小鼠眼表原代细胞/干细胞对紫外-C（UV-C）损伤所致氧化损伤的评估

摘要

本方案展示了在小鼠眼表细胞的原代活体培养物中，同时检测活性氧（ROS）、活细胞和死细胞的方法。分别使用2',7'-二氯荧光素双乙酸酯、碘化丙啶和Hoechst染色来评估活性氧、死细胞和活细胞，随后进行成像与分析。

摘要

由于各种环境因素的影响，眼表经常受到磨损。暴露于紫外-C（UV-C）辐射是职业健康危害之一。本文中，我们演示了小鼠眼表来源的原代干细胞暴露于UV-C辐射的实验方法。活性氧（ROS）的生成量用于反映氧化应激/损伤的程度。在体外实验条件下，评估由氧化应激导致的死亡细胞百分比也至关重要。本文将演示经UV-C照射的小鼠眼表原代干细胞的2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色，以及基于DCFDA荧光图像的定量分析。DCFDA染色直接反映ROS的生成水平。我们还通过同时使用碘化丙啶（PI）和Hoechst 33342分别对死细胞和活细胞进行染色，演示了活细胞与死细胞的定量分析，并计算DCFDA（ROS阳性）细胞和PI阳性细胞的百分比。

引言

眼表（OS）是一个功能单位，主要由角膜的外层和腺体上皮、泪腺、睑板腺、结膜、部分眼睑边缘以及传递信号的神经支配共同构成¹。透明的圆顶状角膜层可将光线聚焦到视网膜上。这一无血管组织由上皮细胞、角质形成细胞和内皮细胞等细胞成分以及胶原蛋白和糖胺聚糖等非细胞成分组成²。该区域通过泪液引流，同时泪液也提供大部分营养物质。由于眼表在解剖位置上直接暴露于外界环境，常接触到强光、微生物、灰尘颗粒和化学物质等多种严苛因素，因此易受物理性损伤，并易发生多种疾病。

氧化应激是由于活性氧（ROS）的生成与内源性抗氧化防御机制之间失衡所致³。ROS分为活性分子和自由基两类，均通过线粒体氧化磷酸化由分子氧（O₂）衍生而来⁴。前者包括非自由基类物质，如过氧化氢（H₂O₂）、单线态氧（¹O₂）；后者则包括超氧阴离子（O₂^-）和羟基自由基（^•OH）等。这些分子是正常细胞过程的副产物，参与多种重要生理功能，如信号转导、基因表达和宿主防御⁵。已知在病原体入侵、外源性化学物质以及紫外线（UV）辐射暴露等因素刺激下，ROS的生成会显著增加⁴。ROS的过度生成将导致氧化应激，进而引起核酸、蛋白质和脂质等分子的损伤⁶。

自然阳光是紫外线辐射最主要的来源，包含紫外线A（UV-A，400–320 nm）、紫外线B（UV-B，320–290 nm）和紫外线C（UV-C，290–200 nm）⁷。已有研究报道，波长与光谱能量之间存在反比关系。尽管自然环境中的UV-C辐射会被大气层吸收，但诸如汞灯和焊接设备等人工光源会发射UV-C，因而构成职业性危害。眼部暴露后的症状包括光性角膜炎和光性角结膜炎⁸。活性氧（ROS）的产生是紫外线诱导细胞损伤的主要机制之一⁹。在本研究中，我们采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色法检测暴露于UV-C的小鼠原代眼表细胞/干细胞中的ROS水平，并通过荧光显微镜捕捉绿色荧光信号。同时使用两种染料对细胞进行复染：Hoechst 33342标记活细胞，红色碘化丙啶标记死细胞。

方案

实验采用来自瑞士白化小鼠眼球的原代眼细胞/干细胞进行。本实验采集小鼠眼球所用的动物已获得叶内波亚（ deemed to be University）机构动物伦理委员会批准（IEAC 批准编号：6a/19.10.2016）。

1. 试剂的准备

注意：从小鼠眼表分离原代细胞/干细胞不在本实验方案的范围之内。因此，本文仅演示紫外线C（UV-C）照射剂量、用于检测活性氧（ROS）、活细胞与死细胞及其定量的试剂配制。有关配制终末染色液所需添加的试剂（10% 胎牛血清、DCFDA、Hoechst 和碘化丙啶储备液）相应体积，请参见表1。

