双DNA标尺检测法被开发用于确定核糖体易位过程中mRNA的位置，该方法依赖于形成的DNA-mRNA双链解离所需的解离力。该技术具有单核苷酸分辨率，并能够到达mRNA的两端，可为核糖体易位机制提供深入见解，并可用于探测其他核酸的位移过程。
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本文内容
摘要
摘要
核糖体移位是指核糖体在mRNA上精确移动三个核苷酸（nt）的过程，这是蛋白质合成中的核心步骤。为了研究其机制，需要满足两项关键技术要求：第一是单核苷酸分辨率，能够区分正常的移位与移码现象，后者指核糖体移动的距离不是3个核苷酸；第二是能够同时探测mRNA的进入端和出口端，以阐明移位的完整过程。我们报道了一种基于DNA-mRNA双链解离临界力的双DNA标尺检测方法，该力值通过力诱导剩磁谱技术（FIRMS）获得。 双标尺检测方法具有2–4 pN的力分辨率，足以区分不同的移位步骤。通过在探针DNA上引入长连接臂，使其能够到达核糖体另一侧的mRNA，从而可同时确定mRNA在两侧的位置。因此，双标尺检测方法特别适用于研究核糖体移位，以及核酸运动的一般规律。我们展示了代表性结果，这些结果揭示了mRNA呈环状构象，并成功区分了正常移位与移码事件。
引言
生物分子位移是研究相关生物学功能机制的基本参数。一个典型例子是核糖体易位1,2，在此过程中，核糖体通常在信使RNA（mRNA）上精确移动三个核苷酸（nt），而在发生移码的情况下，则可能移动一个、两个或除三个以外的其他数量的核苷酸。因此，需要一种具有单核苷酸分辨率的分子标尺系统，以区分不同的步长。更大的挑战在于同时探测核糖体在进入端和退出端的移动情况。换句话说，只有通过双标尺系统，我们才能揭示mRNA是否平滑地穿过核糖体，或者是否存在中间步骤，即两端具有不同步长，从而导致核糖体内部形成弯曲或成环的mRNA构象。
已开发出多种方法来解决核糖体出口侧（mRNA 的 3' 端）不同步骤的解析难题。双荧光素酶检测法通过测量不同读码框产生的蛋白质比例来区分读码框3,4。但该方法仅适用于 mRNA 的 3' 端，因此不足以提供转位过程的完整图景。质谱法可分析由相应密码子重排所产生的不同肽段片段5，但无法精确定位核糖体在 mRNA 上移动的核苷酸（nt）数目。足迹分析法（toe-printing assay）是另一种常用方法，该方法利用结合在 mRNA 3' 远端的逆转录酶引物，从该位置向核糖体方向进行逆转录
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方案
1. 核糖体复合物的制备
- 配制1,000 mL TAM10缓冲液，其组分为20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM Mg(OAc)2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、5 mM EDTA、7 mM BME（2-巯基乙醇）和0.05% Tween20。
- 按照表1列出的成分分别配制五种混合物。
注：核糖体来源于MRE600菌株11。EF-Tu：热不稳定延伸因子。EF-Ts：热稳定延伸因子。GTP：三磷酸鸟苷。PEP：磷酸烯醇式丙酮酸。 - 在制备核糖体复合物前，将上述五种混合物分别于37 °C孵育25分钟。按照表2制备五种核糖体复合物。
注：Post：转位后；Pre：转位前。 - 将每种核糖体复合物分别以1:1的体积比加至1.1 M蔗糖垫上，使用超速离心机在450,000 × g 条件下离心2小时进行纯化。离心后用移液器弃去上清液，用TAM10缓冲液重悬沉淀，随后将核糖体复合物在-80 °C保存。
2. 生物素包被玻片的制备
- 玻璃片的初步清洗
- 将12片尺寸为60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
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结果
图1展示了检测原理及主要组件的照片。磁信号检测通过使用扫描方案的原子磁力计实现（图1A）13。样品被放置在安装于直线电机上的杆上。电机将样品送入磁屏蔽室内的原子传感器中，检测完成后将其送回原位以便卸载。在样品扫描过程中，原子磁力计检测磁信号并生成信号轨迹，当样品最接近传感器时，信号达到最大值。图1B展示了整个仪器的照片。图1C和图1D分别展示了用于磁化处理的磁化站以及用于施加离心力的离心机的照片。
双DNA标尺检测的原理如图2所示。核糖体复合物通过mRNA的5'端固定在表面。设计两条DNA标尺以精确探测核糖体的位置，每条分别对应mRNA的一侧。当前的固定方式使得mRNA的3'侧易于被DNA标尺探及，.......
