的微珠，或易于裁剪以获得单个微珠的图像。
    1. 在“X振镜范围”框中设置为3以开启抖动功能。点击实时以查看当前视野。沿Z方向移动以找到盖玻片和微珠。沿Z方向移动找到微珠中心后，点击停止暂停激光。勾选3D，点击居中，然后点击执行。这将开始采集数据。
    2. 手动调节倾斜镜、物镜环和聚焦千分尺，使灰度值达到最高，然后根据需要进一步调整，以获得适用于物镜扫描、Z振镜、Z+物镜（totPSF）和样品扫描（samplePSF）采集模式的正确图案。正确调整后的最大强度投影（MIPs）参见图2C-F。
      注意：不同的采集模式（物镜扫描、Z振镜、Z+物镜和样品扫描）会改变光片穿过样品的方式。所有扫描模式均应用于对准过程。
    3. 样品扫描模式显示了实验过程中数据的采集方式。在样品扫描模式下点击执行以采集用于去倾斜和去卷积的样品PSF（参见第5节）。将激光切换至三色模式（488、560、647），然后再次点击执行。
      注意：由于LLSM以一定角度（57.2°）成像，在"样品扫描"模式下采集的图像也以该角度进行，因此是"倾斜的"。去倾斜是指校正该角度并将图像"重新对齐"为真实的Z堆栈图像。这些数据必须在成像介质中以及实验中将要成像的所有通道中采集。如果未正确采集，数据将无法正确去倾斜。同样，请确保介质已预热至37 °C（或所需的实验温度）。

4. 使用 LLSM 设置细胞

  1. 将步骤 2.5 中的 100,000 个 APC（50 µL）加入步骤 2.1 中的直径为 5 mm 的圆形盖玻片上，静置 10 分钟使其贴壁。
  2. 在样品 holder 上涂抹润滑脂，然后将盖玻片细胞面向上放置于其上。在将盖玻片放入灌流槽前，向其背面滴加一滴成像培养基以避免产生气泡。将样品 holder 拧紧到压电位移器（piezo）上，然后点击 Image (Home)。
  3. 选择一个 APC 进行成像，以确保 LLSM 显微镜和成像软件（参见材料表）正常工作。
    注意：我们采用 0.4 µm 的步长，进行 60 层 Z 轴扫描，双色成像曝光时间为 10 ms，dither 设置为 3，由此获得每帧约 1.54 秒的三维图像，空间分辨率达到约 200 nm（XY）和 400 nm（Z）。这些参数需根据细胞大小、所需的 Z 轴分辨率以及所用荧光标记技术的信号强度进行调整。激光功率的设置也取决于所使用的荧光标记方法。
    1. 点击 Live 查看实时图像，沿 Z 轴方向移动以找到盖玻片及细胞位置。
    2. 通过 Z 轴方向移动找到 APC 的中心位置，然后点击 Stop 暂停激光。勾选 3D 并输入所需参数（见步骤 4.3.1），点击 Center，再点击 Execute 开始采集数据。
  4. 将载物台降至 load 位置，然后直接在盖玻片上方逐滴加入 50 µL 含 T 细胞的成像培养基（100,000 个细胞，来自步骤 2.5）。建议先让液滴在移液枪头末端形成，再将枪头轻触灌流槽中的液体表面。随后点击 "Image (Return)" 将载物台升回原位。
  5. 开始成像。务必设置所需的 Z 轴层数和时间间隔长度。例如，设置 60 层 Z 轴堆栈，步长为 0.4 µm，并输入 500 个时间帧。通常在达到 500 帧之前停止记录，以避免光漂白。使用 Live 模式寻找细胞对，当准备就绪并完成参数设置后，点击 Execute 开始数据采集。参见 Movie 1 和 Figure 1 中的示例。

5. 追踪表面动态

  1. 从成像软件中导出数据（参见材料表）。这将为每种颜色的每个时间点生成z轴层叠的TIF文件。
  2. 首先对数据进行去倾斜（deskew）和去卷积（deconvolution）处理。
    注意：我们使用的是HHMI珍利亚研究园区授权的LLSpy分析流程18，但多种成像软件中也提供去倾斜和去卷积功能（参见材料表）。
  3. 对数据进行漂白校正（debleach）。
    注意：我们使用Fiji软件中的漂白校正功能，并采用直方图匹配方法（Fiji操作路径：图像 | 调整 | 漂白校正 | 直方图匹配 | 确定）。
  4. 将数据导入追踪软件（参见材料表），并根据软件要求对簇状结构进行追踪。示例见视频2。
    注意：追踪结果取决于所使用的追踪软件、选择的算法以及设定的输出参数等。例如，在我们所使用的追踪软件中（参见材料表），我们选择允许软件追踪不规则形状，而不是将每个特征分配为单个点，因为TCR簇并不形成完美的球形结构。此外，我们选择收集35个参数，包括速度、方向、体积、强度、面积、位置以及轨迹持续时间等信息。然而，针对不同的科学问题，可能需要采用不同的方法或参数设置。
    1. 若无需进行追踪，可使用Fiji的ClearVolume插件对超堆栈数据进行可视化并生成视频。

