使用点击化学法测定血管平滑肌细胞增殖

摘要

增殖是细胞功能的关键部分，也是评估新药潜在毒性的常用检测指标。因此，测量增殖是细胞生物学中常用的实验方法。本文介绍一种简单且通用的增殖测量方法，适用于贴壁细胞和非贴壁细胞。

摘要

细胞增殖能力对于大多数细胞的正常功能至关重要，而增殖调控失常则是许多疾病过程的核心。因此，测量细胞增殖是评估细胞功能的常用手段。细胞增殖可通过直接计数进行测量，但这种方法属于间接检测增殖。一种常见的直接检测细胞进入分裂准备状态的方法是通过掺入标记的核苷类似物。这些核苷类似物包括放射性核苷类似物 ³H-胸腺嘧啶，以及非放射性核苷类似物，如5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）。EdU的检测依赖于“点击化学”（click chemistry），相较于BrdU检测具有多项优势。在本报告中，我们提供了一种通过EdU掺入法测量细胞增殖的实验方案。该方案涵盖了多种检测方式的选择，并分别阐述了每种方法的优缺点。我们还讨论了该方案中可优化或调整的环节，以满足特定实验设计的需求。最后，我们简要介绍了如何对该基本方案进行修改，以用于检测其他细胞代谢物。

引言

细胞增殖是细胞功能的关键环节^1,2。对增殖的调控影响着发育等正常生理过程，以及癌症和心血管疾病等病理过程。例如，血管平滑肌细胞的增生性生长被认为是动脉粥样硬化的前兆³。细胞增殖的变化也用于评估新药的潜在毒性。鉴于其广泛的影响，增殖检测已成为许多基于细胞生物学的实验室中的常规实验手段。

如果目标细胞群体分裂速度较快，可以通过直接计数细胞来测量细胞增殖。对于生长较慢的细胞，细胞计数的敏感性可能较低。通常通过掺入标记的核苷类似物来测定增殖情况。尽管³H-胸苷掺入法是金标准，但由于已有更新的非放射性替代方法，许多实验室正逐渐放弃该方法。这些替代方法包括胞质荧光染料、细胞周期相关蛋白的检测，以及非放射性核苷类似物的掺入，例如5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）⁴。

胞质染料（如羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯，CFSE）可用于检测细胞增殖，因为每次细胞分裂后染料的荧光强度会减半⁵。该技术常用于非贴壁细胞的流式细胞术检测。尽管此前在贴壁细胞中应用较少，但随着新一代成像型酶标仪的出现，这一状况可能发生变化。通过基于抗体的技术（如流式细胞术、免疫组织化学等）检测细胞周期相关蛋白，通常用于组织或非贴壁细胞。这些细胞或组织在染色前必须经过固定和通透处理。核苷类似物BrdU和EdU的作用原理与³H-胸腺嘧啶类似，但避免了放射性操作的不便。BrdU的掺入可通过抗BrdU抗体进行检测，因此细胞在染色前也必须进行固定和通透处理。此外，细胞还需用DNase处理以暴露BrdU抗原表位。

通过点击化学检测 EdU 的掺入，该反应在催化铜存在下使炔基和叠氮基“点击”结合。其中任一基团均可作为生物合成掺入的分子或检测分子⁴。市面上可获得的核苷类似物通常连接有炔基。因此，在增殖检测中，使用与荧光染料或其他标记物偶联的叠氮化合物来检测带有炔基功能化的核苷类似物。与 BrdU 相比，EdU 掺入具有多项优势。首先，由于哺乳动物细胞中不存在炔基和叠氮基，该反应具有高度特异性且背景信号低⁶。由于这两个基团体积较小，细胞无需进行 DNA 变性即可暴露核苷类似物，而 BrdU 检测则需要此步骤⁷。最后，点击化学具有高度通用性，可用于 DNA、RNA、蛋白质、脂肪酸和碳水化合物的代谢标记^8,9,10,11。如果待标记的代谢目标分子位于细胞表面，则可对活细胞进行标记¹²。此外，细胞还可进一步进行免疫荧光抗体染色。

以下方案描述了利用EdU掺入和点击化学反应来检测人血管平滑肌细胞增殖的方法（图1）。我们展示了三种不同的EdU掺入检测方式，每种方法的代表性结果及其优缺点。通过点击化学反应检测增殖特别适用于贴壁生长且增殖较慢的细胞。此外，该方法能良好地保持细胞形态，同时可进行基于抗体的染色。