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讨论
在我们的双标尺检测中，磁性微珠发挥着两个关键作用。首先，它们作为力的传感器，因为离心力与微珠的浮力质量成正比。其次，微珠作为信号载体，可被原子磁力计检测，后者是目前最灵敏的磁传感器。通过结合机械操控与磁性检测，FIRMS技术能够根据分子相互作用的关键解离力分辨大量分子相互作用，这正是DNA标尺的基础。双标尺检测特别适用于在mRNA移位过程中探测其两侧。由于该方法是一种仅依赖双链结构形成的物理手段，因此不受mRNA序列或其他生物学限制因素的制约，相较于依赖生化反应的其他技术具有明显优势。我们已证明，通过使用较长的连接分子，标尺可到达目标结合位点以确定mRNA的位置。具体而言，对于核糖体，连接分子长度为50个胸腺嘧啶（50 T），对应约17 nm的长度，这一尺寸与核糖体的大小非常接近17。所用抗生素的浓度均为文献中常见的典型值。此外，我们的方法也可用于揭示这些抗生素功能起始的阈值浓度。
双尺分析法有两个关键方面。其一是用于分子固定及后续生物反应的精细功能化表面。每次加样和洗涤步骤都应尽量减少对表面的扰动，以确保固定在表面的分子保持完整。对.......
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披露
作者未报告存在潜在的利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R01GM111452，Y.W.，S.X.）提供资助。Y. W. 感谢威尔奇基金会（E-1721）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 苯乙烯条 | 工业市 | MS-861 | |
| 玻璃载片 | 蒸发镀膜公司 | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| 乙酸 | 默克生命科学 | A6283-500ML | |
| 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 | UCT 特种产品公司 | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| 生物素-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| 碳酸氢钠 | 默克生命科学 | S5761-500G | |
| 环氧胶 | Devcon | 31345 | |
| 链霉亲和素 | 赛默飞世尔科技 | 434301 | |
| 夫西地酸 | 默克生命科学 | F0756-1G | |
| 硫酸新霉素 | 默克生命科学 | 1458009 | |
| 硫酸卷曲霉素 | 默克生命科学 | 1715000 | |
| 潮霉素 | 英潍捷基 | 10687-010 | |
| Tris-HCl | 默克生命科学 | T5941-100G | |
| 乙酸镁 | 默克生命科学 | M5661-50G | |
| 氯化铵 | 默克生命科学 | A9434-500G | |
| 氯化钾 | 默克生命科学 | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-巯基乙醇 | 默克生命科学 | M6250-500ML | |
| Tween20 | 默克生命科学 | P1379-250ML | |
| GTP | 默克生命科学 | G8877-100MG | |
| PEP | 默克生命科学 | P7127-100MG | |
| 丙酮酸激酶 | 默克生命科学 | P1506-5KU | |
| 蔗糖 | 默克生命科学 | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 链霉亲和素 | 赛默飞世尔科技 | 11205D | |
| mRNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| 离心机 | Eppendorf | 5427R | |
| 微型超速离心机 | 日立 | CS150FNX | |
| 涡旋混合器 | VWR | VM-3000 | |
| 锁相放大器 | 斯坦福研究系统公司 | SR530 | |
| 锁相放大器 | 斯坦福研究系统公司 | SR830 | |
| 激光器 | 纽波特 | TLB-6918-D | |
| 函数发生器 | 斯坦福研究系统公司 | DS345 | |
| 光电探测器 | Thorlabs | DET36A |
参考文献
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F.
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重印与许可