1. 通过将25 mg DCFDA粉末溶解于5.13 mL DMSO中，配制10 mM DCFDA储备液。将溶液分装至棕色1.5 mL离心管中，每管250 µL，于-20 °C保存。
2. 通过将25 mg瓶装Hoechst 33342全部溶解于2.5 mL去离子水中，配制10 mg/mL（16.23 mM）Hoechst 33342储备液。将溶液分装至棕色微量离心管中，每管100 µL，于2–6 °C保存，可稳定保存长达6个月。如需长期保存，请置于-20 °C。
3. 用去离子水配制1 mg/mL的碘化丙啶储备液，每管1 mL分装至棕色1.5 mL离心管中，于4 °C保存。

2. 细胞铺板与UV-C辐射处理

1. 接种前，使用温和的细胞解离试剂（材料表）解离本实验室分离的小鼠原代眼表细胞（未发表结果；此类细胞为角膜上皮细胞、基质细胞和角质细胞的混合物）。
2. 将 0.2 × 10⁶ 个小鼠原代眼表细胞接种于 35 mm 经 0.2% 基底膜基质包被的细胞培养皿中，加入 2.5 mL 完全培养基。于 37 °C、5% CO₂ 及湿润环境中孵育过夜。
   注意：培养小鼠眼表原代细胞的完全培养基由含 20% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（Pen-strep）、1% Glutamax、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% 丙酮酸钠和 0.1% β-巯基乙醇的高糖 DMEM 组成。
3. 在将细胞暴露于不同剂量的 UV-C 之前，弃去尽可能多的培养基，仅保留一层薄薄的培养基（约 500 µL）与细胞接触，刚好覆盖细胞即可。
4. 将培养皿逐个转移至 UV-C 光源/照射室（杂交炉/紫外交联仪的下层腔室；材料表）。将培养皿放入腔室内并取下皿盖。保持皿盖敞开状态可确保细胞在 UV-C 照射期间接受最大剂量的辐射。
5. 将细胞暴露于不同等级/剂量的 UV-C：1 J/m²、100 J/m²、1,000 J/m² 和 10,000 J/m²。
6. UV-C 照射后，立即重新盖上每个培养皿的皿盖，并将其从 UV-C 光源室中取出。
7. 将每个培养皿转移至超净工作台，向每个培养皿中补充 2 mL 新鲜完全培养基。
8. 将细胞在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 3 小时。UV-C 照射后孵育 3 小时是观察和量化早期效应的最佳时间。

3. 活细胞染色培养基的制备

1. 在UV-C照射后3小时细胞孵育的最后15分钟内，新鲜配制染色液。
2. 将含10% FBS的DMEM培养基（添加1%青霉素-链霉素）预热至37 °C，取10 mL备用。
3. 加入5 μL 10 mM DCFDA、5 μL 10 mg/mL Hoechst溶液和200 μL 1 mg/mL碘化丙啶。最终在10 mL染色液中，DCFDA、Hoechst和PI的终浓度分别为5 μM、5 μg/mL和20 μg/mL。

4. 紫外线C照射后的小鼠原代眼细胞DCFDA染色

1. 将经不同剂量UV-C照射的小鼠原代眼细胞在孵育3小时后，吸去35 mm培养皿中的培养基。
2. 从培养皿侧边轻柔地向每个培养皿中加入2 mL freshly prepared DCFDA染色培养基。
3. 将细胞在37 °C CO₂培养箱中避光孵育15分钟，以完成活细胞染色。

5. 观察经DCFDA（ROS）、Hoechst和PI染色的细胞

1. 孵育结束后，弃去染色液。
2. 向细胞中加入新鲜的完全培养基，并在倒置荧光显微镜/细胞成像仪（材料表）下观察细胞。拍摄所需视野的图像：明场、蓝色荧光、红色荧光、绿色荧光。
   注意：蓝色荧光染色的细胞为细胞核，绿色荧光代表产生活性氧（ROS）的细胞，红色荧光表示碘化丙啶（PI）阳性的死亡细胞。

6. 使用成像技术对染色细胞（Hoechst-蓝色、PI-死亡细胞和Green-ROS）进行定量分析

1. 将倒置荧光显微镜/细胞成像仪下拍摄的图像导出至 ImageJ 进行定量分析。
2. 依次打开每张图像，并逐个使用各通道（即蓝色（细胞核/Hoechst）、绿色（ROS）、红色（死亡细胞/PI 阳性））进行计数。从未暴露的对照组开始，依次进行 1、100、1,000 和 10,000 J/m^-2 的处理组。
3. 使用软件菜单中标记为十字形的细胞计数工具，在每张图像的各个视野中分别对各处理组对应的细胞进行计数（蓝色阳性（Hoechst 阳性；细胞核）、红色阳性（PI 阳性；死亡细胞）、绿色阳性（ROS））。
4. 通过点击每个视野中特定的信号来进行计数。例如，点击蓝色/Hoechst 染色的细胞核，可获得该视野中的细胞核总数。
5. 将结果计算为紫外线损伤导致的细胞死亡率（PI 阳性细胞数 × 100 ÷ Hoechst 阳性细胞数）和紫外线损伤诱导的 ROS 生成率（DCFDA 阳性细胞数 × 100 ÷ Hoechst 阳性细胞数）。

