小鼠眼表原代细胞/干细胞对紫外-C（UV-C）损伤所致氧化损伤的评估

摘要

本方案展示了在小鼠眼表细胞的原代活体培养物中，同时检测活性氧（ROS）、活细胞和死细胞的方法。分别使用2',7'-二氯荧光素双乙酸酯、碘化丙啶和Hoechst染色来评估活性氧、死细胞和活细胞，随后进行成像与分析。

摘要

由于各种环境因素的影响，眼表经常受到磨损。暴露于紫外-C（UV-C）辐射是职业健康危害之一。本文中，我们演示了小鼠眼表来源的原代干细胞暴露于UV-C辐射的实验方法。活性氧（ROS）的生成量用于反映氧化应激/损伤的程度。在体外实验条件下，评估由氧化应激导致的死亡细胞百分比也至关重要。本文将演示经UV-C照射的小鼠眼表原代干细胞的2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色，以及基于DCFDA荧光图像的定量分析。DCFDA染色直接反映ROS的生成水平。我们还通过同时使用碘化丙啶（PI）和Hoechst 33342分别对死细胞和活细胞进行染色，演示了活细胞与死细胞的定量分析，并计算DCFDA（ROS阳性）细胞和PI阳性细胞的百分比。

引言

眼表（OS）是一个功能单位，主要由角膜的外层和腺体上皮、泪腺、睑板腺、结膜、部分眼睑边缘以及传递信号的神经支配共同构成¹。透明的圆顶状角膜层可将光线聚焦到视网膜上。这一无血管组织由上皮细胞、角质形成细胞和内皮细胞等细胞成分以及胶原蛋白和糖胺聚糖等非细胞成分组成²。该区域通过泪液引流，同时泪液也提供大部分营养物质。由于眼表在解剖位置上直接暴露于外界环境，常接触到强光、微生物、灰尘颗粒和化学物质等多种严苛因素，因此易受物理性损伤，并易发生多种疾病。

氧化应激是由于活性氧（ROS）的生成与内源性抗氧化防御机制之间失衡所致³。ROS分为活性分子和自由基两类，均通过线粒体氧化磷酸化由分子氧（O₂）衍生而来⁴。前者包括非自由基类物质，如过氧化氢（H₂O₂）、单线态氧（¹O₂）；后者则包括超氧阴离子（O₂^-）和羟基自由基（^•OH）等。这些分子是正常细胞过程的副产物，参与多种重要生理功能，如信号转导、基因表达和宿主防御⁵。已知在病原体入侵、外源性化学物质以及紫外线（UV）辐射暴露等因....

方案

实验采用来自瑞士白化小鼠眼球的原代眼细胞/干细胞进行。本实验采集小鼠眼球所用的动物已获得叶内波亚（ deemed to be University）机构动物伦理委员会批准（IEAC 批准编号：6a/19.10.2016）。

1. 试剂的准备

注意：从小鼠眼表分离原代细胞/干细胞不在本实验方案的范围之内。因此，本文仅演示紫外线C（UV-C）照射剂量、用于检测活性氧（ROS）、活细胞与死细胞及其定量的试剂配制。有关配制终末染色液所需添加的试剂（10% 胎牛血清、DCFDA、Hoechst 和碘化丙啶储备液）相应体积，请参见表1。

1. 通过将25 mg DCFDA粉末溶解于5.13 mL DMSO中，配制10 mM DCFDA储备液。将溶液分装至棕色1.5 mL离心管中，每管250 µL，于-20 °C保存。
2. 通过将25 mg瓶装Hoechst 33342全部溶解于2.5 mL去离子水中，配制10 mg/mL（16.23 mM）Hoechst 33342储备液。将溶液分装至棕色微量离心管中，每管100 µL，于2–6 °C保存，可稳定保存长达6个月。如需长期保存，请置于-20 °C。
3. 用去离子水配制1 mg/mL的碘化丙啶储备液，每管1 mL分装至棕色1.5 mL离心管中，于4 °C保存。