方案

1. 使用荧光标记检测 EdU

1. 储备液的配制
   1. 通过将 12.5 mg EdU 加入 10 mL 双蒸水（H₂O）中，配制 5 mM 的 EdU 储备液。
   2. 配制标记溶液组分：200 mM 三(3-羟丙基三唑甲基)胺（THPTA）（100 mg 溶于 1.15 mL H₂O）、100 mM CuSO₄（15.95 mg 溶于 1 mL H₂O；现配现用）、10 mM Cy3 吡啶基叠氮（1 mg 溶于 95.3 mL H₂O，分装为 5 µL 每份，于 -20 °C 保存）、以及 1 M 抗坏血酸钠（200 mg 溶于 1 mL H₂O；现配现用）。
   3. 配制浓度为 0.15 mg/mL 的刃天青储备液。过滤除菌后，将 1 mL 分装液于 4 °C 保存。
      注意：吡啶基叠氮可与多种不同荧光染料、生物素及辣根过氧化物酶（HRP）偶联。
2. 用 EdU 标记血管平滑肌细胞（VSMC）。
   注意：人源 VSMC 是通过组织外植块法从髂动脉中分离获得。当在含胰岛素、转铁蛋白和硒的无血清培养基中培养时，这些细胞表达平滑肌特异性标志物，包括平滑肌素（smoothelin）、平滑肌肌球蛋白重链（SM-MHC）和 α-平滑肌肌动蛋白（SMC αactin）¹³。
   1. 将血管平滑肌细胞以 2 × 10⁴/mL 的密度接种于 96 孔板中的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
      注意：细胞在 37 °C、含 2% 胎牛血清的平滑肌细胞培养基中培养。
   2. （可选）静置数小时至过夜以促进贴壁。向每孔加入 20 µL 刃天青储备液，在 37 °C 孵育 3 小时。使用酶标仪读取荧光信号（激发波长 560_ex，发射波长 594_em）。更换为新鲜 DMEM。
      注意：此步骤为可选。刃天青用于标准化细胞数量，以校正加样过程中孔间差异¹⁴。
   3. 在培养开始时，向每个处理组的 3−6 个孔中加入磷酸盐缓冲液（PBS）或血小板源性生长因子（PDGF）至终浓度为 30 ng/mL，并继续培养 72 小时。
   4. 将 5 mM EdU 储备液稀释至 1 mM，向每孔加入 2 µL（终浓度为 20 µM），在 72 小时培养期的最后 24 小时内进行标记。其中一组重复孔不加 EdU，用于测定背景荧光/发光信号。
      注意：培养时间和 EdU 标记时间已针对平滑肌细胞优化，但不同细胞类型可能需要调整。
3. 用多聚甲醛（PFA）固定细胞。
   1. 吸去培养基，每孔加入 150 µL 4% 多聚甲醛（溶于 PBS）于室温孵育 10 分钟。
   2. 吸去 PFA，每孔加入 150 µL 1% 聚乙二醇 tert-辛基苯基醚（TX-100）（溶于水）于室温孵育 30 分钟。
   3. 用 PBS 洗涤三次以去除 TX-100。
      警告：PFA 具有毒性，请小心操作。
      注意：本步骤可暂停。固定后的细胞可在 PBS 中于 4 °C 保存。
4. 检测掺入的 EdU。
   1. 使用前立即配制标记溶液（每块 96 孔板 10 mL，仅使用中间 60 个孔），按以下顺序将储备液组分加入 PBS 中：THPTA 20 µL、CuSO₄ 20 µL、Cy3 吡啶基叠氮 5 µL、抗坏血酸钠 100 µL，定容至总体积 10 mL。
   2. 吸去孔中 PBS，每孔加入 150 µL 标记溶液，于 37 °C 孵育 30 分钟。为同时检测所有细胞核，向每孔加入 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。使用荧光酶标仪读取信号（Cy3：激发波长 550_ex，发射波长 570_em；DAPI：激发波长 350_ex，发射波长 470_em），或在显微镜下成像。
      注意：本步骤可暂停。固定并染色后的细胞可在 PBS 中于 4 °C 保存，后续再进行成像。

