方法文章

基于天然自发荧光的sFLIM技术测量植物切片中荧光探针与木质素的相互作用

DOI：

10.3791/59925

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2020年1月2日

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1PICT Platform, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2Fractionation of AgroResources and Environment (FARE) Laboratory, INRA, Université de Reims Champagne-Ardenne, 3Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, Université de Lille

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种原创的实验装置，该装置结合光谱和荧光寿命测量，用于在厚的植物切片中直接评估基于罗丹明的荧光探针与木质素聚合物之间的弗斯特共振能量转移（FRET）。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在木质纤维素生物质（LB）中，由于水解过程中酶与木质素之间产生非特异性相互作用，导致酶远离其底物，从而限制了酶的活性。因此，在LB等复杂底物中，表征这些复杂相互作用仍是一项挑战。本方法通过检测荧光标记分子与天然自荧光木质素之间的分子相互作用，利用荧光共振能量转移（FRET）技术揭示其机制。与在活细胞中使用两种外源性荧光团进行FRET测量不同，利用木质素在植物中进行FRET测量并不简单，因其具有复杂的自荧光特性。我们开发了一种原创的采集与分析流程，通过关联荧光的两个互补特性——荧光发射和荧光寿命，进行同步观测。光谱-荧光寿命成像显微技术（sFLIM）能够以高灵敏度定量这些相互作用，揭示生物分子与木质素之间不同程度的相互作用水平。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将木质纤维素水解为葡萄糖等单糖需要酶的参与。已知酶的活性会受到酶与木质素之间形成非特异性相互作用的限制1,2，其中木质素是一种疏水性聚合物，也是木质纤维素的主要组分之一3。因此，在细胞尺度上直接定量测量此类相互作用是一项亟待解决的挑战，对于优化酶的催化活性和木质纤维素预处理具有重要意义4。

弗örster（或荧光）共振能量转移（FRET）测量是原位评估生物分子相互作用的首选方法。这种非辐射能量转移可在供体与受体荧光团之间发生，但需满足若干条件。供体的发射光谱必须至少部分地与受体的激发光谱重叠，因此此类实验中荧光团的选择至关重要。此外，能量转移效率随两者间距的六次方成反比下降5，且仅当两个分子处于近距离（通常在纳米尺度范围内）时才能发生。其他因素也可能影响转移效率，例如偶极-偶极取向，但如果荧光团具有一定的柔性，则这些影响可被减弱。

FRET 可通过不同技术进行测量，相关详细描述可在文献中找到6,7。简而言之，主要方法包括：i) 敏化发射，即检测受体发射荧光的变化，该方法主要提供定性结果；ii) 受体光漂白，即测量受体光漂白前后供体发射荧光的变化（该方法可获得更精确的 FRET 估计值，但需要对固定样品施加较强的激光功率）；以及 iii) 寿命测量，即在受体存在时供体的荧光寿命会缩短。该方法需要专用仪器，但可实现对荧光团之间相互作用的精确且灵敏的测量。在考虑荧光探针与木质纤维素之间的 FRET 测量时，主要困难在于木质纤维素并非单一且特征明确的荧光团：它具有强烈的本底荧光，光谱范围宽，主要来源于木质素，且其荧光特性依赖于生物质的物种8,9。

本文提出了一种适用于木材/植物样品切片的新颖原创方法。该基于sFLIM的技术为在天然木质纤维素样品中对荧光探针与木质素之间进行定量FRET测量开辟了道路。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 样品制备

