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方法文章

基于核磁共振的活性检测方法用于测定核苷核糖水解酶的化合物抑制作用、IC50 值、人工活性及全细胞活性

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DOI：

10.3791/59928

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2019年6月30日

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

本文内容

摘要

已开发基于核磁共振（NMR）的活性检测方法，用于鉴定和表征两种核苷核糖水解酶抑制剂。本文提供了在500 μM和250 μM浓度下进行初筛化合物检测、测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照筛选检测、稀释-跳跃对照筛选检测，以及在大肠杆菌（E. coli）全细胞中进行检测的实验方案。

摘要

核磁共振（NMR）波谱学常用于药物发现中酶抑制剂的鉴定与表征，尤其适用于片段筛选。基于NMR的活性检测方法特别适合在较高测试化合物浓度下工作，从而能够检测这些较弱的抑制剂。NMR实验中的动态范围和化学位移分散性可轻松分辨底物、产物和测试化合物的共振信号。这与光谱法检测形成对比，后者常因化合物在紫外-可见光吸收谱上重叠而导致读数干扰问题。此外，由于NMR检测无需报告酶，单酶NMR检测不易产生偶联检测中的假阳性结果。这一特性使其非常适合作为正交检测方法，补充传统的高通量筛选和实验台级初筛检测。本文提供了详细的实验方案，包括在500 μM和250 μM浓度下的初始化合物检测、用于测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照检测、跳稀释对照检测，以及在E. coli完整细胞中的检测。这些方法以两种核糖核苷水解酶为例进行演示：对嘌呤特异性酶采用1H NMR，对嘧啶特异性酶采用19F NMR。这些方案普遍适用于任何可通过NMR波谱观察并区分底物与产物共振信号的酶。为了在药物发现中发挥最大效用，底物的最终浓度应不超过其Km值的2-3倍。NMR实验的选择取决于具体的酶促反应、可用的底物以及现有的NMR仪器设备。

引言

核磁共振（NMR）波谱法已广泛用于表征和监测酶促反应1,2。通过化学位移和耦合模式的差异可区分底物与产物的共振信号，而相对共振强度则用于量化反应百分比。在核磁共振谱中，可直接观察到底物的消耗和产物的生成。这与分光光度法或荧光光谱法不同，后者的反应过程通过吸光度变化来指示，该变化归因于某些化学物种的消耗或生成。与其他方法一样，核磁共振可用于研究酶促反应随温度、pH值或其他溶液条件的变化，也可用于测定抑制剂的影响。

最近，基于核磁共振（NMR）的酶活性检测方法已被应用于片段筛选3,4。基于NMR的检测方法特别适用于较高浓度测试化合物（通常高达1 mM）的实验条件，从而能够检测到这些较弱的抑制剂。NMR实验具有较宽的动态范围和良好的化学位移分散性，可轻松分辨底物、产物和测试化合物的共振信号。相比之下，分光光度法检测常因化合物在紫外-可见光区吸收谱重叠而产生读数干扰问题。此外，由于不依赖报告酶，单酶NMR检测不易出现偶联检测中的假阳性结果。这一优势使其可作为正交检测方法，与传统的高通量筛选检测和实验台级初筛检测相互补充5。

在我们的研究实验室中，基于核磁共振（NMR）的活性检测方法被用于鉴定和评估阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）核苷核糖水解酶的抑制剂。T. vaginalis 寄生虫是全球最常见的非病毒性性传播疾病的致病源6。由于对现有疗法的耐药性日益增加7，迫切需要开发基于作用机制的新型治疗方法，而核苷补救途径中的关键酶正是理想的药物靶点8。目前已针对嘧啶特异性和嘌呤特异性酶——尿苷核苷核糖水解酶（uridine nucleoside ribohydrolase, UNH）9 和偏好腺苷/鸟苷的核苷核糖水解酶（adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase, AGNH）10——分别建立了基于NMR的活性检测方法。这两种酶催化的反应如图1所示。这些NMR检测方法正被用于筛选片段化合物库以发现先导化学结构、测定IC50值，并排除因聚集或共价结合而产生假阳性结果的抑制剂11。相同的检测方法也正在被拓展用于评估完整细胞内的酶活性12。

