方法文章

基于核磁共振的活性检测方法用于测定核苷核糖水解酶的化合物抑制作用、IC50 值、人工活性及全细胞活性

DOI：

10.3791/59928

⸱

2019年6月30日

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

本文内容

摘要

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已开发基于核磁共振（NMR）的活性检测方法，用于鉴定和表征两种核苷核糖水解酶抑制剂。本文提供了在500 μM和250 μM浓度下进行初筛化合物检测、测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照筛选检测、稀释-跳跃对照筛选检测，以及在大肠杆菌（E. coli）全细胞中进行检测的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

核磁共振（NMR）波谱学常用于药物发现中酶抑制剂的鉴定与表征，尤其适用于片段筛选。基于NMR的活性检测方法特别适合在较高测试化合物浓度下工作，从而能够检测这些较弱的抑制剂。NMR实验中的动态范围和化学位移分散性可轻松分辨底物、产物和测试化合物的共振信号。这与光谱法检测形成对比，后者常因化合物在紫外-可见光吸收谱上重叠而导致读数干扰问题。此外，由于NMR检测无需报告酶，单酶NMR检测不易产生偶联检测中的假阳性结果。这一特性使其非常适合作为正交检测方法，补充传统的高通量筛选和实验台级初筛检测。本文提供了详细的实验方案，包括在500 μM和250 μM浓度下的初始化合物检测、用于测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照检测、跳稀释对照检测，以及在E. coli完整细胞中的检测。这些方法以两种核糖核苷水解酶为例进行演示：对嘌呤特异性酶采用1H NMR，对嘧啶特异性酶采用19F NMR。这些方案普遍适用于任何可通过NMR波谱观察并区分底物与产物共振信号的酶。为了在药物发现中发挥最大效用，底物的最终浓度应不超过其Km值的2-3倍。NMR实验的选择取决于具体的酶促反应、可用的底物以及现有的NMR仪器设备。

引言

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核磁共振（NMR）波谱法已广泛用于表征和监测酶促反应1,2。通过化学位移和耦合模式的差异可区分底物与产物的共振信号，而相对共振强度则用于量化反应百分比。在核磁共振谱中，可直接观察到底物的消耗和产物的生成。这与分光光度法或荧光光谱法不同，后者的反应过程通过吸光度变化来指示，该变化归因于某些化学物种的消耗或生成。与其他方法一样，核磁共振可用于研究酶促反应随温度、pH值或其他溶液条件的变化，也可用于测定抑制剂的影响。

最近，基于核磁共振（NMR）的酶活性检测方法已被应用于片段筛选3,4。基于NMR的检测方法特别适用于较高浓度测试化合物（通常高达1 mM）的实验条件，从而能够检测到这些较弱的抑制剂。NMR实验具有较宽的动态范围和良好的化学位移分散性，可轻松分辨底物、产物和测试化合物的共振信号。相比之下，分光光度法检测常因化合物在紫外-可见光区吸收谱重叠而产生读数干扰问题。此外，由于不依赖报告酶，单酶NMR检测不易出现偶联检测中的假阳性结果。这一优势使其可作为正交检测方法，与传统的高通量筛选检测和实验台级初筛检测相互补充5。

在我们的研究实验室中，基于....

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方案

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1. 初始测试化合物在 500 μM 和 250 μM 浓度下的检测

  1. 准备反应所需的底物和待测化合物。
    1. 将底物（腺苷或5-氟尿苷）溶于水中，配制储备液；将50 mM待测化合物溶于氘代二甲基亚砜（DMSO）中，配制储备液。底物溶液的浓度请参见引言部分。
    2. 向四个1.5 mL微量离心管（编号1–4）中各加入12 μL底物（腺苷或5-氟尿苷）。
    3. 向管1（0分钟对照）和管4（30分钟对照）中各加入6 μL氘代DMSO；向管2中加入6 μL待测化合物；向管3中加入3 μL待测化合物和3 μL氘代DMSO。
  2. 配制足量的反应储备液。
    注意：该储备液用于五个反应，每个反应包含517 μL缓冲液、60 μL重水（deuterium oxide）和5 μL酶溶液（AGNH或UNH）。酶溶液的浓度请参见引言部分。
    1. 向一个15 mL锥形管中加入2.59 mL反应缓冲液（50 mM磷酸钾，0.3 M KCl，pH 6.5）；加入300 μL重水；加入25 μL酶溶液（AGNH或UNH）。
    2. 轻轻倒置锥形管两次以混匀。
  3. 同时启动并终止0分钟对照反应。取582 μL反应储备液转移至一个新的微量离心管中，加入10 μL 1.5 M HCl，然后将总共592 μL液体转移至微量离心管1中。缓慢而有意识地吸液和排液两次，以充分....