注意：样本制备的连续步骤见图1。

  1. 植物样品制备
    1. 从木材树干或碎片中，使用剃刀切取1 cm长的样品，注意不要破坏其结构。
    2. 将样品浸入聚乙二醇（PEG）介质中，通过将其依次浸入浓度递增的PEG水溶液中，直至达到100% PEG。
      1. 将样品置于真空条件下以去除水分。
      2. 在30% v/v PEG中轻轻搅拌样品24小时。
      3. 在50% v/v PEG中轻轻搅拌样品24小时。
      4. 在70 °C下于100% PEG中轻轻搅拌样品24小时（纯PEG在室温下为固态）。
    3. 将样品置于70 °C的胶囊中（置于加热板上），并逐步降温至室温。
    4. 使用切片机和一次性刀片，小心地从这些PEG包埋块上制备30–60 µm厚度的平整切片。
    5. 将切片依次在三份蒸馏水中各清洗5分钟，以去除切片中的PEG。
  2. 荧光探针制备
    1. 配制pH 6.0的30 mM磷酸盐缓冲液。
    2. 称取PEG-罗丹明-葡聚糖-罗丹明探针粉末。
    3. 将探针粉末加入缓冲液中，在避光条件下持续搅拌1小时，使其在玻璃小瓶中完全溶解，最终浓度为0.1 g/L。
  3. 植物样品染色
    1. 将切片与500 µL荧光探针溶液（见1.2.3步骤）在塑料管中避光孵育72小时（无需搅拌），每管不超过3个切片。
    2. 用毛笔取出切片，用干净滤纸吸去多余缓冲液（避免切片干燥），然后将孵育后的切片置于盖玻片与#1.5H载玻片之间进行封片。

2. 荧光寿命与光谱测量系统的校准

注意：sFLIM 测量的完整工作流程见图2。

  1. 确定 sFLIM 探测器的光谱窗口宽度。
    1. 将尿素晶体放入带有 0.17 µm 玻璃底的培养盒中。
    2. 将培养盒置于显微镜样品架上，并选择 20 倍物镜。
    3. 选择波长为 900 nm、功率为 2% 的钛蓝宝石激光器，并开启扫描功能。
    4. 在 sFLIM 探测器上采集二次谐波信号。
      注：二次谐波信号的发射波长恰好为激发波长的一半，即 450 nm；尽管该信号是瞬时的，但也可用于提供系统的仪器响应函数。
    5. 逐步将激光激发波长从 900 nm 调整至 980 nm，直至二次谐波信号被采集到第二个光谱通道（462.5 nm）中。
    6. 确定光谱窗口宽度（12.5 nm）。
    7. 如果光谱范围与预期不符，请通过以下步骤进行故障排查。
      1. 将激光器调整至 910 nm。
      2. 使用滚轮调节光栅位置，使二次谐波信号仅在第一通道被检测（第一通道边界）。
      3. 将激光器调整至 935 nm。
      4. 使用滚轮调节光栅位置，使二次谐波信号仅在第一通道被检测（第二通道边界）。
  2. 整体光谱仪通道的校准
    1. 在显微镜载物台上插入反射镜。
    2. 选择可见连续激光器（458 nm，1% 功率）。
    3. 在 sFLIM 探测器上采集反射信号，并检查光子是否在正确的光谱通道中被检测到。
    4. 对所有可用的连续激光器（514 nm、561 nm 和 633 nm）重复步骤 2.2.2 和 2.2.3。
    5. 如果光谱通道与预期不符，使用滚轮调节光栅位置，并重复步骤 2.1 和 2.2。

3. 样品荧光表征

  1. 在配备薄膜支架附件的荧光分光光度计中（例如 Jasco FP-8500 仪器），放置植物切片样品（未与荧光探针孵育的样品）。
  2. 通常在 250–550 nm 的激发波长范围内激发样品，同时测量 300–600 nm 范围内的荧光发射。
  3. 绘制荧光强度随激发和发射波长变化的图谱，以获得三维荧光图谱。
  4. 从图谱中确定最大激发/发射区域。