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结果

本文介绍了使用晶格层光显微镜分离、制备和成像小鼠原代5C.C7 T细胞的方法。在第3节中，正确对齐显微镜并每天采集点扩散函数（PSF）以用于数据采集后的去卷积处理至关重要。在图2中，我们展示了显微镜对齐过程中应观察到的正确对齐图像。图2A和图2B分别显示了在荧光素成像时正确的光路和光束对齐状态。物镜扫描在XZ和YZ投影中应呈现一个尽可能对称的大X形图案；同时应将其调整为尽可能小的X形（图2C）。这主要通过调节发射物镜的环形校正 collar 实现。Z轴振镜扫描在XZ和XY方向上应显示一个椭圆形，并在两侧各有一个单独的点（XZ方向为上下，YZ方向为左右）（图2D）。这主要通过手动或使用软件中的电动调节功能来调整...

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讨论

本方案已针对在所用LLSM仪器上分离自5C.C7转基因小鼠的CD4+ T细胞进行了优化，因此其他细胞系统和LLSM设备可能需要进行不同的优化。然而，该方案展示了4D成像的强大能力，因其可在生理条件下以最小的形变对整个细胞表面受体的动力学行为进行定量分析。因此，该技术具有广泛的未来应用前景。

一个关键步骤是让细胞沉降到合适的浓度。如果过多的抗原呈递细胞（APC）沉降到盖玻片上并过于密集，则很难找到仅与单个APC相互作用的T细胞。当T细胞形成多个突触时，数据的追踪和解释会变得非常复杂。同样，如果APC数量过少，也难以观察到T细胞形成突触。在我们的实验条件下，让50,000个细胞沉降10分钟可达到理想的密度。然而，若使用贴壁细胞体系，则可避免这一问题。可将细胞与盖玻片共同在培养箱中培养至所需的汇合度。

类似地，注入系统的T细胞数量取决于浴槽的体积以及细胞可扩散的距离。本实验所用的LLSM系统包含一个12 mL和一个2.5 mL的浴槽，而此前的系统仅配备一个10 mL的浴槽。我们使用12 mL浴槽进行原始荧光素成...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢芝加哥大学 Vytas Bindokas 博士提供的建议与指导。感谢芝加哥大学集成光学显微镜核心设施对晶格光片显微镜的支持与维护。本研究工作得到了美国国立卫生研究院新创新者奖 1DP2AI144245 和美国国家科学基金会职业奖 1653782（授予 J.H.）的资助。J.R. 得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD309659用于 T 细胞收获
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148-25ML用于 T 细胞培养
5 mm 圆形盖玻片World Precision Instruments502040用于成像
70 µm 无菌细胞筛Corning7201431用于 T 细胞收获
Alexa Fluor 488 抗小鼠 TCR β 链抗体BioLegend109215用于成像
胎牛血清（FBS）X&Y Cell CultureFBS-500用于 T 细胞培养
FicollGE Healthcare17-1440-02用于 T 细胞收获的密度梯度试剂
荧光素钠盐Sigma-AldrichF6377用于显微镜校准
FluoSpheres 羧基修饰微球Thermo Fisher ScientificF8810用于显微镜校准
ImarisBitplaneN/A追踪软件；其他可选追踪软件包括 Amira 或 Trackmate（Fiji）。
晶格光片显微镜3iN/A所使用的显微镜
Leibovitz's L-15 培养基，无酚红Thermo Fisher Scientific21083027用于成像
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030-081用于 T 细胞培养
LLSpyJanelia Research CampusN/ALLSpy 由霍华德·休斯医学研究所 Janelia 研究园区授权使用。请联系 innovation@janelia.hhmi.org 获取访问权限。其他去卷积和去拼接方法可在 Fiji、Slidebook、Amira 等图像处理软件中获得。https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
飞蛾细胞色素 C（MCC），序列 ANERADLIAYLKQATKElimbio定制合成用于 T 细胞收获
青霉素/链霉素Life Technologies15140122_3683884612用于 T 细胞培养
聚-L-赖氨酸Phenix Research ProductsP8920-100ML用于成像
红细胞裂解缓冲液eBioscience00-4300-54用于 T 细胞收获
重组小鼠 IL-2Sigma-AldrichI0523用于 T 细胞培养
RPMI 1640 培养基CorningMT10040CV用于 T 细胞培养
Slidebook3iN/ALLSM 成像软件
外科解剖工具Nova-Tech InternationalDSET10用于 T 细胞收获
T-25 培养瓶Eppendorf2231710126用于 T 细胞培养
Thermo Scientific Pierce Fab 微量制备试剂盒Thermo Fisher Scientific44685用于制备 Fab 片段

参考文献

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