本文提供了在500 μM和250 μM浓度下进行初始化合物检测、测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照筛选检测、稀释跳跃对照筛选检测，以及在E. coli完整细胞中进行检测的详细方案。这些方案通常适用于任何可通过核磁共振（NMR）光谱观察并区分底物和产物共振信号的酶。为简化起见，文中做了三项假设。第一，未具体指定底物。为使基于NMR的活性检测具有实用性，底物的终浓度不应超过其Km值的2-3倍4。在所示示例中，腺苷和5-氟尿苷的终浓度分别为100 μM（Km = 54 μM）和50 μM（Km = 15 μM）。在方案中，达到这些浓度相当于加入12 μL的5 mM腺苷溶液或12 μL的2.5 mM 5-氟尿苷溶液。

其次，方案中提供的酶用量为 5 μL，该用量的选择依据是使底物在 30 分钟内约有 75% 转化为产物。这一用量通常代表从纯化酶原液进行较大倍数的稀释，且每种酶的稀释倍数必须预先确定。纯化的 AGNH 和 UNH 酶原液以分装形式储存在 -80 °C，每份分装量足以支持数千次反应。因此，理想情况下，稀释倍数仅需每几个月确定或验证一次。第三，未具体指定所用的一维核磁共振（1D NMR）实验类型。在代表性结果中，AGNH10 使用的是 1H NMR，而 UNH9 使用的是 19F NMR，相应的 NMR 实验方法详见各自参考文献。NMR 实验类型的选择取决于具体的酶促反应、可用的底物以及现有的 NMR 仪器设备。最后需要指出的是，此处描述的实验方法并不符合定量核磁共振（qNMR）13,14 的严格要求。在本方案中，反应百分比是通过分析各谱图中同一共振峰强度的相对变化来确定的，而非测定绝对浓度。这种方法避免了对数据采集和处理流程的特殊修改，也无需使用 qNMR 所需的内标或外标。

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方案

1. 初始测试化合物在 500 μM 和 250 μM 浓度下的检测

  1. 准备反应所需的底物和待测化合物。
    1. 将底物（腺苷或5-氟尿苷）溶于水中，配制储备液；将50 mM待测化合物溶于氘代二甲基亚砜（DMSO）中，配制储备液。底物溶液的浓度请参见引言部分。
    2. 向四个1.5 mL微量离心管（编号1–4）中各加入12 μL底物（腺苷或5-氟尿苷）。
    3. 向管1（0分钟对照）和管4（30分钟对照）中各加入6 μL氘代DMSO；向管2中加入6 μL待测化合物；向管3中加入3 μL待测化合物和3 μL氘代DMSO。
  2. 配制足量的反应储备液。
    注意：该储备液用于五个反应，每个反应包含517 μL缓冲液、60 μL重水（deuterium oxide）和5 μL酶溶液（AGNH或UNH）。酶溶液的浓度请参见引言部分。
    1. 向一个15 mL锥形管中加入2.59 mL反应缓冲液（50 mM磷酸钾，0.3 M KCl，pH 6.5）；加入300 μL重水；加入25 μL酶溶液（AGNH或UNH）。
    2. 轻轻倒置锥形管两次以混匀。
  3. 同时启动并终止0分钟对照反应。取582 μL反应储备液转移至一个新的微量离心管中，加入10 μL 1.5 M HCl，然后将总共592 μL液体转移至微量离心管1中。缓慢而有意识地吸液和排液两次，以充分混合。
  4. 以交错方式进行其余三个反应的启动和孵育。在0分钟时，将582 μL反应储备液转移至微量离心管2中，缓慢而有意识地吸液和排液两次。随后每隔30秒依次对微量离心管3和管4进行相同操作。孵育30分钟。
  5. 终止反应。在30分钟时，向微量离心管2中加入10 μL 1.5 M HCl，随后每隔30秒依次向微量离心管3和管4中加入相同体积的HCl。从每个微量离心管中转移600 μL溶液至核磁共振（NMR）样品管中。
  6. 对每个样品采集一维（1D）NMR谱图。处理数据以确保正确的相位校正和平坦的基线。
  7. 计算对照样品中底物的转化百分比。
    1. 叠加0分钟和30分钟对照的谱图，调节0分钟对照中的底物信号，使其与30分钟对照中的信号匹配。记录该百分比数值。
    2. 按（100 – 步骤1.7.1中确定的百分比）计算底物转化率。
  8. 计算含待测化合物反应中底物的转化百分比。
    1. 叠加0分钟对照与第一个含500 μM待测化合物反应的谱图，调节0分钟对照中的底物信号，使其与含待测化合物的谱图匹配。记录该百分比数值。按（100 – 所得百分比）计算转化率。
    2. 对第二个含250 μM待测化合物的反应重复上述步骤。
  9. 计算每个待测化合物浓度下的反应百分比和抑制百分比。
    1. 按（1.8.1 / 1.7.2）× 100 计算反应百分比。
    2. 按（100 – 步骤1.9.1中确定的百分比）计算抑制百分比。

