已开发基于核磁共振（NMR）的活性检测方法，用于鉴定和表征两种核苷核糖水解酶抑制剂。本文提供了在500 μM和250 μM浓度下进行初筛化合物检测、测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照筛选检测、稀释-跳跃对照筛选检测，以及在大肠杆菌（E. coli）全细胞中进行检测的实验方案。
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摘要
摘要
核磁共振（NMR）波谱学常用于药物发现中酶抑制剂的鉴定与表征，尤其适用于片段筛选。基于NMR的活性检测方法特别适合在较高测试化合物浓度下工作，从而能够检测这些较弱的抑制剂。NMR实验中的动态范围和化学位移分散性可轻松分辨底物、产物和测试化合物的共振信号。这与光谱法检测形成对比，后者常因化合物在紫外-可见光吸收谱上重叠而导致读数干扰问题。此外，由于NMR检测无需报告酶，单酶NMR检测不易产生偶联检测中的假阳性结果。这一特性使其非常适合作为正交检测方法，补充传统的高通量筛选和实验台级初筛检测。本文提供了详细的实验方案，包括在500 μM和250 μM浓度下的初始化合物检测、用于测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照检测、跳稀释对照检测，以及在E. coli完整细胞中的检测。这些方法以两种核糖核苷水解酶为例进行演示：对嘌呤特异性酶采用1H NMR，对嘧啶特异性酶采用19F NMR。这些方案普遍适用于任何可通过NMR波谱观察并区分底物与产物共振信号的酶。为了在药物发现中发挥最大效用，底物的最终浓度应不超过其Km值的2-3倍。NMR实验的选择取决于具体的酶促反应、可用的底物以及现有的NMR仪器设备。
引言
核磁共振（NMR）波谱法已广泛用于表征和监测酶促反应1,2。通过化学位移和耦合模式的差异可区分底物与产物的共振信号，而相对共振强度则用于量化反应百分比。在核磁共振谱中，可直接观察到底物的消耗和产物的生成。这与分光光度法或荧光光谱法不同，后者的反应过程通过吸光度变化来指示，该变化归因于某些化学物种的消耗或生成。与其他方法一样，核磁共振可用于研究酶促反应随温度、pH值或其他溶液条件的变化，也可用于测定抑制剂的影响。
最近，基于核磁共振（NMR）的酶活性检测方法已被应用于片段筛选3,4。基于NMR的检测方法特别适用于较高浓度测试化合物（通常高达1 mM）的实验条件，从而能够检测到这些较弱的抑制剂。NMR实验具有较宽的动态范围和良好的化学位移分散性，可轻松分辨底物、产物和测试化合物的共振信号。相比之下，分光光度法检测常因化合物在紫外-可见光区吸收谱重叠而产生读数干扰问题。此外，由于不依赖报告酶，单酶NMR检测不易出现偶联检测中的假阳性结果。这一优势使其可作为正交检测方法，与传统的高通量筛选检测和实验台级初筛检测相互补充5。
在我们的研究实验室中，基于....
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方案
1. 初始测试化合物在 500 μM 和 250 μM 浓度下的检测
- 准备反应所需的底物和待测化合物。
- 将底物（腺苷或5-氟尿苷）溶于水中，配制储备液；将50 mM待测化合物溶于氘代二甲基亚砜（DMSO）中，配制储备液。底物溶液的浓度请参见引言部分。
- 向四个1.5 mL微量离心管（编号1–4）中各加入12 μL底物（腺苷或5-氟尿苷）。
- 向管1（0分钟对照）和管4（30分钟对照）中各加入6 μL氘代DMSO；向管2中加入6 μL待测化合物；向管3中加入3 μL待测化合物和3 μL氘代DMSO。
- 配制足量的反应储备液。
注意：该储备液用于五个反应，每个反应包含517 μL缓冲液、60 μL重水（deuterium oxide）和5 μL酶溶液（AGNH或UNH）。酶溶液的浓度请参见引言部分。- 向一个15 mL锥形管中加入2.59 mL反应缓冲液（50 mM磷酸钾，0.3 M KCl，pH 6.5）；加入300 μL重水；加入25 μL酶溶液（AGNH或UNH）。
- 轻轻倒置锥形管两次以混匀。
- 同时启动并终止0分钟对照反应。取582 μL反应储备液转移至一个新的微量离心管中，加入10 μL 1.5 M HCl，然后将总共592 μL液体转移至微量离心管1中。缓慢而有意识地吸液和排液两次，以充分....
