使用莱迪思光片显微镜可视化表面 T-Cell 受体动力学四维

Summary

该协议的目的是演示如何使用莱迪思光片显微镜对活细胞中的四维可视化表面受体动力学进行可视化。这里显示了^CD4+初级T细胞上的T细胞受体。

Abstract

细胞的信号和功能由其表面受体的动态结构和相互作用决定。为了真正了解这些受体在原位的结构-功能关系，我们需要在具有足够时空分辨率的活细胞表面可视化和跟踪它们。在这里，我们展示如何使用最近开发的莱迪思光片显微镜（LLSM）在活细胞膜上以四维（4D、空间和时间）成像T细胞受体（TDR）。T细胞是自适应免疫系统的主要效应细胞之一，在这里，我们以T细胞为例，表明这些细胞的信号和功能是由TDR的动态和相互作用驱动的。LLSM 允许以前所未有的时空分辨率进行 4D 成像。因此，这种显微镜技术通常可以应用于生物学中不同细胞的多种表面或细胞内分子。

Introduction

分子在三维细胞表面实时贩运和扩散的精确动力学是一个需要解决的难题。显微镜一直是速度、灵敏度和分辨率的平衡;如果任何一个或两个最大化，第三个最小化。因此，由于表面受体移动的体积小、速度极快，跟踪其动力学仍然是细胞生物学领域的一项重大技术挑战。例如，许多研究都是使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜^1，2，3，具有高时间分辨率，但只能成像T细胞膜（+100nm）的非常薄的切片，因此错过了在细胞更远发生的事件。这些 TIRF 图像也只显示细胞的二维部分。相比之下，超分辨率技术，如随机光学重建显微镜^{（STORM）4、}光活化定位显微镜（PALM）5和刺激发射损耗显微镜（STED）6，可以克服Abbe衍射光极限。这些技术具有高空间分辨率（+20 nm分辨率）4，5，6，7，但它们通常需要几分钟才能获得完整的二维（2D）或三维（3D）图像，因此时间分辨率会丢失。此外，....

Protocol

5C.C7 TCR-转基因RAG2敲除小鼠在B10。根据芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准的协议，在这项研究中使用了背景。

1. 收获和激活T细胞

注: 协议的这一部分基于以前的协议。有关更多详情^20，21， 请参阅引文。

1. 安乐死一个10-12周老的5C。C7 转基因小鼠的两个性别 （+20-25 g） 根据批准的 IACUC 协议 （即 CO₂室后跟宫颈脱位）。
2. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体，将毛皮浸泡，并放入BSL-2安全柜中。
3. 将鼠标转向其右侧，用手术剪刀在体腔中进行小切口。使用手术钳切除脾脏。用手术剪刀切掉结缔组织。
4. 将脾脏放入 70 μm-孔网细胞滤网中，然后与 1 mL 注射器柱塞的背面混合。用完整的 RPMI 彻底清洗滤网（RPMI 与 10% 胎儿牛血清 [FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素、50 μM 2-甲氨酰胺）。
5. 将单细胞悬浮液悬浮在300 x g下5分钟，丢弃上清液。
   注:此时的颗粒为红色。
6. 在 5 mL RBC 解液缓冲液中重新悬浮塞浦细胞。孵育5分钟，然后用5 mL的完整RPMI淬火。

Results

在这里，我们描述了主鼠标5C的隔离、制备和成像。C7 T细胞使用晶格光片显微镜。在第 3 节中，必须正确对齐显微镜，并每天收集 PSF，以便收集后对数据进行分批。在图2中，我们显示了校准显微镜时将看到的正确对齐图像。图 2A和图 2B显示了在荧光中成像时分别正确的光束路径和光束对齐。目标扫描应在 XZ 和 YZ 投影中显示一个大 X 形状，该形状尽可能对称;这也应该调整为尽可能小的X（图2C）。这主要通过调整排放目标环来实现。z galvo 扫描应在 XZ 和 XY 中显示一个椭圆，两侧有一个点（XZ 的上方和下方为 YZ，左侧和右侧为 YZ）（图 2D）。这主要通过手动或通过软件中的电动调整调整来调整 ga.......

Discussion

针对从5C分离的CD4⁺ T细胞的使用，对所呈现的协议进行了优化。C7转基因小鼠在LLSM仪器上使用，因此其他细胞系统和LLSM可能需要以不同的方式优化。然而，该协议显示了4D成像的力量，因为它可以用来量化整个细胞表面受体的动态，在生理条件中失真最小。因此，这种技术有许多可能的未来应用。

关键步骤是允许细胞以适当的浓度沉降。如果太多的 APC 在盖玻上安顿下来，并且变得太密集，则很难找到仅与单个 APC 交互的 T 单元。当 T 细胞具有多个突触时，数据的跟踪和解释可能会变得非常复杂。同样，如果存在太少的APC，则找到形成突触的T细胞也很困难。在我们手中，允许50，000个细胞沉淀10分钟，达到最佳密度。但是，如果使用具有粘附单元的系统，则可以避免此问题。细胞可以在培养箱中生长，盖玻片达到所需的汇合。

同样，掉入系统的T细胞数量取决于浴缸的大小和可以分散的距离。在此处使用的 LLSM 系统中，有一个 12 mL 的浴缸和一个 2.5 mL 的浴缸，而以前的系统只有 10 mL 的浴缸可用。我们使用 12 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL 注射器	BD	309659	用于 T 细胞收获
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	用于 T 细胞培养
5 mm 圆形盖玻片	World Precision Instruments	502040	用于成像
70um 无菌细胞过滤器	康宁	7201431	用于 T 细胞收获
Alexa Fluor 488 抗小鼠 TCR 和 β 链抗体		用于胎
牛血清 （FBS）	X&Y 细胞培养	FBS-500	用于 T 细胞培养
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	用于 T 细胞收获的密度梯度试剂
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	F6377	用于显微镜对准
FluoSpheres 羧酸盐修饰的微球	Thermo Fisher Scientific	F8810	用于显微镜对准
Imaris	Bitplane	N/A	跟踪软件;跟踪软件的其他选项包括 Amira 或 Trackmate（斐济）。
晶格光片显微镜	3i	N/A	显微镜 使用
莱博维茨的 L-15 培养基，无酚红	Thermo Fisher Scientific	21083027	用于成像
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030-081	用于 T 细胞培养
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy 经 Janelia Research Campus 的 Howard Hughes Medical Institute 许可使用。请联系 innovation@janelia.hhmi.org 以获取访问权限。其他反卷积和解压方法可在 Fiji、Slidebook、Amira 等图像处理软件中使用。https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth 细胞色素 C （MCC），序列 ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	定制合成	用于 T 细胞收获
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122_3683884612	用于 T 细胞培养
Poly-L-Lysine	Phenix 研究产品	P8920-100ML	用于成像
RBC 裂解缓冲液	eBioscience	00-4300-54	用于 T 细胞收获
重组小鼠 IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	用于 T 细胞培养
RPMI 1640 培养基	康宁	MT10040CV	用于 T 细胞培养
幻灯片	3i	N/A	LLSM 成像软件
手术解剖工具	Nova-Tech International	DSET10	用于 T 细胞收获
T-25 培养瓶	Eppendorf	2231710126	用于 T 细胞培养
Thermo Scientific Pierce Fab 微量制备试剂盒	Thermo Fisher Scientific	44685	用于制备 Fab