4. 光谱FRET测量

  1. 自发荧光校准
    1. 选择 20 倍物镜（NA：0.8）。
    2. 将双光子激光激发波长设置为 750 nm。
    3. 将仅含小麦秸秆（WS）的植物切片置于载玻片与盖玻片之间。
    4. 在软件中应用以下参数：切换至 lambda 模式，选择光谱探测器 ChS，分辨率为 9.7 nm，光谱范围设定为 420 至 722 nm。
    5. 采集图像。
    6. 确定供体发射峰（本实验设置下为 470 nm）。
  2. 受体校准
    1. 将基于罗丹明的荧光探针置于底部为 0.17 µm 玻璃的培养皿中。
    2. 使用相同设置采集图像。
    3. 确定受体发射峰（本实验设置下为 570 nm）。
  3. 确定“仅 WS”信号最强且无受体信号的光谱范围，作为 sFLIM 测量中的供体单独发射范围（本实验设置下为 460–490 nm）。
  4. 样品测量
    1. 将染色后的植物切片置于载玻片与盖玻片之间。
    2. 使用相同设置采集图像。
    3. 保存 lsm 文件。
    4. 通过与“仅 WS 样品”相比供体发射峰降低、与罗丹明样品相比受体发射峰升高，定性判断是否存在强烈的 FRET 事件。

5. sFLIM 测量

注意：对于sFLIM系统，所使用的是此前描述过的时间域sFLIM系统10。可采用正置显微镜以及不同的时间相关单光子计数卡和共聚焦显微镜厂商的设备，具体方案应相应调整。

  1. 将系统切换至 sFLIM 模式。
    1. 按照 4.1.1 和 4.1.2 中所述设置共聚焦显微镜。
    2. 在软件中切换至非解扫描模式，以将荧光光子导向 sFLIM 探测器。
    3. 将 sFLIM 采集设置为启用模式，以允许 SPC150 进行光子计数。
    4. 在 SPC150 上选择 30 秒的采集时间。
    5. 检查 CFD 是否在 1 × 105 到 1 × 106 之间。
      注意：确保 TCSPC 卡上检测到的光子数始终低于激光激发频率的 1%（在本实验系统中，激光激发频率为 80 MHz，为避免堆积效应，任何像素的检测速率不得超过 800 kHz11）。
  2. 将仅含 WS 的植物切片置于载玻片与盖玻片之间。
    1. 将软件设置为连续模式，以允许激光扫描。
    2. 在样品上选择测量区域。
    3. 点击 SPC150 上的开始按钮。
    4. 保存 sdt 文件。
    5. 每种条件下至少重复该过程 10 次。
  3. 将染色后的植物切片置于载玻片与盖玻片之间。
    1. 重复步骤 5.2.1 至 5.2.5。

6. sFLIM 分析

  1. 选择在“仅WS”条件下采集的sFLIM数据文件，并将其导入SPCImage软件中 文件 | 导入.
  2. 选择拟合参数。
    1. 从 选项 | 模型，选择 不完全多指数函数: 12.5 ns
    2. 从 选项 | 首选项，选择 自动计算仪器响应.
    3. 从主面板右侧菜单中选择双指数拟合模型：
      Exponential decay formula; diagram for IRF convolution fitting in transient absorption spectroscopy.
  3. 对于每个通道，应用拟合模型并将拟合参数保存到电子表格中（a1，一个2，t1，t2).
  4. 为比较不同通道和实验之间的差异，使用电子表格计算平均荧光寿命（Tm):
    Weighted mean equation, Tm formula, symbols and calculations, educational math reference.
  5. 计算所有通道中所有样本（至少10个）的平均寿命。
    1. 分析 Tm 在供体通道（通道1至通道3：460-490 nm）上检测，并确定显示最高光子数且对应于木质素最大发射波长的专用通道（通道2，对应467.5 - 480 nm）。步骤6.7中必须使用通道2的数值。
  6. 在染色的WS上选择获取的sFLIM数据文件，并将其导入SPCImage软件。
    1. 重复步骤 6.1–6.4。
  7. 计算FRET效率EFRET 前一个选定通道中的供体 WS 单独（TmD) 以及染色的植物样品（TmDA):
    FRET efficiency equation E_FRET in fluorescence resonance energy transfer study for molecular interaction.
  8. 比较 sFLIM 与 E荧光共振能量转移 WS 与样本之间的数值差异。
    1. 考虑一个阳性E荧光共振能量转移 与WS和待分析样品之间均一的寿命减少相关联的FRET事件（参见代表性结果及Spriet等人研究）12 和 Terryn 等人10 详情见上文）。
    2. 将终生衰减的差异归因于FRET与木质素压缩程度的共同影响，而非分子间相互作用。
    3. 将无寿命变化视为未检测到可测量的FRET信号，而非与木质素无相互作用