结果

DCFDA 是一种无色染料，为荧光素的化学还原形式，用作检测细胞内活性氧（ROS）的指示剂。该染料可被细胞截留，并易于氧化为具有荧光的二氯二氢荧光素（DCF），后者发出绿色荧光。该荧光可通过荧光显微镜进行检测。细胞的状态可依据荧光特征与 ROS 的积累情况进行如下判读：（i）无 ROS 的活细胞发出强烈的蓝色荧光；（ii）有 ROS 积累的活细胞发出强烈的蓝色荧光和微弱的绿色荧光；（iii）有 ROS 积累的死细胞发出微弱的蓝色荧光，同时伴有强烈的红色和绿色荧光。

对照细胞和暴露于1 J/m² UV-C的细胞均未出现DCFDA/ROS和PI阳性细胞。未暴露于UV-C的对照组仅显示Hoechst染色指示的细胞核染色（图1）。然而，在未暴露于UV-C的对照细胞中未观察到PI或DCFDA阳性细胞（图1）。

暴露于100 J/m² UV-C的细胞表现出较低的活性氧（ROS）...

讨论

本文所述的DCFDA染色方法可用于观察经UV-C辐射处理的小鼠原代眼组织活细胞中的活性氧（ROS）。该染色方法的一个优势在于，研究人员可同时研究UV-C照射后3小时的即时效应，并对活细胞中ROS阳性细胞及死细胞的比例进行同步计数。此外，由于该染色方法适用于活细胞，染色后的细胞可在相同培养基中继续孵育较长时间（数天），以便研究UV-C辐射的延迟效应。因此，该染色方法能够在倒置荧光显微镜下可视化ROS的产生（绿色荧光），并同时区分活细胞、凋亡细胞和死细胞群体。然而，在某些情况下，尽管预期可观察到ROS阳性及PI阳性细胞，但仍可能出现无法成功成像的情况。对此类情况，建议进行故障排查（表2）。

为获得最佳结果，必须准确执行本方案。最佳结果表明，绿色荧光信号的发射/活性氧的生成与特定UV-C剂量诱导的DNA损伤之间存在相关性，可作为准确的读数指标。换句话说，在执行此步骤时，细胞在UV-C照射期间所接触的培养基体积不应过多，以免UV-C剂量无法引发所需的损伤。因此，应保持最小量的培养基，例如每个35 mm培养皿中加入500 µL，仅需足以覆盖细胞即可，以确保在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）	Sigma	D6883	2',7'-二氯荧光素二乙酸酯是一种可产生荧光的探针，能够穿透细胞膜，用于活性氧物种的定量检测。
细胞培养皿（35 mm）	Eppendorf	SA 003700112	用于细胞培养的无菌培养皿。
DMEM高糖培养基	HiMedia	AT007	最常用的细胞培养基之一，含有4500 mg/L葡萄糖。
胎牛血清，欧盟来源	HiMedia	RM99955	细胞培养基中最重要的成分之一，提供生长因子、氨基酸、蛋白质、脂溶性维生素（如A、D、E和K）、碳水化合物、脂类、激素、矿物质及微量元素。
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	用作补充剂，是L-谷氨酰胺的替代物，有助于提高细胞活力和生长。
HL-2000 Hybrilinker	UVP		杂交炉/紫外交联仪
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst染料可穿透活细胞和死细胞，能够结合双链DNA，不受细胞死活状态影响。
Matrigel	Corning		基底膜基质
MEM非必需氨基酸（100倍浓缩液）	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	作为补充剂使用，可促进细胞生长并提高细胞存活率。
青霉素-链霉素（Pen-Strep）	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	青霉素和链霉素用于防止细胞培养中的细菌污染。
碘化丙啶	Sigma	P4170	一种荧光染料，仅能穿透死细胞，可与DNA结合，用于区分活细胞与死细胞。
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		温和的细胞解离试剂
ZOE荧光细胞成像仪	Bio-rad