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结果

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图2展示了按照第1节所述使用1H NMR检测两种化合物对AGNH作用的结果。通过观察腺苷在8.48 ppm处的单峰和6.09 ppm处的双峰信号的消失，以及腺嘌呤在8.33 ppm处单峰信号的出现，可以最简便地观察并量化酶反应，如30分钟对照谱图所示。在500 μM化合物1存在下，未生成任何产物，表现为8.33 ppm处无腺嘌呤共振信号。在250 μM化合物1存在下，约有10%的底物转化为产物。相比之下，两种浓度的化合物2均未抑制该酶活性，其底物和产物的共振信号与30分钟对照谱图中的信号相似。该数据表明化合物1是一种良好的AGNH抑制剂。需注意，化合物1（7.70–8.00 ppm和8.50–8.60 ppm）和化合物2（7.40–7.80 ppm）自身的共振信号也可观察到。相同的底物和产物共振信号被用于监测图4、图6、图8和图10

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讨论

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所述方案通常适用于多种酶，前提是底物和/或产物在核磁共振（NMR）谱图中具有可分辨的信号。然而，底物浓度应接近其Km值，并且足够高，以便在合理的时间范围内通过NMR实验检测到。对于检测竞争性、非竞争性和反竞争性抑制剂而言，底物浓度不超过Km值的2-3倍为最佳4。如本文对UNH酶所示，低至15 μM的底物Km值也适用。使用具有CH3或CF3信号的底物，并结合低温探头采集NMR数据，可进一步降低此检测限15。然而，对于底物Km值低于1 μM的酶，由于NMR实验本身灵敏度较低，可能难以采用该方法进行研究。在此类情况下，分光光度法或荧光光谱法是更为合适的技术。

这些方法应用的另一个限制在于合适的淬灭剂。此处描述的所有方案均为固定时间测定法，在反应进行30分钟后通过加入HCl淬灭反应。对于AGNH.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢 Dean Brown 博士提供阿斯利康片段化合物库中的化合物，以及 David Parkin 博士提供 AGNH 和 UNH 酶。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，项目编号为 R15AI128585，授予 B. J. S.。本研究内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。此外，本研究还获得了授予 S. N. M. 的 Horace G. McDonell 暑期研究奖学金、授予 J. A. G. 的 Landesberg 家族奖学金，以及由阿德尔菲大学授予 B. J. S. 的教师发展资助和 Frederick Bettelheim 研究奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AGNH实验室自制纯化N/ATVAG_213720
UNH实验室自制纯化N/ATVAG_092730
腺苷SigmaA9251
5-氟尿苷SigmaF5130
六氘代二甲基亚砜Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99.9%
磷酸二氢钾SigmaP0662
磷酸氢二钾SigmaP3786
氯化钾SigmaP9541
重水Cambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99.9%
盐酸Fisher ChemicalA144212
曲拉通 X-100SigmaX100
三甲基硅基丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TSP）Sigma269913D, 98%
2,2,2-三氟乙醇-1,1-d2Sigma612197D, 99.5%
移液器GilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
移液器GilsonF123601PIPETMAN Classic P200
移液器GilsonF123600PIPETMAN Classic P20
微量离心管Fisher Scientific05-408-129
锥形管Corning352099
微量离心机Eppendorf5418
涡旋混合器Fisher Scientific02215365
NMR 管Norell502-7或根据 NMR 仪器选择合适规格
NMR 波谱仪BrukerN/AAvanceIII500
Prism 软件GraphPadN/AVersion 5.04

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al.

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标签

IC50

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