通过追踪精子核形态评估受精状态 拟南芥 双受精

摘要

我们展示了一种基于精子细胞核形态来判断受精成功或失败的方法 拟南芥 使用落射荧光显微镜观察双受精过程。

摘要

开花植物具有一种独特的有性生殖系统，称为“双受精”， 其中每个精子细胞精确地与一个卵细胞或一个中央细胞融合，因此几乎同时发生两次独立的受精事件。受精后的卵细胞和中央细胞分别发育为合子和胚乳。因此，对双受精过程的精确调控对于后续的种子发育至关重要。双受精发生在雌配子体（胚囊）中，而雌配子体深藏于厚实的胚珠和子房组织内部。这种雌蕊组织结构使得对双受精的观察与分析极为困难，导致目前关于双受精机制的许多问题仍未得到解答。对于潜在受精调控因子的功能评估，受精表型的分析至关重要。在判断拟南芥（Arabidopsis thaliana）中受精是否完成时，通常以标记精子细胞核的荧光信号形态作为指标。未能成功受精的精子细胞表现为在雌配子体外出现凝聚的荧光信号，而成功受精的精子细胞则因与雌配子体细胞核发生核融合而呈现去凝聚的荧光信号。本文所述方法提供了一种在活体条件下判断受精成功或失败的有效工具。

引言

开花植物通过双受精产生种子，该过程直接受定位于配子质膜上的蛋白质之间相互作用的调控^1,2。开花植物的雄性配子为一对精细胞，发育于花粉中。授粉后，花粉管生长并将这对精细胞递送至位于胚囊中的雌性配子——卵细胞和中央细胞。当雄性和雌性配子相遇后，配子表面的蛋白质促进识别、黏附和融合，从而完成双受精过程。在以往的研究中，已鉴定出雄性配子膜蛋白GENERATIVE CELL SPECIFIC 1（GCS1）/HAPLESS2（HAP2）^3,4和GAMETE EXPRESSED 2（GEX2）⁵分别为参与配子融合和黏附的受精调控因子。我们近期鉴定出一种雄性配子特异性的膜蛋白DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9（DMP9），其参与配子相互作用并作为受精调控因子。研究发现，DMP9 表达量的降低会导致A. thaliana双受精过程中卵细胞受精受到显著抑制⁶。

由于双受精发生在胚囊中，而胚囊嵌于胚珠内，且进一步被子房组织包裹，因此很难直接观察和分析双受精过程的各个状态。正因如此，目前仍存在许多尚未明确的环节，阻碍了对双受精调控机制的全面理解。为了对潜在的受精调控因子进行功能分析，建立可在活体条件下追踪配子行为的观察技术至关重要。近年来的研究已开发出若干标记品系，其配子的亚细胞结构可通过荧光蛋白进行标记。本文介绍一种简单且快速的实验方案，用于观察人工授粉后的雌蕊中所发生的胚囊内双受精过程。利用精子细胞核标记品系 HTR10-mRFP⁷，可根据精子核信号的形态特征来区分每个雌性配子的受精状态。本方案聚焦于受精过程中精子核的形态变化，能够高效地获取足够数量的数据以进行统计学验证。以携带 HTR10-mRFP 背景的 DMP9 基因敲低品系（DMP9^{KD/HTR10-mRFP}）作为父本植株，可展示出单受精模式。该方案同样适用于其他受精调控因子的功能分析。

方案

1. 人工授粉

注意：开始操作前，需要准备一把5号镊子。

1. 培养 A. thaliana 在生长培养箱中，22 °C 条件下，16 小时光照/8 小时黑暗循环培养（Col-0）。
   注意： 用剪刀剪除最先发育的花茎，以促进腋芽的发育。生长旺盛的植株（剪除第一花茎后2-3周，株高约25 cm）适合用于分析。
2. 去雄时，去除萼片（图1B），花瓣（图1C）和雄蕊（图1D11阶段花蕾的）⁸ (图1A使用5号镊子操作，以顶部带有少量花瓣的花蕾为最佳。
   注意： 使用合适的雌配子标记品系。在本方案中，我们以野生型植株作为母本。
3. 去雄后15至18小时，取一朵花的雄蕊 DMP9^{KD/HTR10-mRFP} 13期花⁸ 用镊子夹住灯丝。
4. 授粉时，用开裂的花药轻轻拍打去雄的雌蕊柱头数次。