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结果
图2展示了按照第1节所述方法，使用1H NMR检测两种化合物对AGNH作用的结果。通过观察腺苷在8.48 ppm处的单峰和6.09 ppm处的双峰信号的消失，以及腺嘌呤在8.33 ppm处单峰信号的出现（如30分钟对照谱图所示），可最简便地观察并量化酶反应。在500 μM化合物1存在下，未生成任何产物，表现为8.33 ppm处无腺嘌呤共振信号；在250 μM化合物1存在下，约有10%的底物转化为产物。相比之下，在两种浓度下化合物2均未抑制该酶，其底物和产物的共振信号与30分钟对照谱图相似。该数据表明化合物1是一种良好的AGNH抑制剂。需要注意的是，化合物1（7.70–8.00 ppm和8.50–8.60 ppm）和化合物2（7.40–7.80 ppm）自身的共振信号也可观察到。相同的底物和产物共振信号也被用于监测图4、图6、图8和图10<.......
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讨论
所述方案通常适用于多种酶，前提是底物和/或产物在核磁共振（NMR）谱图中具有可分辨的信号。然而，底物浓度应接近其Km值，并且足够高，以便在合理的时间范围内通过NMR实验检测到。对于检测竞争性、非竞争性和反竞争性抑制剂而言，底物浓度不超过Km值的2-3倍为最佳4。如本文对UNH酶所示，低至15 μM的底物Km值也适用。使用具有CH3或CF3信号的底物，并结合低温探头采集NMR数据，可进一步降低此检测限15。然而，对于底物Km值低于1 μM的酶，由于NMR实验本身灵敏度较低，可能难以采用该方法进行研究。在此类情况下，分光光度法或荧光光谱法是更为合适的技术。
这些方法应用的另一个限制在于合适的淬灭剂。此处描述的所有方案均为固定时间测定法，在反应进行30分钟后通过加入HCl淬灭反应。对于AGNH.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Dean Brown 博士提供阿斯利康片段化合物库中的化合物，以及 David Parkin 博士提供 AGNH 和 UNH 酶。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，项目编号为 R15AI128585，授予 B. J. S.。本研究内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。此外，本研究还获得了授予 S. N. M. 的 Horace G. McDonell 暑期研究奖学金、授予 J. A. G. 的 Landesberg 家族奖学金，以及由阿德尔菲大学授予 B. J. S. 的教师发展资助和 Frederick Bettelheim 研究奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AGNH | 实验室自制纯化 | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | 实验室自制纯化 | N/A | TVAG_092730 |
| 腺苷 | Sigma | A9251 | |
| 5-氟尿苷 | Sigma | F5130 | |
| 六氘代二甲基亚砜 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | P0662 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma | P3786 | |
| 氯化钾 | Sigma | P9541 | |
| 重水 | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
| 盐酸 | Fisher Chemical | A144212 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma | X100 | |
| 三甲基硅基丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TSP） | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-三氟乙醇-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
| 移液器 | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| 移液器 | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| 移液器 | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 锥形管 | Corning | 352099 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5418 | |
| 涡旋混合器 | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR 管 | Norell | 502-7 | 或根据 NMR 仪器选择合适规格 |
| NMR 波谱仪 | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
| Prism 软件 | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
参考文献
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
- Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
- Dalvit, C., et al.
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重印与许可