2. IC50 值的测定

  1. 准备反应所需的底物和待测化合物。
    1. 用水配制底物（腺苷或5-氟尿苷）的储备溶液，并用氘代DMSO配制10 mM的待测化合物溶液。底物溶液的使用浓度参见引言部分。
  2. 对10 mM待测化合物（溶于氘代DMSO）进行系列稀释。
    1. 向五个1.5 mL微量离心管（编号1–5）中各加入36 μL氘代DMSO。
    2. 向1号管中加入12 μL 10 mM待测化合物，轻轻敲击混匀。此时待测化合物浓度为2.5 mM。
    3. 从1号管转移12 μL至2号管，轻轻敲击混匀，待测化合物浓度现为0.63 mM；从2号管转移12 μL至3号管，轻轻敲击混匀，待测化合物浓度现为0.16 mM；从3号管转移12 μL至4号管，轻轻敲击混匀，待测化合物浓度现为0.04 mM；从4号管转移12 μL至5号管，轻轻敲击混匀，待测化合物浓度现为0.01 mM。
  3. 准备14个1.5 mL微量离心管用于反应。
    1. 向14个1.5 mL微量离心管（编号1–14）中各加入12 μL底物（腺苷或5-氟尿苷）。
    2. 向1号管（0分钟对照）和14号管（30分钟对照）中各加入12 μL氘代DMSO。
    3. 向2号和3号管中各加入12 μL 10 mM待测化合物；向4号和5号管中各加入12 μL 2.5 mM待测化合物；向6号和7号管中各加入12 μL 0.63 mM待测化合物；向8号和9号管中各加入12 μL 0.16 mM待测化合物；向10号和11号管中各加入12 μL 0.04 mM待测化合物；向12号和13号管中各加入12 μL 0.01 mM待测化合物。
  4. 配制足够进行15次反应的反应储备液，每次反应包含511 μL缓冲液、60 μL氘代水和5 μL酶溶液（AGNH或UNH）。酶溶液的使用浓度参见引言部分。
    1. 向一个15 mL锥形管中加入7.67 mL反应缓冲液（50 mM磷酸钾，0.3 M KCl，pH = 6.5），再加入900 μL氘代水，最后加入75 μL酶溶液（AGNH或UNH）。
    2. 轻轻倒置锥形管2次以混匀。
  5. 按照步骤1.3–1.9所述操作（每次使用576 μL反应储备液），测定各待测化合物浓度下的反应百分比。
  6. 使用GraphPad Prism计算IC50值。
    1. 建立数据表，将待测化合物浓度的对数（200 μM、50 μM、12.5 μM、3.13 μM、0.78 μM、0.20 μM）与对应的反应百分比（每个浓度两个重复值）进行关联。
    2. 采用非线性曲线拟合方法确定IC50值及其标准误差。