2. 观察用胚珠的制备

注意：需要以下物品：贴有双面胶的载玻片、5号镊子、27 G注射针头和解剖显微镜。

1. 授粉后7至8小时（HAP），取下雌蕊并将其放置在双面胶带上，然后用镊子轻轻按压，使雌蕊固定在胶带上（图2A，A’）。
   注意：大多数胚珠在授粉后10小时（10 HAP）时已接收到至少一条花粉管⁹。如果第一条花粉管中的两个或任一精细胞未能完成受精，由于受精恢复系统的作用，胚珠会吸引第二条花粉管¹⁰。为分析第一条花粉管中精细胞核的形态，建议最迟在10 HAP前完成胚珠的制备。
2. 在解剖显微镜下，使用注射针切除子房的上下两端（图2B，B’）。
3. 用注射针针尖沿中轴胎座两侧切开子房壁（图2C，C’）。
   注意：插入注射针时应浅层操作，以防止胚珠从中轴分离。
4. 用注射针将子房壁向外翻转（图2D，D’）。
5. 用镊子夹住连接胚珠的中轴基部，并小心提起（图2E）。
6. 将胚珠转移至载玻片上的一滴水中，轻轻盖上盖玻片，用于荧光显微镜下观察（图2E，E’）。

3. 显微镜检查

注意： 在本实验方案中，我们使用了一台配备荧光滤光片组（见材料表）、数码相机及配套软件的落射荧光显微镜。

1. 使用20倍或40倍物镜及配套的数码相机，获取带有mRFP标记的精子细胞核的胚珠图像。
2. 确认胚囊中mRFP标记的精子细胞核的数量。
   注意：含有两个mRFP标记的精子细胞核的胚珠可纳入统计分析的样本量中。
3. 确认胚囊中每个mRFP标记的精子细胞核的形态和位置。
   注意：例如，精子细胞从花粉管释放后，一对浓缩态的mRFP标记的精子细胞核通常位于卵细胞与中央细胞之间；若检测到去浓缩态的mRFP标记的精子细胞核位于合点端一侧，则表明中央细胞已受精。通过使用合适的雌性配子体膜标记品系（如补充 图1所示），可清晰地监测精子细胞是否正在进行胞质融合（即膜融合后、核融合前阶段）。

结果

在授粉后7-8小时采集了用DMP9^{KD/HTR10-mRFP}授粉的雌蕊中的胚珠并进行观察。

大多数胚珠在卵细胞（珠孔端）和中央细胞（合点端）的位置分别含有两个去凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3A），表明双受精成功。此外，还观察到一些胚珠中，中央细胞核位置存在一个去凝集的mRFP标记的精子细胞核，而在卵细胞外存在一个凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3B），表明发生了单受精。在双受精失败的情况下，两个凝集的mRFP标记的精子细胞核位于卵细胞与中央细胞交界处（图3C），这与gcs1突变体的精子细胞中的现象一致（图3D）³

讨论

HTR10-mRFP 标记父本染色质（即可视化精子细胞核），其在双受精过程中的动态已有报道⁷。花粉管释放后，HTR10-mRFP 标记的精子核仍处于凝缩状态。然而，在配子膜融合后三至四小时的核融合阶段，每个精子核在与已受精的雌配子核合并时发生去凝缩⁷。未受精的精子细胞则保持凝缩状态，如在 gcs1 精子细胞因未能受精而在胚囊中停滞所示（图3D）。通常情况下，当可育的 HTR10-mRFP 作为花粉亲本时，在授粉后7-8小时（HAP），一个雌蕊中57.9% ± 17.8%（均值 ± 标准差；n = 16 个雌蕊）的胚珠含有两个 mRFP 标记的精子核信号，且几乎所有信号（97.2%）均呈去凝缩状态，反映出成功的双受精（类似信号模式见于 图3A）。在 DMP9^{KD/HTR10-mRFP} 情况下，含有两个 mRFP 标记精子核的胚珠出...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BX51	奥林巴斯		落射荧光显微镜
盖玻片	松波玻璃	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			拟南芥， HTR10-mRFP背景 Takahashi 等人 （2018）6
双面胶带	Nichiban	NW-15S	15 mm 宽
DP72	Olympus		Degital 相机
镊子	Vigor		任何 5 号镊子可用
生长室	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP<			em>拟南芥，生态型 Columbia-0 （Col-0） 背景 Ingouff 等人。2007）7
注射针	Terumo	NN-2719S	27 G
载玻	片 松波玻璃	S9443
SZX9	林巴斯		解剖显微镜
U-MRFPHQ	奥林巴斯		荧光滤光片立方体 （激发：BP535-555，发射：BA570-625，重色镜：DM565）
UPlanFL N 40x	奥林巴斯		物镜 （NA 1.3），油浸
式 UPlanSApo 20x	奥林巴斯		物镜 （NA 0.75），干式