2. 使用化学发光法检测 EdU

1. 完成第1.1–1.3节。
2. 配制含0.1%聚山梨酯20的Tris缓冲盐水（TBST）。
3. 封闭孔板。
   1. 向每个孔中加入150 µL封闭缓冲液（材料表），在室温下孵育90分钟。
   2. 移除封闭缓冲液，用200 µL PBS洗涤3次。
4. 检测掺入的EdU。
   1. 按照步骤1.4.1的说明配制标记溶液，用生物素吡啶基叠氮化物替代Cy3吡啶基叠氮化物。
   2. 用200 µL TBST振荡洗涤5次，每次3分钟。
   3. 加入150 µL 0.3% H₂O₂，室温孵育20分钟，以淬灭内源性过氧化物酶。
   4. 移除H₂O₂溶液，用200 µL TBST振荡洗涤5次，每次3分钟。
   5. 用TBST将链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP；1:200）稀释后，每孔加入50 µL，室温孵育1小时。
   6. 用200 µL TBST振荡洗涤5次，每次3分钟。
   7. 向每个孔中加入50 µL化学发光酶联免疫吸附测定（ELISA）底物（材料表）。
   8. 立即使用能够检测发光信号的酶标仪读数。

结果

在图2中，我们展示了三个不同实验的结果，这些实验测量了血管平滑肌细胞（VSMC）对血小板源性生长因子（PDGF）刺激的增殖反应。在为平滑肌细胞（SMC）配制的培养基中培养细胞后，我们在无血清的DMEM培养基中进行实验，以消除血清或生长因子对细胞增殖的潜在影响。在图2A中，我们比较了同一实验中使用荧光检测与化学发光检测的结果。读取这些微孔板时，我们使用了一台可检测吸光度、荧光和化学发光的多功能微孔板读数仪（见材料表）。

使用酶标仪的扫描孔模式时，荧光读数会对整个孔进行平均。该模式可减轻因孔中心与边缘差异导致的潜在不准确性。然而，如果仅有极少数细胞核呈阳性，以这种方式读取的结果在阳性细胞数量较少时可能会低估“阳性细胞数量”。此处的“数量”指的是相对于另一孔的荧光强度，而非确切的细胞数目。此外，如果存在纤维或一团死亡细胞产生荧光信号，该信号也将被纳入面积扫描范围之内。然而，使用酶标仪的主要优势在于节省时间。尽管每孔的扫描模式读数需耗时1...

讨论

EdU 掺入是一种简单直接的细胞增殖检测方法，尤其适用于贴壁细胞¹³。本实验方案使用平滑肌细胞，但同样适用于任何类型的贴壁细胞（如上皮细胞、内皮细胞等）。尽管该方案并不复杂，但其中关键的一步是配制标记溶液——试剂的添加顺序必须严格按照所列顺序进行。此外，与化学发光 Western 印迹类似，若采用发光检测法，则必须立即读取酶标板信号。

可根据需要对本实验方案的多个部分进行修改或优化。其一是 EdU 孵育时间。由于我们的目标是尽可能检测到更多的增殖细胞，因此在固定和染色前加入了持续 24 小时的 EdU 孵育。然而，这种时间设置可能同时标记了处于 S 期和 G2/M 期的细胞。若仅需标记处于 S 期的细胞，Cecchini 等人建议，即使是分裂较慢的细胞，EdU 孵育时间也不应超过 6 小时⁷。另一个可优化的部分是螯合剂的用量。炔烃-叠氮化物反应需要铜催化剂（CuSO₄）。THPTA 是一种铜螯合剂，可维持铜在必要的氧化状态。通过调整螯合剂与铜的比例，可提高炔烃-叠氮...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-乙炔基-2'-脱氧尿苷	Carbosynth	NE08701
生物素吡啶基叠氮化物	点击化学工具	1167-5
CuSO₄	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 叠氮甲基吡啶	点击化学工具	1178-1
Cytation 微孔板读数仪	Biotek
EVOS 显微镜	赛默飞世尔科技
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	216763
Na抗坏血酸	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue 固定细胞染色 Ready Probes	Invitrogen	R37606	DAPI 核染色
Odyssey封闭缓冲液	Li-Cor	927-40000	封闭缓冲液
多聚甲醛	电子显微镜服务	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
氯化钠	Sigma生命科学	S3014-5kg
链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	赛默飞世尔科技	PI137075	ELISA底物
Synergy酶标仪	Biotek
THPTA	点击化学工具	1010-100
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X-100	伯乐（Bio-Rad）	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100