3. 在 100 μM 和 50 μM 条件下的去垢剂反筛实验

  1. 准备反应所需的底物和待测化合物。
    1. 将底物（腺苷或5-氟尿苷）溶于水中配制储备液，待测化合物溶于氘代DMSO中配制10 mM储备液。底物溶液的浓度请参见引言部分。
    2. 向八个1.5 mL微量离心管（编号1–8）中各加入12 μL底物（腺苷或5-氟尿苷）。
    3. 向1号和5号管（0分钟对照）以及4号和8号管（30分钟对照）中各加入6 μL氘代DMSO；向2号和6号管中各加入6 μL待测化合物；向3号和7号管中各加入3 μL待测化合物和3 μL氘代DMSO。
  2. 配制足量不含去垢剂的反应储备液，用于进行五次反应，每次反应包含517 μL缓冲液、60 μL重水和5 μL酶溶液（AGNH或UNH）。酶溶液的浓度请参见引言部分。
    1. 向一个15 mL锥形管中加入2.59 mL反应缓冲液（50 mM磷酸钾，0.3 M KCl，pH = 6.5），再加入300 μL重水，最后加入25 μL酶溶液（AGNH或UNH）。
    2. 轻轻倒置锥形管2次以混匀。
  3. 配制足量含0.01% v/v Triton X-100去垢剂的反应储备液，用于进行五次反应，每次反应包含517 μL缓冲液、60 μL重水和5 μL酶溶液（AGNH或UNH）。
    1. 将2 μL Triton X-100去垢剂加入20 mL反应缓冲液（50 mM磷酸钾，0.3 M KCl，pH = 6.5）中。去垢剂溶液必须在1天内使用完毕。
    2. 向一个15 mL锥形管中加入2.59 mL含0.01% Triton X-100的反应缓冲液，再加入300 μL重水，最后加入25 μL酶溶液（AGNH或UNH）。
    3. 轻轻倒置锥形管2次以混匀。
  4. 对于1–4号管，使用不含去垢剂的反应储备液，按照步骤1.3–1.9的操作流程，测定每个待测化合物浓度下的抑制率。
  5. 对于5–8号管，使用含0.01% v/v Triton X-100去垢剂的反应储备液，按照步骤1.3–1.9的操作流程，测定每个待测化合物浓度下的抑制率。

4. 跳跃稀释反向筛选实验

  1. 准备反应所需的底物和待测化合物
    1. 将底物（腺苷或5-氟尿苷）溶于水中配制储备液，将10 mM待测化合物溶于氘代DMSO中。底物溶液的浓度请参见引言部分。
    2. 向两个1.5 mL微量离心管（分别标记为1和2）中各加入53.8 μL反应缓冲液（50 mM磷酸钾，0.3 M KCl，pH = 6.5）。向1号和2号管中各加入5 μL酶（AGNH或UNH）。
    3. 向两个1.5 mL微量离心管（分别标记为3和4）中各加入511 μL反应缓冲液。向3号和4号管中各加入60 μL氘代水。向3号和4号管中各加入5 μL酶（AGNH或UNH）。
    4. 向1号管中加入1.2 μL氘代DMSO（30分钟对照组）。向2号管中加入1.2 μL待测化合物。向3号管中加入12 μL氘代DMSO（30分钟对照组）。向4号管中加入12 μL待测化合物。30分钟避光孵育。
  2. 准备两个含稀释液的1.5 mL微量离心管。
    1. 向两个1.5 mL微量离心管（分别标记为5和6）中各加入468 μL反应缓冲液。向5号和6号管中各加入60 μL氘代水。
  3. 准备四个用于反应的1.5 mL微量离心管。
    1. 向四个1.5 mL微量离心管（分别标记为7–10）中各加入12 μL底物（腺苷或5-氟尿苷）。
  4. 进行跳跃稀释并启动反应。
    1. 将5号管中的528 μL溶液转移至1号管中，缓慢而彻底地吸打两次。将6号管中的528 μL溶液转移至2号管中，同样缓慢而彻底地吸打两次。
    2. 在0分钟时，将1号管中的588 μL溶液转移至7号管，缓慢而彻底地吸打两次。随后每隔30秒，依次将2号管中的588 μL溶液转移至8号管，3号管转移至9号管，4号管转移至10号管，每次转移后均缓慢而彻底地吸打两次。转移完成后静置30分钟。
  5. 对7–10号管，按照步骤1.5–1.9中所述操作，测定每个待测化合物浓度下的抑制百分率。