结果

DCFDA 是一种无色染料，为荧光素的化学还原形式，用作检测细胞内活性氧（ROS）的指示剂。该染料可被细胞截留，并易于氧化为具有荧光的二氯二氢荧光素（DCF），后者发出绿色荧光。该荧光可通过荧光显微镜进行检测。细胞的状态可依据荧光特征与 ROS 的积累情况进行如下判读：（i）无 ROS 的活细胞发出强烈的蓝色荧光；（ii）有 ROS 积累的活细胞发出强烈的蓝色荧光和微弱的绿色荧光；（iii）有 ROS 积累的死细胞发出微弱的蓝色荧光，同时伴有强烈的红色和绿色荧光。

对照细胞和暴露于1 J/m² UV-C的细胞均未出现DCFDA/ROS和PI阳性细胞。未暴露于UV-C的对照组仅显示Hoechst染色指示的细胞核染色（图1）。然而，在未暴露于UV-C的对照细胞中未观察到PI或DCFDA阳性细胞（图1）。

暴露于100 J/m² UV-C的细胞表现出较低的活性氧（ROS）.......

讨论

本文所述的DCFDA染色方法可用于观察经UV-C辐射处理的小鼠原代眼组织活细胞中的活性氧（ROS）。该染色方法的一个优势在于，研究人员可同时研究UV-C照射后3小时的即时效应，并对活细胞中ROS阳性细胞及死细胞的比例进行同步计数。此外，由于该染色方法适用于活细胞，染色后的细胞可在相同培养基中继续孵育较长时间（数天），以便研究UV-C辐射的延迟效应。因此，该染色方法能够在倒置荧光显微镜下可视化ROS的产生（绿色荧光），并同时区分活细胞、凋亡细胞和死细胞群体。然而，在某些情况下，尽管预期可观察到ROS阳性及PI阳性细胞，但仍可能出现无法成功成像的情况。对此类情况，建议进行故障排查（表2）。

为获得最佳结果，必须准确执行本方案。最佳结果表明，绿色荧光信号的发射/活性氧的生成与特定UV-C剂量诱导的DNA损伤之间存在相关性，可作为准确的读数指标。换句话说，在执行此步骤时，细胞在UV-C照射期间所接触的培养基体积不应过多，以免UV-C剂量无法引发所需的损伤。因此，应保持最小量的培养基，例如每个35 mm培养皿中加入500 µL，仅需足以覆盖细胞即可，以确保在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）	Sigma	D6883	2',7'-二氯荧光素二乙酸酯是一种可产生荧光的探针，能够穿透细胞膜，用于活性氧物种的定量检测。
细胞培养皿（35 mm）	Eppendorf	SA 003700112	用于细胞培养的无菌培养皿。
DMEM高糖培养基	HiMedia	AT007	最常用的细胞培养基之一，含有4500 mg/L葡萄糖。
胎牛血清，欧盟来源	HiMedia	RM99955	细胞培养基中最重要的成分之一，提供生长因子、氨基酸、蛋白质、脂溶性维生素（如A、D、E和K）、碳水化合物、脂类、激素、矿物质及微量元素。
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	用作补充剂，是L-谷氨酰胺的替代物，有助于提高细胞活力和生长。
HL-2000 Hybrilinker	UVP		杂交炉/紫外交联仪
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst染料可穿透活细胞和死细胞，能够结合双链DNA，不受细胞死活状态影响。
Matrigel	Corning		基底膜基质
MEM非必需氨基酸（100倍浓缩液）	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	作为补充剂使用，可促进细胞生长并提高细胞存活率。
青霉素-链霉素（Pen-Strep）	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	青霉素和链霉素用于防止细胞培养中的细菌污染。
碘化丙啶	Sigma	P4170	一种荧光染料，仅能穿透死细胞，可与DNA结合，用于区分活细胞与死细胞。
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		温和的细胞解离试剂
ZOE荧光细胞成像仪	Bio-rad