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了展示sFLIM技术解析木质素与荧光标记分子之间分子相互作用的能力，我们首先使用了三种不同的样品（图3）：天然小麦秸秆（WS）、与罗丹明标记的聚乙二醇（PR10）孵育后的天然小麦秸秆，以及与罗丹明标记的葡聚糖（DR10）孵育后的天然小麦秸秆。已知PR10可与木质素发生相互作用，而DR10则应呈惰性13,14,15。sFLIM曲线（图3，上图）显示了参考样品（WS）与两种相互作用情况（DR10和PR10）之间可实现的一些变化。事实上，首先可以明显观察到在对应于罗丹明发射波长范围的光谱区域中荧光信号增强。对前三个通道的光子衰减曲线进行仔细观察还可发现，DR10的曲线拐点比PR10更显著。在对光子衰减曲线进行拟合并计算各通道的平均荧光寿命后，FRET特征变得更加明显（图3，下图）。事实上，尽管WS样品的荧光寿命在其荧光光谱范围内呈现交替的升高和降低，但在PR10和DR10样品中均观察到清晰的FRET特征：1）在仅含供体的发射通道（前三个通道，蓝色）中，荧光寿命保持恒定；2）在对应于高寿命供体荧光团贡献逐渐增加的光谱通道中，荧光寿命呈上升趋势。

一旦确定了明确的FRET信号，通过比较木质素荧光寿命（通道2），可量化WS（0.47 ns）、DR10（0.42 ns）和PR10（0.36 ns）之间的寿命降低程度，从而揭示木质素与PR10和DR10之间的分子相互作用，且木质素与PR10的亲和力更强。

为了说明该方法在量化不同相互作用水平方面的相关性，我们选择了另外三个样品，模拟经处理的植物样品中酶的可及性：酸处理的WS（AWS），并结合两种分子量差异显著的PR（分别为5 kDa和20 kDa，记为PR5和PR20）。通过对sFLIM信号的仔细分析，提取出木质素的荧光寿命（图4）。如前所述，木质素的荧光寿命会因其所处环境而发生变化16,17。酸处理后，AWS中的荧光寿命测量值（0.28 ns）低于之前测得的WS值（0.47 ns），这证实了采用sFLIM方法对荧光寿命降低进行明确解释的必要性，以及为每种测试条件设置阴性对照的重要性。正如预期，当将PR添加到AWS中并与木质素发生相互作用时，观察到荧光寿命显著降低。此外，PR5引起的寿命降低（0.14 ns）比PR20（0.16 ns）更明显，这与其流体力学半径测量结果一致（PR5和PR20的流体力学半径分别为2.3 nm和4.8 nm），表明两者具有不同的空间位阻效应，从而导致PR5对木质素的可及性更高。

两个实验均表明，该方法能够根据酶的大小以及植物样品的预处理方式，精确评估木质素与酶之间的相互作用。

显示显微镜观察和吸收实验装置的植物解剖结构与染料扩散示意图。
图 1：样品的不同制备步骤。 小麦秸秆（WS）(A) 首先被切碎 (B)，然后包埋于聚乙二醇（PEG）介质中 (C)。使用配备一次性刀片的切片机对包埋块进行切片 (D)。洗涤后，将所得切片 (E) 置于含 PEG 或罗丹明标记的葡聚糖溶液中孵育 (F)。标记后的切片用于进行sFLIM测量 (G)。比例尺分别为：2 cm (A)、1 cm (B 和 C)、200 µm (E 和 G)。 请点击此处查看该图的放大版本。