5. 化合物检测在 E. coli 全细胞

  1. 在实验前一天准备 10 mL 的大肠杆菌（E. coli）过夜培养物。
  2. 为核磁共振（NMR）实验准备大肠杆菌（E. coli）细胞。
    1. 将细胞以每份 1 mL 分装，于 15,000 × g 离心 10 分钟。
    2. 弃去上清液，通过涡旋振荡将每份细胞重悬于 1 mL 反应缓冲液（50 mM 磷酸钾，0.3 M KCl，pH = 6.5）中。
  3. 根据所需检测方法执行第 1 或第 2 部分，并作如下修改：
    1. 在反应储备液中，用 280 μL 重悬的细胞替代 280 μL 缓冲液。
    2. 在反应储备液中，用 5 μL 缓冲液替代 5 μL 酶（AGNH 或 UNH）。

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结果

图2展示了按照第1节所述方法，使用1H NMR检测两种化合物对AGNH作用的结果。通过观察腺苷在8.48 ppm处的单峰和6.09 ppm处的双峰信号的消失，以及腺嘌呤在8.33 ppm处单峰信号的出现（如30分钟对照谱图所示），可最简便地观察并量化酶反应。在500 μM化合物1存在下，未生成任何产物，表现为8.33 ppm处无腺嘌呤共振信号；在250 μM化合物1存在下，约有10%的底物转化为产物。相比之下，在两种浓度下化合物2均未抑制该酶，其底物和产物的共振信号与30分钟对照谱图相似。该数据表明化合物1是一种良好的AGNH抑制剂。需要注意的是，化合物1（7.70–8.00 ppm和8.50–8.60 ppm）和化合物2（7.40–7.80 ppm）自身的共振信号也可观察到。相同的底物和产物共振信号也被用于监测图4、图6、图8和图10<...

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讨论

所述方案通常适用于多种酶，前提是底物和/或产物在核磁共振（NMR）谱图中具有可分辨的信号。然而，底物浓度应接近其Km值，并且足够高，以便在合理的时间范围内通过NMR实验检测到。对于检测竞争性、非竞争性和反竞争性抑制剂而言，底物浓度不超过Km值的2-3倍为最佳4。如本文对UNH酶所示，低至15 μM的底物Km值也适用。使用具有CH3或CF3信号的底物，并结合低温探头采集NMR数据，可进一步降低此检测限15。然而，对于底物Km值低于1 μM的酶，由于NMR实验本身灵敏度较低，可能难以采用该方法进行研究。在此类情况下，分光光度法或荧光光谱法是更为合适的技术。

这些方法应用的另一个限制在于合适的淬灭剂。此处描述的所有方案均为固定时间测定法，在反应进行30分钟后通过加入HCl淬灭反应。对于AGNH...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Dean Brown 博士提供阿斯利康片段化合物库中的化合物，以及 David Parkin 博士提供 AGNH 和 UNH 酶。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，项目编号为 R15AI128585，授予 B. J. S.。本研究内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。此外，本研究还获得了授予 S. N. M. 的 Horace G. McDonell 暑期研究奖学金、授予 J. A. G. 的 Landesberg 家族奖学金，以及由阿德尔菲大学授予 B. J. S. 的教师发展资助和 Frederick Bettelheim 研究奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AGNH实验室自制纯化N/ATVAG_213720
UNH实验室自制纯化N/ATVAG_092730
腺苷SigmaA9251
5-氟尿苷SigmaF5130
六氘代二甲基亚砜Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99.9%
磷酸二氢钾SigmaP0662
磷酸氢二钾SigmaP3786
氯化钾SigmaP9541
重水Cambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99.9%
盐酸Fisher ChemicalA144212
曲拉通 X-100SigmaX100
三甲基硅基丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TSP）Sigma269913D, 98%
2,2,2-三氟乙醇-1,1-d2Sigma612197D, 99.5%
移液器GilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
移液器GilsonF123601PIPETMAN Classic P200
移液器GilsonF123600PIPETMAN Classic P20
微量离心管Fisher Scientific05-408-129
锥形管Corning352099
微量离心机Eppendorf5418
涡旋混合器Fisher Scientific02215365
NMR 管Norell502-7或根据 NMR 仪器选择合适规格
NMR 波谱仪BrukerN/AAvanceIII500
Prism 软件GraphPadN/AVersion 5.04

参考文献

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