多光子设置、荧光强度和校准数据的光谱寿命成像示意图。
图 2：基于光谱FRET相互作用测量的完整工作流程。 该图展示了结合光谱荧光强度与寿命测量的实验装置。光谱荧光图像通过共聚焦显微镜获取，随后使用sFLIM探测器对每个光谱范围依次测量荧光寿命。对光子衰减曲线的分析可准确确定样品与目标分子之间的相互作用。为避免伪影，必须进行校准。首先，需对sFLIM探测器进行光谱校准，并检查其仪器响应函数；其次，必须针对每个样品精确校准复杂的自发荧光信号，以在加入受体分子前确定各通道中的荧光寿命。请点击此处查看此图的放大版本。

荧光寿命、3D 图谱和柱状图；激发-发射；波长分析。
图 3：典型的 sFLIM 测量结果。 sFLIM 曲线（上图）分别在天然小麦秸秆（WS）、与罗丹明标记的聚乙二醇（PEG）孵育的小麦秸秆（WS+PEG）以及含有罗丹明标记的葡聚糖的天然小麦秸秆（WS+DEX）上获得。对每个样品，sFLIM 曲线均采用双指数衰减模型进行拟合，并计算每个通道的平均荧光寿命（下图）。WS+PEG 和 WS+DEX 样品在仅对应自体荧光的通道中（前三根柱）荧光寿命降低，同时在对应自体荧光与罗丹明混合发射的通道中荧光寿命增加。该行为是木质素与罗丹明标记分子之间发生 FRET（荧光共振能量转移）事件的典型特征。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光寿命图及公式；罗丹明标记；聚合物链分析。
图 4：对应于木质素自发荧光通道的荧光寿命分析。 在基于sFLIM特征验证FRET事件后，测量了酸处理小麦秸秆（AWS）与PR5或PR20（分别为5 kDa和20 kDa）共同作用下的平均荧光寿命。尽管两种PR样品均表现出荧光寿命缩短，但分子量较小的PR5表现出更强的寿命降低，表明其与木质素之间存在更强的分子相互作用。因此，该方法具有足够的灵敏度以区分两者（数据表示为平均值±标准误差，每种条件下n>10）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

关联荧光寿命与发射光谱的测量，可结合两种方法的优势。事实上，仅依靠光谱测量缺乏灵敏度，且结果仍为定性。另一方面，荧光寿命是传统定量FRET测量的首选方法，但已有研究表明，木质素的自发荧光会因其组成和环境的不同而发生变化16。因此，无法区分木质素与受体分子的相互作用与木质素结构的变化，因为二者均会导致荧光寿命缩短。如本研究所示，所开发的方法可对植物切片中木质素与受体分子之间的相互作用进行明确、灵敏且定量的测量。尽管该方法的各个步骤均已严格优化，但仍需特别注意以下几点。

关于样品，植物切片的质量至关重要，以确保成像时处于焦点范围内。PEG包埋的各个步骤必须严格遵循。最后的洗涤步骤必不可少，以确保样品中残留的PEG不会产生干扰。此外，所有测量过程中缓冲液的浓度和pH值必须保持完全一致，因为任何改变都可能对荧光特性产生显著影响。

寿命测量也可能十分敏感。供体的荧光寿命可能不稳定，例如由于过高的激发所致。在这种情况下，调节激光功率和缩放倍数可以解决该问题。时间相关单光子计数（TCSPC）测量中另一个众所周知的伪影来源是光子脉冲堆积效应。事实上，TCSPC 无法测量同一对激光脉冲之间发射的两个光子的时间间隔。由于植物样品具有高度结构化特征，其荧光分布并不均匀，可能导致隐藏的脉冲堆积效应。尽管每秒光子数总体上仍低于1%的激发极限，但在某些样品区域中可能更高。为确保不存在堆积效应，可考虑在不同光子通量下测量供体荧光寿命。若随着通量降低，测得的寿命延长，则表明存在脉冲堆积效应干扰测量结果。当供体寿命保持稳定时，即达到最佳光子通量。

关于sFLIM衰减曲线分析，我们建议依赖每条单独的曲线拟合，以确保模型能够准确描述测量结果。如果情况不符，首先应确认前述任何伪影是否已污染数据。然后，步骤2.1.4提供了系统的仪器响应函数（IRF）。如果IRF存在异常，应优化光路以将其最小化。在步骤6.2中也可使用实测的IRF进行拟合。最后，在步骤6.2中可将拟合模型的自由度增加至三指数衰减。然而，确定单个寿命和比例所需的光子数量较高，因此建议仅将其用于从步骤6.4获得更稳定的平均寿命。有关FLIM、其表征18、sFLIM及其应用12（特别是对木质素的研究10）的更详尽信息，可参见相关文献。

尽管具有挑战性，利用植物组织的天然自发荧光进行FRET检测仍具有一些优势。与通常需要通过基因工程表达内在荧光标记物以研究生物分子间相互作用的活体组织FRET检测相比，本文所展示的木质化植物组织具有天然的自发荧光，且可轻松添加外源性荧光探针，从而节省大量时间。然而，自发荧光可能因所分析的植物种类及所采用的预处理方法不同而发生变化，因此需要对其进行仔细表征，并可能需要调整用作探针的荧光染料。

sFLIM 方法必须应用于无催化活性的荧光探针（如 PEG 和葡聚糖）。在植物木质纤维素水解的研究框架中，可利用该方法分析各种生物质样品中酶之间的相互作用，进而可能确定定位（细胞和组织）对相互作用强度的影响。下一步的优化将是实现分析步骤的自动化。事实上，当积累足够多的分析数据后，可部署基于机器学习的分析流程，实现表型的自动化分析，从而提高其在快速筛选酶-生物质效率方面的适用性。此外，sFLIM 无需固定样品，可便捷地应用于酶-木质素动态相互作用的研究。这一独特的方法有望指导酶的分子改造策略以及生物质的预处理工艺，以优化木质纤维素的高值化利用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

谨此感谢 Fanny Laurent (FARE) 为图表制备所做的工作。感谢里尔大学与法国国家科学研究中心（CNRS）联合组成的 FRABio 研究联合会为本研究工作提供了有利的技术环境。本研究获得了法国国家科研署（LIGNOPROG 项目 ANR-14-CE05-0026）的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
共聚焦显微镜ZEISSLSM 710 NLO用于共聚焦成像
细毛刷用于收集切片
玻璃小瓶用于孵育
高精度显微镜盖玻片 170±5µm n°1,5#Marienfeld0107032由法国 Dutscher s.a 销售
红外脉冲激光器COHERENTCHAMELEON VISION用于样品激发
单通道移液器 Research Plus 20–200µLEppendorf配相应吸头
单通道移液器 Research Plus 2–20µLEppendorf配相应吸头
显微镜载玻片，约 76 × 26 mm，磨边，一端磨砂Thermo Fisher ScientificLR45D
一次性切片刀片（每包50片）Agar ScientificT5024由法国 Oxford Instruments 销售
mPEG-罗丹明，10 kDaCreative Peg WorksPSB-2263
mPEG-罗丹明，20 kDaCreative Peg WorksPSB-22642
mPEG-罗丹明，5 kDaCreative Peg WorksPSB-2264
指甲油用于封片
pH计 Five Easy PlusMettler ToledoFEP20带电极
聚乙二醇，平均分子量 1450Merck (Sigma-Aldrich)P5402-1kg用于样品包埋
单刃剃须刀片，不锈钢，每盒100片Agar ScientificT586用于样品片段制备，由法国 Oxford Instruments 销售
旋转式切片机Microm MicrotechHM 360
sFLim 检测器BECKER-HICKLSPC 150用于荧光寿命采集
磷酸二氢钠二水合物 NaH2PO4, 2H2OMerck (Sigma-Aldrich)71500用于缓冲液配制
磷酸氢二钠二水合物 Na2HPO4, 2H2OMerck (Sigma-Aldrich)30435-1kg用于缓冲液配制，旧货号，新货号为 71643-1kg
四甲基罗丹明异硫氰酸酯-葡聚糖 10 kDaMerck (Sigma-Aldrich)R8881-100mg

参考文献

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